專利名稱：通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及ー種構(gòu)建Vip3類蛋白融合基因的方法及其轉(zhuǎn)入植物中構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌Bt是世界上應(yīng)用最廣泛的殺蟲微生物，它在生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)生一系列的殺蟲毒素，其中研究最為深入、應(yīng)用最多的是其殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystal Poteins, ICPs)。然而，在實(shí)際應(yīng)用中有些重要的農(nóng)作物害蟲(如小地老虎、茶尺蠖)對(duì)ICPs并不十分敏感，并且由于Bt產(chǎn)品的不合理使用，已有小菜蛾等害蟲對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(Zhao et al. , 2003 ; Griffitts et al. , 2001 )。因此,尋■找具有與ICPs不同殺蟲作用方式的蛋白，對(duì)于擴(kuò)大殺蟲譜、延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(VegetativeInsecticidal Protein, VIPs)是一種新型Bt 殺蟲蛋白，它是Bt從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期開始分泌、直至穩(wěn)定前期達(dá)到最高峰的胞外毒素。VIPs主要分為Vipl、Vip2和Vip3三種，Vipl和Vip2構(gòu)成ニ元毒素，對(duì)鞘翅目葉甲科昆蟲具有殺蟲特異性，而Vip3對(duì)鱗翅目害蟲有較廣譜的殺蟲活性(Schn印f et al.，1998)。Vip3與已知的ICPs沒有序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性(Estruch et al.，1996)，殺蟲機(jī)理也不盡相同。與ICPs蛋白晶體不同，Vip3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用。研究表明，其N端是一段信號(hào)肽序列，可以使Vip3蛋白識(shí)別并結(jié)合在敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞膜上，造成膜穿孔，通過誘發(fā)中腸細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致昆蟲死亡(Lee et al.，2006)。Vip3和廣泛使用的ICPs類Cry蛋白無(wú)交互抗性。因此，Vip3蛋白作為新的殺蟲資源在研究和應(yīng)用方面將具有巨大的潛力，可用于構(gòu)建和研制高效、廣譜的殺蟲蛋白基因來(lái)進(jìn)行抗性害蟲的有效防治。目前，Vip3轉(zhuǎn)基因 作物的研發(fā)和應(yīng)用已成為新的研究熱點(diǎn)。美國(guó)先正達(dá)(Syngenta)公司在全球最早開展了 Vip3轉(zhuǎn)基因研究，已將Vip3成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因殺蟲植物的構(gòu)建，并在棉花和玉米中首先得到應(yīng)用。2003年研制出成功表達(dá)Vip3毒蛋白的棉花品種C0T102(Artim, 2003) ;2007年培育出轉(zhuǎn)vip3a20的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162。2010年，先正達(dá)公司研制的含Vip3蛋白的棉花和玉米獲得美國(guó)環(huán)境保護(hù)署的批準(zhǔn)(Syngenta,2010)，可將其用于防治對(duì)Cry基因產(chǎn)生抗性的鱗翅目害蟲，極大地拓寬了 Bt轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲譜。現(xiàn)在，美國(guó)已開始種植含有Vip3蛋白的棉花品種和玉米雜交種。在國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)的資助下，我國(guó)也積極開展了對(duì)Vip3基因的研究與利用。浙江大學(xué)與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所等単位合作，利用國(guó)內(nèi)獲得的新型Vip3基因及其改造成果，構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組vip3與cryIA融合基因從而獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，可望實(shí)現(xiàn)對(duì)棉花、玉米、水稻等主要作物鱗翅目害蟲廣譜高抗的育種目標(biāo)。盡管如此，在轉(zhuǎn)基因作物構(gòu)建的實(shí)際操作中，仍然存在一些急需解決的技術(shù)性問題。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)単獨(dú)的vip3基因轉(zhuǎn)入植物后，所獲得的高表達(dá)Vip3蛋白的轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)上較遲緩，容易出現(xiàn)白化現(xiàn)象。這是由于在轉(zhuǎn)基因植物中直接表達(dá)Vip3蛋白后，該蛋白由于信號(hào)肽的分泌作用大量聚集并結(jié)合在植物細(xì)胞膜上并形成孔道，從而對(duì)植物細(xì)胞形成一定的損壞，影響其生長(zhǎng)發(fā)育。這樣還導(dǎo)致的另ー后果是，轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性能也不高。所用參考文獻(xiàn)具體如下盧雄斌，龔祖壩(1998)植物轉(zhuǎn)基因方法及進(jìn)展。