專利名稱：一種熱穩(wěn)定性提高的蛋白酶及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的重組角蛋白酶及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細(xì)菌、放線菌和真菌等多種微生物產(chǎn)生。羽毛作為家禽飼養(yǎng)和屠宰工業(yè)的副產(chǎn)物每年產(chǎn)量巨大，且蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富，是潛在的優(yōu)良蛋白質(zhì)資源。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對環(huán)境的污染，同時(shí)可以作為一種飼科蛋白質(zhì)應(yīng)用于畜禽的飼養(yǎng)。在傳統(tǒng)利用羽毛過程中主要采用酸堿水解。熱降解等方法，前者存在污染環(huán)境問題，后者對能源消耗比較大，且可以 破壞部分氨基酸，降低了產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。其他常見的角蛋白為動(dòng)物的毛發(fā)，如牛毛、羊毛和人發(fā)等，這類角蛋白質(zhì)部分作為商業(yè)原料進(jìn)行加工外，其余多作為廢物處理，也造成了環(huán)境的污染和蛋白資源的浪費(fèi)。角蛋白酶能使角蛋白降解為多肽和氨基酸，既可用于農(nóng)業(yè)肥料的生產(chǎn)，又可作為畜禽的飼料蛋白源；角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，其在皮膚病治療方面的研究還有待于進(jìn)一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”導(dǎo)致瘋牛病和人類克雅氏癥的毒蛋白，從而可應(yīng)用于醫(yī)療和實(shí)驗(yàn)儀器的凈化；它還可用于皮革脫毛鞣制，配制潤膚露、浴皂、洗發(fā)水和脫毛膏等美容品。擁有較差熱穩(wěn)定性的酶嚴(yán)重影響該酶在工業(yè)上的應(yīng)用，提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性在利于工業(yè)化應(yīng)用的同時(shí)有助于角蛋白酶在應(yīng)用過程中更好的滲透入底物表面并作用于底物，而且能夠減少雜菌的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的角蛋白酶。上述角蛋白酶是在GenBank accession nos. JX504681公布的基因序列基礎(chǔ)上,其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變，具體為 N122Y, N160C, A193P, N217S,其獲得方法為以 GenBank accession nos.JX504681公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，通過化學(xué)全合成或定點(diǎn)突變的方式將其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的取代。產(chǎn)所述產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟I)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼權(quán)利要求I所述蛋白酶的基因kerTB ；2)將步驟I)獲得的kerTB基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。所述表達(dá)載體優(yōu)選pMA 0911。應(yīng)用上述產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，將其斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)24h。所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖 10g/L, O. lg/L MgSO40檢測重組角蛋白酶熱穩(wěn)定性指標(biāo)(T1/2)的定義方法酶在指定溫度下酶活損失一半時(shí)所需要的時(shí)間。本發(fā)明采用定點(diǎn)突變技術(shù)將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker )基因進(jìn)行定點(diǎn)突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA 0911，轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600,經(jīng)純化驗(yàn)證得到一株可以產(chǎn)具有較好熱穩(wěn)定性角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-kerTB。該菌株表達(dá)的角蛋白酶在60°C的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。這為角蛋白酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖I :蛋白電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Protein MolecularWeight Marker) ;1 :不含質(zhì)粒的 Bacillus subtilis WB600 ;2 :含質(zhì)粒 pMA0911_ker 重組菌；3 :含質(zhì)粒pMA0911重組菌。圖2 :分子改造后重組角蛋白酶在60°C的T1/2和野生型(未改造)酶在60°C的T1/2的比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I熱穩(wěn)定性提高的角蛋白酶本發(fā)明的角蛋白酶是在GenBank accessionnos. JX504681公布的基因序列基礎(chǔ)上，其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變，具體為N122Y，N160C，A193P，N217S，可以通過化學(xué)全合成或定點(diǎn)突變的方式將其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的取代。實(shí)施例2產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌的構(gòu)建及鑒定采用化學(xué)全合成方法獲得編碼實(shí)施例I中角蛋白酶的ker基因，將其克隆到PMA0911，獲得含有kerTB基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMA 0911-kerTB。重組質(zhì)粒pMA 0911-kerTB轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600感受態(tài)細(xì)胞,得到能在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上正常生長的基因工程菌，并經(jīng)過鑒定命名為Bacillussubtilis WB600-pMA 0911-kerTB。。實(shí)施例3重組菌的酶活測定和蛋白電泳角蛋白酶酶活測定方法將發(fā)酵液離心IOmin (10000X g，4°C )取發(fā)酵上清液，吸取200uL適當(dāng)稀釋的酶液，加入300uL 0. 05mol/L gly-NaOH緩沖液(pH9. 0)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培養(yǎng)20min，加入500uL 4M TCA溶液以終止反應(yīng)。離心lOmin，吸取200uL上清液移入到新的試管中，后依此加入ImL福林酚試劑和200uL 0. 5MNa2C03后50度顯色15min?？瞻诪樵诩尤朊敢旱耐瑫r(shí)，加入500uLTCA溶液，經(jīng)過相同過程反應(yīng)的過濾清液作為空白。在660nm處檢測吸光值,根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線定義每15min內(nèi)釋放Iug酪氨酸定義為一個(gè)酶活單位。培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaClIOg ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂15g ;基本發(fā)酵培養(yǎng)基為添加葡萄糖的LB培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨IOg,酵母抽提物5g, NaCl 10g，葡萄糖IOg;培養(yǎng)方法將37°C、200rpm下培養(yǎng)過夜的種子以3%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)；以空載體作為對照，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為30kDa的蛋白條帶(見圖1)，純化后測定該重組角蛋白酶在60°C的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍(見圖2)。
可以理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種熱穩(wěn)定性提高的角蛋白酶，其特征在于在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基礎(chǔ)上，其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變，具體為N122Y, N160C,A193P, N217S。
2.一種獲得權(quán)利要求I所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank accession nos.JX504681公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將其成熟區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的取代。
3.產(chǎn)權(quán)利要求I所述產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求3所述產(chǎn)角蛋白酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼權(quán)利要求I所述蛋白酶的基因kerTB； 2)將步驟I)獲得的kerTB基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Bacillussubtilis WB600得到基因工程菌。
5.權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為PMA0911。
6.應(yīng)用權(quán)利要求4所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征在于以產(chǎn)角蛋白酶基因工程菌為生產(chǎn)菌株，斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉(zhuǎn)入已優(yōu)化的基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)24h。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于基本發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物 5g/L, NaCl 10g/L,葡萄糖 10g/L,0. lg/L MgSO4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性提高的角蛋白酶及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用定點(diǎn)突變技術(shù)將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA 0911，轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis WB600，經(jīng)純化驗(yàn)證得到一株可以產(chǎn)具有較好熱穩(wěn)定性角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisWB600-pMA 0911-kerTB，該菌株表達(dá)的角蛋白酶在60℃的T1/2為78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。這為角蛋白酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/57GK102936588SQ20121052824
公開日2013年2月20日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者陳堅(jiān), 張娟, 劉柏宏, 堵國成 申請人:江南大學(xué)