一種高效表達(dá)v8蛋白酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)V8蛋白酶的方法，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將融合了SUMO標(biāo)簽的V8蛋白酶基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得含有SUMO標(biāo)簽的V8蛋白酶，然后利用SUMO蛋白酶移除SUMO標(biāo)簽，獲得具有活性的V8蛋白酶。酶活可達(dá)15.5U/mg，已經(jīng)適用于重組蛋白制備和肽指紋圖譜鑒定。
【專利說明】-種高效表達(dá)V8蛋白酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)V8蛋白酶的方法，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] V8 蛋白酶（V8protease 又稱 GluV8 或Glu_c)英文名 Endoproteinase Glu_C from Staphylococcus aureus V8,屬于谷氨酰內(nèi)切酶I (EC3. 4· 21. 19)家族，是一種絲氨酸蛋白 酶，具有嚴(yán)格的底物特異性，能水解多肽鏈中谷氨酸和（或）天冬氨酸殘基的羧基形成的肽 鍵。
[0003] 目前V8蛋白酶主要來源于金黃色葡萄球菌的提取，由于金黃色葡萄球菌的致病 性，使其在生產(chǎn)和應(yīng)用上受到很大的限制。很多異源表達(dá)方法大多存在一定的不足，例如該 蛋白酶的強(qiáng)烈活性會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生傷害致使產(chǎn)量低等。
[0004] 本發(fā)明旨在用Sumo作為酶原來抑制GluC的活性，以提高GluC在大腸桿菌中的產(chǎn) 量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新型V8蛋白酶酶原，是在成熟V8蛋白酶的 N端融合SUM0標(biāo)簽形成酶原。
[0006] 所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID N0. 2所示的序列為出發(fā)序列，將第一位纈氨酸突 變?yōu)榱涟彼?、脯氨酸、賴氨酸之外的疏水氨基酸?br> [0007] 所述成熟V8蛋白酶的氨基酸序列優(yōu)選如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQID N0. 5、 SEQ ID NO. 6所示的序列。是將V8蛋白酶第1位的纈氨酸分別突變?yōu)楸彼幔ˋ)、甘氨酸 (G)、甲硫氨酸（M)或苯丙氨酸（F)。
[0008] 所述成熟V8蛋白酶還優(yōu)選在C端進(jìn)一步融合His Tag。
[0009] 所述SUMO標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ ID Ν0· 7所示。
[0010] 所述SUMO標(biāo)簽優(yōu)選在N端還添加 His標(biāo)簽和TEV酶切位點(diǎn)，得到氨基酸序列如 SEQ ID N0. 8所示的融合標(biāo)簽。
[0011] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是構(gòu)建一種高效表達(dá)所述V8蛋白酶酶原的大腸 桿菌，是將成熟V8蛋白酶基因與SUM0標(biāo)簽基因融合，形成酶原基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表 達(dá)，獲得含有SUM0標(biāo)簽的V8蛋白酶，然后利用SUM0蛋白酶移除SUM0標(biāo)簽，獲得具有活性 的V8蛋白酶。
[0012] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述大腸桿菌的方法，包括如下 步驟：
[0013] (1)人工合成優(yōu)化過的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因（簡稱V8基因）。
[0014] ⑵使用PCR方法在V8基因上下游加上與pET21-SUM0載體同源的序列，以便構(gòu)建 包含蛋白酶編碼基因的載體質(zhì)粒。
[0015] (3)使用同源重組的方法完成pET21-SUM0載體和V8基因的連接，獲得重組表達(dá)質(zhì) 粒，序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，涂板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0016] 所述重組表達(dá)質(zhì)粒還可以通過先融合SUM0標(biāo)簽和V8基因，再與載體連接獲得。
[0017] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述大腸桿菌生產(chǎn)V8蛋白酶的方法，包括如下步驟：
[0018] (1)挑取重組菌菌落轉(zhuǎn)接試管培養(yǎng)至〇D_約0. 8,添加最終濃度為ImMIPTG，誘導(dǎo) 培養(yǎng)。
[0019] (2)離心收集菌體，緩沖液重懸后破碎菌體，離心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗 脫后脫鹽，使用SUM0蛋白酶剪切SUM0標(biāo)簽，得到具有活性的V8蛋白酶。
[0020] (3)使用MonoQ、MonoS等柱子進(jìn)一步純化蛋白。
[0021] 由于V8蛋白酶對(duì)大腸桿菌的毒性，任何沒有完全抑制活性的酶原都能使大腸桿 菌死亡而不能生產(chǎn)V8蛋白酶。并且，V8蛋白酶是一個(gè)很特殊的蛋白酶，它的成熟序列的N 端靠近活性中性（圖5)，如果N端添加氨基酸，它就會(huì)伸向活性中心而顯著影響V8蛋白酶 的活性?，F(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于重組表達(dá)蛋白酶的研究主要是改造蛋白酶自身的酶原序列。Sumo 標(biāo)簽有13kd足夠大而且是個(gè)完整的球狀結(jié)構(gòu)域，當(dāng)向V8蛋白酶N端添加 Sumo標(biāo)簽時(shí)，既 能很好地抑制V8蛋白酶在宿主體內(nèi)的活性，避免對(duì)宿主造成傷害，又能通過Sumo蛋白酶將 Sumo tag完全切除不殘留一個(gè)氨基酸殘基。但Sumo tag對(duì)與之相連的酶的首位氨基酸有 選擇性，不能是V、L、P、K。
[0022] 本發(fā)明中，我們將V8蛋白酶首位的纈氨酸突變?yōu)楸彼幔ˋ)、甘氨酸（G)、甲硫氨 酸（M)、苯丙氨酸（F)，并首次與Sumo tag融合形成一種新型酶原，實(shí)現(xiàn)了 V8蛋白酶在大腸 桿菌中的高效表達(dá)，并通過后期處理獲得活性很好的V8蛋白酶，大大提高了 GluC在大腸桿 菌中的產(chǎn)量，搖瓶產(chǎn)量達(dá)到20mg/L培養(yǎng)基，酶活可達(dá)15. 5U/mg，已經(jīng)適用于重組蛋白制備 和肽指紋圖譜鑒定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :移除標(biāo)簽激活后的v8蛋白酶LC-MS檢測(cè)結(jié)果