生命科學(xué)3:125-131。劉凡，王國(guó)英，曹鳴慶(2003)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原味轉(zhuǎn)基因方法研究進(jìn)展。分子植物育種1:108-116。Artim L (2003) Petition 03 - 155 - Olp for the determination ofnon_reguJ_ated status: Lepidopteran insect protected Vip3 cotton transformationevent Cotl02 (抗鱗翅目昆蟲的Vip3轉(zhuǎn)基因棉Cotl02)。Estruch J, Warren G，Mullins M，Nye G，Craig JK (1996) Vip3, a novelBacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum ofactivities agrainst lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci U S A93: 5389 -5394. Vip3 (一種對(duì)鱗翅目昆蟲有廣譜抗性的新型蘇云金芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白；美國(guó)科學(xué)院院刊 93: 5389 - 5394. Vip3)。Griffitts SJj Whitacre LJj Stevens ED, Aroian VR (2001) Bt toxinresistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme. Science 293:860-864 (由于缺失推定的糖修飾酶而產(chǎn)生的Bt毒素抗性；科學(xué)293: 860-864)。Lee KMj Miles P，Chen JS (2006) Brush border membrane bindingproperties of Bacillus thuringiensis Vip3 toxin to Heliothis virescens andHelicoverpa zea midguts. Biochem Bioph Res Co 339: 1043-1047 (蘇云金芽抱桿菌Vip3毒素對(duì)煙蚜夜蛾和谷實(shí)夜蛾`的刷狀緣膜受體結(jié)合性質(zhì)；生化和生理研究通信339:1043-1047)。Schnepf E, Crickmore N，Van Rie J, Lereclus D, Baum J (1998) Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mo_l Biol Rev 62:775 - 806 (蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲晶體蛋白；微生物分子生物學(xué)研究62: 775 - 806)。Syngenta. EPA approves Syngenta’s VipCot cotton for natural refuge[EB/
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通過基因融合以降低蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative insecticidal protein,Vip3)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的毒性的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法I)、將ー個(gè)多肽(polypeptide)基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個(gè)氨基酸組成的連接肽連接；2 )、融合基因在植物細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白質(zhì)不集中在植物的細(xì)胞膜上。作為本發(fā)明的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法的改進(jìn)

Vip3蛋白為以下任意ー種為Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3類蛋白的任意一種；為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；為與SEQ ID NO:1具有至少70%相似性的氨基酸序列。作為本發(fā)明的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法的進(jìn)ー步改進(jìn)多肽(polypeptide)為綠色突光蛋白GFP ；綠色熒光蛋白GFP為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法的進(jìn)ー步改進(jìn)連接肽為Gly-Asp-Pro-Thr。本發(fā)明還同時(shí)提供了如上述方法制備而得的egfp_vip3融合基因，egfp_vip3融合基因?yàn)槿鏢EQ ID NO 3 (即序列表N03)所不的序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了如上述方法制備而得的vip3_egfp融合基因，vip3_egfp融合基因序列為如SEQ ID NO 4 (即序列表N04)所示的序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了如上述方法制備而得的egfp-vip3融合基因的用途將該融合基因(融合蛋白基因)轉(zhuǎn)入植物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植物。作為本發(fā)明的融合基因的用途的改進(jìn)植物為單子葉植物或雙子葉植物；單子葉植物為水稻、玉米、小麥或高粱，雙子葉植物為棉花、大豆或油菜。