一種通過分子改造前肽獲得的高表達(dá)量脂肪酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種通過分子改造前肽獲得的高表達(dá)量脂肪酶基因及其應(yīng)用，公開了一種高表達(dá)量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2)所示；1)DNA序列為SEQ?ID?NO：2所示核苷酸序列；2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。本發(fā)明具體提供的截短后的脂肪酶基因，在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)量較親本華根霉脂肪酶得到了提高，用于表達(dá)后，可顯著提高時(shí)空產(chǎn)率。
【專利說明】一種通過分子改造前肽獲得的高表達(dá)量脂肪酶基因及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種脂肪酶基因，特別是一種高表達(dá)量的脂肪酶基因，通過分子生物 學(xué)技術(shù)對脂肪酶基因序列進(jìn)行改造獲得，以實(shí)現(xiàn)脂肪酶基因在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá) 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、 酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是工業(yè) 脂肪酶的一個(gè)重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過30種根 霉脂肪酶實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。
[0003] 在脂肪酶試劑市場上，脂肪酶的工業(yè)生產(chǎn)量直接關(guān)系到市場競爭力。提高宿主 細(xì)胞中外源基因表達(dá)量的途徑主要有兩種，宿主菌方面：通過宿主菌的發(fā)酵優(yōu)化、高產(chǎn) 菌株的誘變篩選以及蛋白酶缺陷表達(dá)菌株的構(gòu)建等提商菌株對于外源蛋白的表達(dá)和分 泌；外源基因方面：通過啟動(dòng)子的選擇、密碼子優(yōu)化、融合基因的構(gòu)建、定向進(jìn)化、基因劑 量的控制等方法提高外源基因的表達(dá)和分泌水平（Shu Zheng-Yu et al.J Mol Catal B:Enzym2010, 62(1):1-8) 〇
[0004] 很多蛋白質(zhì)在體內(nèi)是以前體的形式合成的，前肽是蛋白質(zhì)N端的一段肽鏈，能夠 輔助蛋白的折疊和加工，在蛋白質(zhì)折疊成熟后，前肽則被相應(yīng)的蛋白酶識(shí)別、切除。前肽的 功能主要分為兩類，I類主要參與多肽鏈的延伸和正確折疊，如枯草桿菌素（Subtilisin)、 α水解蛋白酶（a Lytic protease)等；II類的功能主要參與蛋白在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和 定位，并不直接參與蛋白質(zhì)的折疊，如生長激素抑制素 Π (somatostatin II)、綠過氧 物酶（myeloperoxidase)等，在前肽中包含了蛋白質(zhì)分選的信息，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確分 泌。另外，前肽對成熟蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、底物選擇性等方面都有著影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，將 l，3-l，4-i3-D-葡聚糖酶的肽鏈C端截短后，其比活力提高了 4-5倍（Wen Tuan-Nan et al .Biochemistry, 2005. 44(25) :9197-9205.)。但通過截短5'端基因提高脂肪酶的表達(dá)量，目 前則無報(bào)道。
[0005] 發(fā)明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶 的華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列，實(shí)現(xiàn)了該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)中的高水平分泌表達(dá)（Yu Xiao-Wei et al.J Mol Catal B:Enzym, 2009, 57:304_311)，并且通過構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì) 粒，實(shí)現(xiàn)了該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母的組成型分泌表達(dá)。本發(fā)明以華根霉脂肪酶基因?yàn)?模板，利用分子生物學(xué)技術(shù)對前肽序列進(jìn)行剪切修飾，獲得了表達(dá)量提高的脂肪酶基因。 [0006]定義：
[0007] 氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0008] 使用氨基酸殘基的公認(rèn)IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認(rèn) IUPAC命名法。
[0009] 脂肪酶基因的命名
[0010] 親本脂肪酶基因命名為pr〇RCLC，5'端前肽序列截短后的脂肪酶基因分別為DFQ， TTG，NKS，DTE，mRCLC。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種高表達(dá)量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2) 所示；
[0012] 1)DNA序列為SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列；