[0024] 圖2 :V8蛋白酶酶活測(cè)定使用底物分子結(jié)構(gòu)
[0025] 圖3 :激活后的V8蛋白酶米氏常數(shù)雙倒數(shù)計(jì)算圖
[0026] 圖4 :0D值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0027] 圖5 :原始V8蛋白酶結(jié)構(gòu)
[0028] 圖6 :突變后的V8蛋白酶結(jié)構(gòu)，A :V1A突變酶，B :V1G突變酶，C :V1M突變酶，D :V1F 突變酶。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1可溶性表達(dá)V8蛋白酶的大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建和培養(yǎng)
[0030] (1)所用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因的出發(fā)核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 其編碼的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶成熟區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。SUMO標(biāo)簽的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0031] 從V8蛋白酶的3維結(jié)構(gòu)可以看出，在它成熟序列的N端增加任何氨基酸都會(huì)影響 它的活性，因此V8蛋白酶的N端不能有任何氨基酸的增加。然而，在成熟區(qū)N端添加 Sumo Tag時(shí)，Sumo Tag之后的氨基酸不能是P、K、L或V，因此，可以通過定點(diǎn)突變將GluC第1位 的氨基酸V突變?yōu)锳、G、M或F。突變后的V8蛋白酶的成熟區(qū)氨基酸序列分別如SEQ ID. 3、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 所示，結(jié)構(gòu)如圖 6 所示。
[0032] (2)對(duì)于VIA突變體，使用PCR方法在編碼突變后的V8蛋白酶的基因上下游加上 與PET21-SUM0載體同源的序列，以便構(gòu)建包含蛋白酶編碼基因的載體質(zhì)粒，其中SUM0標(biāo) 簽N端添加了 His標(biāo)簽和TEV酶切位點(diǎn)，V8蛋白酶的C端還添加了 His tag，氨基酸序列如 SEQ ID N0. 9。Sumo標(biāo)簽前的His tag在V8蛋白酶激活后被一同切除。pET21-sumo載體 來源于 pET21a(novagen)和 pET-sumo (Invitrogen)。用 PCR 從 pET-sumo 載體上獲取 sumo tag，N端再融合His Tag和TEV酶切位點(diǎn)，并將其插入pET21a載體上得到pET21a-sumo載 體。
[0033] PCR 上游引物：CACAGAGAAC AGATTGGTGG CGCCATCCTGCCGAACAACG AC
[0034] PCR 下游引物：CACCACCACC ACCACCACTG ATGAGATCCGGCTGCTAACA AAGC
[0035] PCR反應(yīng)體系如表1，反應(yīng)條件如表2
[0036] 表1V8基因 PCR體系
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種V8蛋白酶酶原，其特征在于，是在成熟V8蛋白酶的N端融合SUMO標(biāo)簽形成酶 原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID NO. 2所 示的序列為出發(fā)序列，將第一位纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?、脯氨酸、賴氨酸之外的疏水氨基酸?br> 3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶的氨基酸序列分別如 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶的C端進(jìn)一步融合His Tag〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶原，其特征在于，所述SUMO標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ IDN0. 7 所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶原，其特征在于，所述SUMO標(biāo)簽的N端還添加了 His標(biāo)簽 和TEV酶切位點(diǎn)，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示的融合標(biāo)簽。
7. 編碼權(quán)利要求1-6任一所述酶原的基因。
8. -種高效表達(dá)權(quán)利要求1-6任一所述酶原的大腸桿菌，其特征在于，是將成熟V8蛋 白酶基因與SUMO標(biāo)簽基因融合，形成酶原基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得含有SUMO標(biāo) 簽的V8蛋白酶。
9. 一種構(gòu)建權(quán)利要求8所述大腸桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 人工合成金黃色葡萄球菌V8蛋白酶基因； (2) 使用PCR方法在V8基因上下游加上與pET21-SUM0載體同源的序列，以便構(gòu)建包含 蛋白酶編碼基因的載體質(zhì)粒； (3) 使用同源重組的方法完成PET21-SUM0載體和V8基因的連接，序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)，涂板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
10. -種應(yīng)用權(quán)利要求8所述大腸桿菌生產(chǎn)V8蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 挑取重組菌培養(yǎng)； (2) 離心收集菌體，緩沖液重懸后破碎菌體，離心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗脫后 脫鹽，使用SUMO蛋白酶剪切SUMO標(biāo)簽，得到具有活性的V8蛋白酶； (3) 使用MonoQ、MonoS柱子進(jìn)一步純化蛋白。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104059898SQ201410261929
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】周小滿, 高敏奇, 吳家權(quán), 蕭國平 申請(qǐng)人:無錫佰翱得生物科學(xué)有限公司, 江陰市科里生物醫(yī)藥研究院有限公司