具體而言，本發(fā)明提供一種將ー個(gè)多肽基因序列的C端與vip3基因的N端直接相連，中間加以4個(gè)氨基酸組成的連接肽(Gly-Asp-Pr0-Thr)連接，獲得的融合基因在植物細(xì)胞中表達(dá)后不集中在植物細(xì)胞膜上。其中Vip3可以是蘇云金芽孢桿菌(Bt)營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3家族的任ー個(gè)蛋白，或者其氨基酸序列為SEQ ID NO.1和/或與SEQ ID NO.1至少70%相似性的序列；一個(gè)多肽可以是本發(fā)明實(shí)施例中提供的綠色熒光蛋白GFP(其序列為SEQ ID NO. 2和/或與SEQ ID NO. 2至少60%相似性的序列)，也可以是任意ー個(gè)多肽或蛋白質(zhì)。用本發(fā)明提供的方法獲得的融合基因，可以用多種方法轉(zhuǎn)入植物中，從而構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。這些方法可以是目前已知的，也可以是未來(lái)新開發(fā)的有效的植物轉(zhuǎn)基因的方法，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都可以利用這些方法輕易地將使用本發(fā)明提供的方法獲得的融合基因?qū)胫参镏袕亩鴺?gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)基因方法是目前較常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，即將啟動(dòng)子-編碼蛋白質(zhì)的基因片段-終止子所組成的能夠在植物中表達(dá)的表達(dá)框構(gòu)建到農(nóng)桿菌的T-DNA載體中，通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化到植物的基因組中。農(nóng)桿菌載體及其遺傳轉(zhuǎn)化方法目前技術(shù)上已經(jīng)成熟，一般的技術(shù)人員都能夠完成。表達(dá)框可以使用的啟動(dòng)子有很多，包括組成型啟動(dòng)子，例如常用的花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動(dòng)子、玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子等；也可以利用其他組織特異性的啟動(dòng)子控制目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如在植物綠色組織表達(dá)的啟動(dòng)子等。此外，這種基因的表達(dá)也可以利用表達(dá)增強(qiáng)子加強(qiáng)。如35S增強(qiáng)子，可以加強(qiáng)在其上游或者下游的目的基因的表達(dá)。一般的技術(shù)人員都可以通過試驗(yàn)比較使用不同啟動(dòng)子的效果。表達(dá)框的終止子可以是不同來(lái)源的終止子。在植物轉(zhuǎn)化過程中通常需要篩選基因來(lái)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。常用的篩選基因包括抗卡那霉素基因、抗潮霉素基因、抗除草劑基因(如抗草甘勝、抗草丁勝基因)等。Vip3蛋白是ー種新型Bt殺蟲蛋白基因。本發(fā)明所提供的Vip3融合基因在植物中過表達(dá)后所得到的融合蛋白仍然具有Vip3的殺蟲活性，但不會(huì)集中結(jié)合到受體植物細(xì)胞膜上，因此不會(huì)對(duì)受體植物細(xì)胞膜造成傷害而影響受體植物正常生長(zhǎng)發(fā)育。一般技術(shù)人員都可以實(shí)現(xiàn)任ー多肽序列與Vip3基因序列的融合，并利用融合基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。綜上所述，本發(fā)明提供了ー種vip3融合基因的構(gòu)建方法，即將一段多肽基因直接與vip3基因的N端相連接形成融合基因。這樣的融合基因在轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)的融合蛋白不集中在植物細(xì)胞膜上，因此對(duì)植物生長(zhǎng)沒有影響，且高表達(dá)Vip3融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物具有良好的抗蟲活性。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)說明。圖1 為融合基因水稻轉(zhuǎn)化載體 pCambial300-p35S_gfp _vip3 -pZmUb1-GlO 結(jié)構(gòu)示意圖。35S表示花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動(dòng)子，融合基因egfp-vip3兩側(cè)酶切位點(diǎn)分別為HindIII和KpnI, ZmUbi表示玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子,GlO為抗草甘膦基因。LB和RB分別表示載體的左右邊界。

圖2為生根培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)基因水稻植株的生長(zhǎng)情況對(duì)比圖。CK :對(duì)照，空載體(pCambial300-p35S-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；V3 :單獨(dú) vip3 (pCambial300-p35S-vip3-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；V3G :含 vip3_egfp 的(pCambial300-p35S-vip3-gfp-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；GV3 :含 egfp_vip3 融合基因的(pCambial300-p35S_gfp -vip3 -pZmUb1-GlO)轉(zhuǎn)基因株。圖3是轉(zhuǎn)基因水稻植株中GFP蛋白的檢測(cè)對(duì)比圖，將預(yù)分化好的愈傷組織取少量直接在載玻片上壓片后于激光共聚焦顯微鏡下20倍目鏡觀察；標(biāo)尺為IOiim;V3 :單獨(dú)vip3轉(zhuǎn)基因植株(不含GFP)；V3G :含 vip3_egfp 的(pCambial300-p35S-vip3-gfp-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；GV3 :含 egfp_vip3 融合基因的(pCambial300-p35S_gfp -vip3 -pZmUb1-GlO)轉(zhuǎn)