[0013] 2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的 DNA分子。
[0014] 所述高表達(dá)量的脂肪酶基因通過逐級(jí)截短親本脂肪酶前肽基因序列，從而獲得在 畢赤酵母中表達(dá)量提商的脂肪酶基因序列。
[0015] 含有權(quán)利要求1所述脂肪酶基因的表達(dá)載體也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0016] 所述表達(dá)載體優(yōu)選分泌型載體。
[0017] 含有所述脂肪酶基因和/或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系/基因工程菌也為本發(fā)明要 求保護(hù)的范圍。
[0018] 所述脂肪酶基因或表達(dá)載體在酶制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0020] 華根霉脂肪酶親本基因序列為SEQ ID N0:1。
[0021] 脂肪酶表達(dá)量提高的截短基因，其特征在于對編碼親本華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶的基因 （SEQ ID N0:1)上的N端前肽序列進(jìn)行部分剪切， 獲得表達(dá)量提高的截短基因 DFQ(SEQ ID N0:2)。
[0022] SEQ ID NO: 1
[0023] 華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021 脂肪酶親本基因序列
[0024] gllcclgllg ctgglcaiaa aggttcagtc aaggcaacta atggcactga cttccaactc 60 cclcclcica tctctagccg tiglactcct ccttcccaic clgaaaccac aggtgaiccc 120 gaigccgaag cllacialai taacaagagc gtlcaatggl accaagctca cgglggcaac 180 iacacigcic Itatcaagcg tgatacigaa accgtcggig gtaigaccil ggaittgccc 240 gagaaccctc clcclaitcc igccacgtcc actgciccca gctctgatic aggigaagtt 300 gtcacagcca ctgctgcica aatcaaagag ctcactaact acgctgglgt tgctgctact 360 gcUacIgic giaglglcgl tccaggtacc aagigggacl gtaagcaaig ictcaaglat 420 giicclgalg gtaagcttat caagaccttc acllclcllc tcactgatac caaiggctu 480 alellgagaa gigatgctca aaagaccatc tatgttactt tccgtggtac taallcctlc 540 agaagcgcta ttactgacat ggtcllcacc ittactgatt atlctcctgt caagggcgcc 600 aaagtlcacg cigglllcci ttcclcatac aaccaagttg tcaaagaeta cttccccglc 660 glicaagacc aaltgaccgc Itaccctgac lataaggica tcgtcaccgg ccacictcic 720 gglgglgccc aagccllgct cgctggtatg gatctciacc aacgigaaaa gagaitaict 780 cceaagaact tgagcaicia lactgttggt igfccicglg icggiaacaa tgcattcgct 840 laclacgitg acagcaccgg aattccctic caccgtaccg tfcacaagcg tgatatcglc 900 cclcatgltc ctcclcaagc citcggtiat cllcaecccg glglcgaatc iiggalcaag 960 gaagacccig cigalgiica aalctgLacl iccaacatlg aaaccaaaca aigcagtaac 1020
[0025] ictatcgttc ctttcacctc tategctgat eaettaaeet actttggtat taacgaagga 1080 agelgutgtaa 1092
[0026] SEQ ID NO :2
[0027] 前肽序列截短的華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶基因序列 DFQ
[0028] gacttccaac tccctcctct catctctagc cgttgtactc ctccttccca tcclgaaacc 60 acagglgaic ccgatgccga agcuaciat aiiaacaaga gcgitcaatg gtaccaagci 120 cacgglggca aciacaclgc tctlalcaag cglgalactg aaaccgicgg tggialgacc 1 80 llggailtgc ccgagaaccc iccicclait cctgccacgl ccaclgclcc cagclcigal 240 icaggtgaag ttgtcacagc cactgctgct caaalcaaag agctcactaa ctacgctggi 300 gitgctgcta ctgcttactg tcgtagtgic gllccaggta ceaaglggga ctglaagcaa 360 Iglclcaagi atgUcclga tggtaagctt atcaagacct icacllclct tctcactgal 420 accaalggct itaictlgag aagtgatgci caaaagacca icialgliac lllccglggt 480 actaattcct tcagaagcgc tattactgac