基因株。圖4 :轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲的生物測(cè)定對(duì)比圖；CK :對(duì)照，空載體(pCambial300-p35S-pZmUb1-G10)轉(zhuǎn)基因株；
V3 :單獨(dú) vip3 (pCambial300-p35S-vip3-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；V3G :含 vip3_egfp 的(pCambial300-p35S-vip3-gfp-pZmUbi_G10)轉(zhuǎn)基因株；GV3 :含 egfp_vip3 融合基因的(pCambial300-p35S_gfp -vip3 -pZmUb1-GlO)轉(zhuǎn)
基因株。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，本發(fā)明以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。實(shí)施例1、融合基因的獲得SEQ ID NO 1 為 Vip3 氨基酸序列(789aa) Genebank ABB72459.1 ；SEQ ID NO 2為 GFP 氛基酸序列(241aa) Genebank AFA52654.1。根據(jù)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的氨基酸序列所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列自行合成vip3和egfp (編碼GFP蛋白)基因(上海生エ)。利用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(gene splicing by overlap extension,簡(jiǎn)稱SOE)獲得egfp_vip3融合基因。具體如下首先第一輪PCR，以合成的egfp基因質(zhì)粒為模板，使用引物egfpPFl 5，一acg aagctt atgtct agagtgagcaag I刀ロ HindIII)矛ロ egfpPRl 5’ -tRttRRatctcccttRtacaRctcRtcc擴(kuò)增egfp基因；同時(shí)，以合成的vip3基因質(zhì)粒為模板，使用引物 Vip3PFl :5，-RRaRatccaacaatRaacaaRaataatac 和 Vip3PRl :5，-acg ggtaccctacttaatagagac (カロ KpnI)擴(kuò)增vip3基因。其中，在引物egfpPFl和Vip3PRl中分別添加HindIII和KpnI酶切位點(diǎn)(如斜體字母所示)，在引物egfpPRl和Vip3PFl中分別引入連接肽序列(如粗體帶下劃線的字母所示)。擴(kuò)增體系為總共為IOOul反應(yīng)體系。(DNA聚合酶為TAKARA公司生產(chǎn)的Primerstar高保真聚合酶，模板DNA為含有合成的目的基因的質(zhì)粒)
Primer star (DNAIul
2*GC buffer (PCR 反應(yīng)緩沖液)50ul PrimerF (I丨向引物)2ul
Primer R (反向づ丨物)2ul
clNTP mixture (dNTP 浞介物) 8ul Template DNA (模板 ON A) I ng ddH20 (雙蒸無(wú)苗水)up to I OOul擴(kuò)增程序?yàn)镾lcpi 98 *C3min
Step2 91 *C15s
Stcp3 60 °C15s
Step4 72 "Cliiiin ( egfp 擴(kuò)增為 I mill，vip3 擴(kuò)增為 2. 5m in)重復(fù)St印2-St印4, 35個(gè)循環(huán)；Step5 72°C7minStep6 16°C°o 。然后第二輪再以上述PCR產(chǎn)物為模板，以引物egfpPF和Vip3PR擴(kuò)增得egfp-vip3融合基因。所得到的egfp-vip3融合基因序列如SEQ ID NO :3所示。SEQ ID NO 3為egfp-vip3融合基因，“―”標(biāo)出的為egfp基因，“―”標(biāo)出的為vip3基因?！皑D”標(biāo)出的為連接肽的核苷酸序列。斜體標(biāo)出的為引入的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增體系等同于上述擴(kuò)增體系。擴(kuò)增程序除了 St印4的時(shí)間變?yōu)?. 5minタト，其余同上述擴(kuò)增程序。另外，作為對(duì)照，同樣用PCR方法構(gòu)建vip3_egfp融合基因，即將vip3的C端與egfp的N端以同樣的方式相連。第一輪PCR引物為egfpPF2 ^'-ggagatccaacaatgtctagagtgage /egfpPR2:5，- acg ggtacc ttacttgtacagctcg(加KpnI 位點(diǎn)，斜體)和 Vip3PF2:5，-acg aagctt atgaa caagaataatac (加 HindIII 位點(diǎn)，斜體) /Vip3PR2:5, - tgttggatctcccttaatagagacatcg ;在引物egfpPF2和vip3PR2中分別引入連接肽序列(如粗體帶下劃線的字母所示)。擴(kuò)增體系除了引物作了相應(yīng)替代外，其余同egfp-vip3融合基因的第一輪的擴(kuò)增體系，擴(kuò)增程序同egfp-vip3融合基因的第一輪的擴(kuò)增程序。備注說明斜體字體部分為酶切位點(diǎn)。第二輪PCR引物為vip3PF2和egfpPR2，所得到的vip3_egfp融合基因序列如SEQ ID NO. 4所示。擴(kuò)增體系除了引物作了相應(yīng)替代外，其余同egfp-vip3融合基因的第ニ輪的擴(kuò)增體系，擴(kuò)增程序同egfp-vip3融合基因的第二輪的擴(kuò)增程序。SEQ ID NO. 4為vip3-egfp融合基因，“—”標(biāo)出的為egfp基因，“—”標(biāo)出的為vip3基因。“―”標(biāo)出的為連接肽的核苷酸序列。斜體標(biāo)出的為引入的酶切位點(diǎn)。單獨(dú)vip3基因作為對(duì)照同樣用PCR方式在其兩端引入Hindi 11和KpnI酶切位點(diǎn)，引物為 vip3PF2 :5，- acg aagctt atgaacaagaataatac (斜體為 HindIII 位點(diǎn))和 vipSR 5’- acg ggtacc ctacttaatagagac (斜體為KpnI位點(diǎn))。擴(kuò)增體系除了引物作了相應(yīng)替代外，其余同egfp_vip3融合基因的第一輪的擴(kuò)增體系,擴(kuò)增程序同egfp_vip3融合基因的第一輪的擴(kuò)增程序。實(shí)施例2、融合基因的水稻表達(dá)載體的構(gòu)建T-DNA載體pCambial300-p35S-pZmUb1-G10 的全部DNA序列如 SEQ ID NO 5 所示。該載體包含ー個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)作為轉(zhuǎn)化的選擇基因，包含ー組HindIII和KpnI位點(diǎn)作為目的基因的克隆位點(diǎn)。將融合基因egfp-vip3和pCambial300-p35S-pZmUb1-G10載體分別都用HindIII和KpnI雙酶切消化后，各自利用凝膠電泳分離并膠回收目的片段，將載體和片段連接后獲得的新的載體稱為pCambia 1300-p35S-gfp-vip3-pZmUb1-G10。載體構(gòu)建的示意圖如圖1所示。
同時(shí)用上述相同的方法構(gòu)建作為對(duì)照的單獨(dú)vip3基因和vip3_egfp融合基因載體pCambia 1300_p35S -vip3-pZmUbi_G10和 pCambia 1300_p35S -vip3-gfp-pZmUbi_G10。實(shí)施例3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌等，1998 ;劉凡等，2003)。選取成熟飽滿的“秀水134”種子去売，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。分別取含目的基因載體pCambial300-p35S-gfp-vip3-pZmUb1-G10 和 pCambial300-p35S-vip3-gfp-pZmUbi_G10、pCambia 1300-p35S -vip3 -pZmUb1-G10 以及空載體 pCambial300-p35S-pZmUbi_G10 的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含こ酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2 3天。用無(wú)菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個(gè)月(中間繼代一次)。將篩選后生長(zhǎng)活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā)芽。2 一 3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到含有0.1mM草甘膦的生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)情況在上述實(shí)驗(yàn)過程中，觀察記錄各轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)情況，得到含egfp_vip3的轉(zhuǎn)化植株的生根率為62. 5%，明顯大于含vip3-egfp(51. 1%)和單獨(dú)vip3(52. 0%)的，但與空載體的轉(zhuǎn)化植株生根率(63. 1%)相當(dāng)。生根培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)化植株幼苗的生長(zhǎng)情況為含egfp-vip3與空載體的轉(zhuǎn)化植株對(duì)照無(wú)明顯差別，而含vip3-egfp和單獨(dú)vip3的轉(zhuǎn)化植株幼苗生長(zhǎng)明顯受到抑制(如圖2所示)。具體為無(wú)轉(zhuǎn)基因的親本野生株(CK)和含融合基因egfp-vip3的轉(zhuǎn)化株(GV3)生長(zhǎng)情況均正常,無(wú)明顯差異。而含vip3-egfp基因和單獨(dú)vip3基因的轉(zhuǎn)化株(V3G和V3)的生長(zhǎng)均受到抑制`，表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、植株矮弱甚至出現(xiàn)白化現(xiàn)象等。說明在vip3基因的N端融合GFP多肽后，會(huì)減少甚至消除vip3基因?qū)D(zhuǎn)基因植株的毒性。轉(zhuǎn)基因植株中GFP蛋白的檢測(cè)取預(yù)分化后的愈傷組織，在載玻片上直接壓片至激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光情況(圖3)，結(jié)果顯示vip3-egfp轉(zhuǎn)基因植株中綠色熒光蛋白均分布在細(xì)胞膜上，而egfp-vip3轉(zhuǎn)基因植株中綠色熒光蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中，而沒有明顯定位在細(xì)胞膜上。