atggtcttca cctttactga ttattctcct 540 glcaagggcg ccaaagtica cgctgglttc clttcclcal acaaccaagt tgicaaagac 600 lacllccccg Icgltcaaga ccaattgacc gcilaccctg aclalaaggt caicgtcacc 660 ggccaclclc tcggiggtgc ccaagccltg clcgctggla tggalcicta ccaacglgaa 720 aagagallal cicccaagaa cttgagcatc tatacigttg gu glee teg igtcggtaac 780 aalgealteg ctliictacgl Igacagcacc ggaaltccct iccaccglac cgllcacaag S40 cgigaiaicg iccctcatgt iccicclcaa gccttcggtt atcltcaccc cggtgicgaa 900 Iciiggalca aggaagaccc Igclgatgit caaaictgia ctlccaacal Igaaaccaaa 960 caatgcagla actclatcgi icclilcacc iciaiegeig atcacltaac ctactttggt 1 020 attaaegaag g a a g c t g1 l I g i a a 10 4 4
[0029] 本發(fā)明還公開了一種高效表達(dá)脂肪酶的方法，逐級(jí)截短親本脂肪酶前肽基因序 列，將其克隆到表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化宿主進(jìn)行表達(dá)。
[0030] 用于表達(dá)所述脂肪酶的表達(dá)載體為pGAPKW，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGAPKW-proRCLC所需 的質(zhì)粒為pGAPK-proRCL (朱珊珊等.畢赤酵母組成型表達(dá)脂肪酶及其高通量篩選方法.微 生物學(xué)通報(bào)，2012.39(6):873-881.)和？？比91(11'〇1?(^(￥11乂丨3〇-^丨6七31.1]\1〇10&七 &1 B:Enzym, 2009, 57:304-311)〇
[0031] 用于所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母。
[0032] 本發(fā)明的有益效果：運(yùn)用分子生物學(xué)方法對華根霉脂肪酶親本基因上的N端進(jìn)行 部分剪切，提高了華根霉脂肪酶在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 為了詳細(xì)描述本發(fā)明的結(jié)果，以相應(yīng)的附圖作為參考：
[0034] 圖1巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPKW-proRCLC如圖所示。
[0035] 圖2脂肪酶產(chǎn)胞外酶活曲線。
[0036] 圖3 SDS-PAGE電泳檢測脂肪酶表達(dá)情況，37KD大小的條帶為目標(biāo)酶蛋白，條帶 1 至 7 對應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒依次為：pGAPKW-proRCLC、pGAPKW-DFQ、pGAPKW-TTG、pGAPKW-NKS、 pGAPKW-DTE、pGAPKW-mRCLC、pGAPKW。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基及試劑配方如下：
[0038] 10XYNB母液（w/v) :YNB(無氨基酸、無硫酸銨）13. 4%，過濾除菌，4°C保存；
[0039] LB 液體培養(yǎng)基（w/v) :Trypton 1 %，Yeast Extract 0· 5%，NaCl 1 %，ρΗ7· 0,
[0040] LB 固體培養(yǎng)基（w/v) :Trypton 1 %，Yeast Extract 0· 5 %，NaCl 1 %，ρΗ7· 0, Agar2%，氨節(jié)青霉素 50mg · mL-1，ρΗ7· 0 ;
[0041] YPD 培養(yǎng)基（w/v) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, Dextrose 2%。若制作平 板，貝1J另加入Agar 2%。
[0042] MD 固體培養(yǎng)基（w/v) :Dextrose 2%，lXYNB，Agar 2%。用于篩選G418 抗性時(shí)加 入G418至終濃度為0· 25mg · ml/1，即YPD-G418平板。
[0043] 實(shí)施例1 :PCR方法構(gòu)建表達(dá)脂肪酶的親本基因組成型表達(dá)質(zhì)粒。
[0044] (1)組成型啟動(dòng)子pGAP的獲得：以質(zhì)粒pGAPK-proRCL (朱珊珊等.畢赤酵母組成 型表達(dá)脂肪酶及其高通量篩選方法.微生物學(xué)通報(bào)，2012. 39(6) :873-881.)為模板，BF/ BWR為引物PCR擴(kuò)增出pGAP和S片段（pGAP-S)，該片段不含Bglll酶切位點(diǎn)，上游含有 BamHI酶切位點(diǎn)，下游含有SnaBI酶切位點(diǎn)。引物BF和BWR序列如下：
[0045] BF ：5/ -CGGATCCGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC-3 '(下劃線為 BamHI 酶切 位點(diǎn)）
[0046] BWR ：5/ ~TTACGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACC3,(下劃線為 SnaBI 酶切 位點(diǎn)）
[0047] (2)脂肪酶基因的獲得：以質(zhì)粒pPIC9K-proRCL(Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311)為模板，50bpFNEW/ProRCLCR為引物PCR擴(kuò)增出目的基因片段 proRCLC，該基因上游含有SnaBI酶切位點(diǎn)，下游含有His標(biāo)簽和Notl位點(diǎn)。