上述現(xiàn)象表明在vip3基因前面融合了 GFP多肽基因后(GV3)，其在植物中表達(dá)的蛋白已不集中在植物細(xì)胞膜上，這樣使Vip3蛋白對(duì)植物原本的傷害就減弱或消除了。而將GFP多肽基因融合在vip3基因后面(V3G)是為了以GFP熒光示蹤作為對(duì)照，圖片顯示綠色熒光集中在植物細(xì)胞膜上，說明表達(dá)的Vip3-GFP融合蛋白集中在植物細(xì)胞膜上。而V3是單獨(dú)vip3基因的轉(zhuǎn)基因植物的樣本照片，因?yàn)闆]有融合GFP蛋白，所以沒有熒光顯示，可以作為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因植株的生物測(cè)定取溫室培養(yǎng)7天的轉(zhuǎn)基因植株新鮮葉片，置于鋪有一層濕潤(rùn)的濾紙保濕的直徑75mm的培養(yǎng)皿中，然后每皿接入30頭棉鈴蟲初孵幼蟲。將接種后的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中25。C 12L :12D光照培養(yǎng)24h后開蓋觀察。結(jié)果顯示，含vip3_egfp和單獨(dú)vip3的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲的抗性較差，與不含vip3基因的空載體對(duì)照株比較基本無(wú)差別。而含egfp-vip3的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲的抗性明顯較高(圖4)。具體為
無(wú)轉(zhuǎn)基因的親本植株(CK)和單獨(dú)vip3轉(zhuǎn)基因植株(V3)以及vip3-egfp融合基因的轉(zhuǎn)基因植株(V3G)均被棉鈴蟲取食得較多，說明它們對(duì)棉鈴蟲幾乎沒有抗性。而egfp-vip3融合基因的轉(zhuǎn)基因植株(GV3)基本沒有受到棉鈴蟲幼蟲的取食(或傷害)，說明它對(duì)棉鈴蟲的抗性較高。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有 變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法，其特征是 1)、將一個(gè)多肽(polypeptide)基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個(gè)氨基酸組成的連接肽連接； 2 )、融合基因在植物細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白質(zhì)不集中在植物的細(xì)胞膜上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法，其特征是 所述Vip3蛋白為以下任意一種 為Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3類蛋白的任意一種； 為SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列； 為與SEQ ID NO:1具有至少70%相似性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法，其特征是 所述多肽(polypeptide)為綠色突光蛋白GFP ； 所述綠色熒光蛋白GFP為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法，其特征是 所述連接肽為Gly-Asp-Pro-Thr。
5.如權(quán)利要求廣4中任一方法制備而得的egfp-vip3融合基因，其特征是所述egfp-vip3融合基因?yàn)槿鏢EQ ID NO 3所示的序列。
6.如權(quán)利要求廣4中任一方法制備而得的vip3-egfp融合基因，其特征是所述vip3-egfp融合基因序列為如SEQ ID NO. 4所示的序列。
7.如權(quán)利要求1飛中任意一種融合基因的用途將該融合基因轉(zhuǎn)入植物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合基因的用途所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合基因的用途所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥或高粱；所述雙子葉植物為棉花、大豆或油菜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因融合降低Vip3蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因植物毒性的方法，1)、將一個(gè)多肽(polypeptide)基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個(gè)氨基酸組成的連接肽連接；2)、融合基因在植物細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白質(zhì)不集中在植物的細(xì)胞膜上。Vip3蛋白為以下任意一種為Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3類蛋白的任意一種；為SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；為與SEQ ID NO 1具有至少70%相似性的氨基酸序列。多肽(polypeptide)為綠色熒光蛋白GFP；連接肽為Gly-Asp-Pro-Thr。將本發(fā)明所得的融合基因轉(zhuǎn)入植物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植物。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103045628SQ20121052816
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者沈志成, 李京 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)