[0048] 引物和序列如下：
[0049] 50bpFNEW:5'-AAAGAAGAAGGGGTATCTCTC-3'
[0050] ProRCLCR: 5' AATTCCAGTGCGGCCGCTTA ATGATGATGATi ； AT( TG AGAAGAACCCAA ACAGCTTCCTTCGTTAATACC(下劃線為Notl酶切位點(diǎn)，加粗部分為His標(biāo)簽）
[0051] (3)組成型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：BamHI和SnaBI雙酶切片段pGAP-S，SnaBI和Notl雙 酶切基因 proRCLC，BamHI和Notl雙酶切載體pGAPK-proRCL并回收大片段，連接上述3個(gè) 片段構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pGAPKW-proRCLC。
[0052] (4)空白對照載體pGAPKW的構(gòu)建：proRCLC上游和基因中分別含有一個(gè)EcoRI位 點(diǎn)，將質(zhì)粒pGAPK-proRCL用EcoRI進(jìn)行酶切、自連接后構(gòu)成pGAPKW。
[0053] 實(shí)施例2 :PCR方法構(gòu)建表達(dá)截短脂肪酶基因的組成型表達(dá)質(zhì)粒。
[0054] 表達(dá)親本脂肪酶基因的質(zhì)粒pGAPKW-proRCLC如圖1所示。華根霉脂肪酶前肽基 因序列編碼的94個(gè)氨基酸序列。結(jié)構(gòu)預(yù)測表明氨基酸D17位至E35位為α螺旋結(jié)構(gòu)，該 結(jié)構(gòu)可能對前肽發(fā)揮分子伴侶功能具有重要作用，截去Ν端16個(gè)氨基酸（DFQ)考察前16 個(gè)氨基酸對前肽功能的影響；截去Ν端36個(gè)氨基酸（TTG)考察α螺旋結(jié)構(gòu)對前肽功能的 影響；氨基酸Ν48位是前肽上的預(yù)測糖基化位點(diǎn)之一，截去Ν端47個(gè)氨基酸（NKS)考察該 位點(diǎn)對前肽功能的影響；K66R67為Kex2蛋白酶切位點(diǎn)，截去Ν端67個(gè)氨基酸（DTE)考察 受宿主細(xì)胞加工剪切掉的67個(gè)氨基酸鏈對前肽功能的影響；完全截去前肽（mRCLC)則考察 整段前肽的作用。
[0055] 以pGAPKW-proRCLC為模板，根據(jù)proRCLC基因上前肽序列的不同部位，設(shè)計(jì)5條 上游引物（下劃線為SnaBI酶切位點(diǎn)）和1條下游引物。
[0056] DFQ F ：5/ -CATATGTACGTAGACTTCCAACTCCCTCCTCT-3 ;
[0057] TTG F ：5/ -CATATGTACGTAACCACAGGTGATCCCGATG-3 ;
[0058] NKS F：5/ -CATATGTACGTAAACAAGAGCGTTCAATGGTAC-3 ;
[0059] DTE F ：5/ -CATATGTACGTAGATACTGAAACCGTCGG-3 ;
[0060] MRCLC F ：5/ -CATATGTACGTATCTGATTCAGGTGAAGTTGTC-3;
[0061] 50bpRNEW : 5，-CCCAACTTGAACTGAGGAAC-3 '
[0062] 以DFQ F和50bpRNEW為一對引物，PCR擴(kuò)增出前肽序列截短后的脂肪酶基因片段 DFQ。
[0063] 片段DFQ PCR體系
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種高表達(dá)量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2)所示； 1. DNA序列為SEQ ID NO :2所示核苷酸序列； 2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分 子。
2. 權(quán)利要求1所述的高表達(dá)量的脂肪酶基因的獲得方法，其特征在于逐級(jí)截短親本脂 肪酶如膚基因序列，從而獲得在畢赤酵母中表達(dá)量提1?的脂肪酶基因序列。
3. 含有權(quán)利要求1所述脂肪酶基因的表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為分泌型載體。
5. 含有權(quán)利要求1所述脂肪酶基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6. 含有權(quán)利要求1所述脂肪酶基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的基因工程菌。
7. 權(quán)利要求1所述脂肪酶基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)載體在酶制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。
8. -種提高脂肪酶表達(dá)量的方法，其特征在于逐級(jí)截短親本脂肪酶前肽基因序列，將 其克隆到表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化宿主進(jìn)行表達(dá)。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體為分泌型表達(dá)載體，宿主優(yōu)選巴 斯德畢赤酵母。
10. 權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述表達(dá)載體為pGAPKW。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104099356SQ201410280742
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】喻曉蔚, 徐巖 申請人:江南大學(xué)