一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用，所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位上突變的突變體。該新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性好，活性高，將該酶應(yīng)用于生產(chǎn)AA-2G，提高產(chǎn)率，提高維生素C轉(zhuǎn)化率，該環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶適合AA-2G的大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用本發(fā)明的新型CGT酶，AA-2G產(chǎn)量可達(dá)170g/L，維生素C的轉(zhuǎn)化率可達(dá)55％-60％。
【專利說明】一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程與酶工程領(lǐng)域，涉及一種用于以β-環(huán)糊精、維生素C為底物合成AA-2G的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其變體，具體為衍生自Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 的 CGT 酶(cyclomaltodextringlucanotransferase)的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其變體。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素C是一種人體不能自身合成的水溶性維生素，在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用。然而，由于還原性強(qiáng)所導(dǎo)致的極不穩(wěn)定性，使得其應(yīng)用受到很大限制，因此，上世紀(jì)以來，開發(fā)既能保證維生素C的正常生理功能又具有較好穩(wěn)定性的維生素C衍生物稱為研究執(zhí)占。
[0003]2-氧-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)為維生素C的糖類衍生物，因具有以下優(yōu)點(diǎn)成為維生素C的最佳替代品:1)良好的非還原活性，在水溶液中穩(wěn)定；2)良好的耐熱性和耐光性；3)在胞內(nèi)水解生產(chǎn)維生素C和葡萄糖，具有與維生素C同等的生物活性。 [0004]目前，在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下將供體上的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到維生素C的2位C上是合成AA-2G的唯一途徑。已經(jīng)開發(fā)的用于合成AA-2G的酶有5種，其中環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)因其底物特異性特別強(qiáng)稱為合成AA-2G中使用最廣泛的酶源。
[0005]環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)是一個(gè)多功能型酶，能夠催化包括環(huán)化反應(yīng)、歧化反應(yīng)、偶合反應(yīng)以及水解反應(yīng)在內(nèi)的多種反應(yīng)。通過偶合和歧化反應(yīng)，CGT酶能夠催化供體如淀粉或環(huán)糊精上的低聚糖轉(zhuǎn)移至受體分子例如維生素C，顯著提高受體分子的功能性、水溶性和穩(wěn)定性。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中使用CGT酶生產(chǎn)AA-2G的主要問題在于:I)酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性較差，不適合AA-2G的生產(chǎn)；2)轉(zhuǎn)化率不高，較低的產(chǎn)量限制了 AA-2G的大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用，使環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性更好，活性高，將該酶應(yīng)用于生產(chǎn)AA-2G，提高產(chǎn)率，提高維生素C轉(zhuǎn)化率，使該環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶適合AA-2G的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下:
[0009]一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1_5個(gè)的氨基酸殘基置換的突變體。
[0010]所述突變?yōu)閷?5位的甘氨酸置換為丙氨酸、77位的苯丙氨酸置換為亮氨酸、121位的甘氨酸置換為纈氨酸、331位的亮氨酸置換為異亮氨酸、543位的蘇氨酸置換為酪氨酸、604位的天冬酰胺置換為甘氨酸以及615位的苯丙氨酸置換為丙氨酸。
[0011]SEQ ID NO:2 所不氨基酸序列為 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株的CGT酶的氨基酸序列。[0012]根據(jù)本發(fā)明所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選的是，所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18 所示的氨基酸序列。
[0013]根據(jù)本發(fā)明所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0014]本發(fā)明還提供一種編碼所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17 所示。
[0015]本發(fā)明還提供一種編碼所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3 所示。
[0016]本發(fā)明還提供一種制備所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括如下步驟:提取和擴(kuò)增編碼野生型CGT酶的DNA序列，利用易錯(cuò)PCR、定向進(jìn)化技術(shù)建立突變文庫，經(jīng)篩選，獲得所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0017]本發(fā)明還提供一種所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用。
[0018]根據(jù)本發(fā)明所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用，所述在制備2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用為將β -環(huán)糊精與抗壞血酸溶于水中，調(diào)節(jié)PH為5-7，加入所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，在溫度30_60°C反應(yīng)，終止反應(yīng)，經(jīng)分離純化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。
[0019]所述在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用中將β _環(huán)糊精與抗壞血酸溶于水中，優(yōu)選調(diào)節(jié) pH為5.5-6.0。
[0020]所述在制備2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用中，優(yōu)選反應(yīng)溫度37-55。。。
[0021]發(fā)明詳述:
[0022]本發(fā)明提供了一種新的聞活性和聞穩(wěn)定性的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)。所述 CGT 酶衍生自 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 的 CGT 酶(eyelomaltodextringlucan otransferase),具有如 SEQ ID 顯:4、6、8、10、12、14、16、18,優(yōu)選SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0023]在本發(fā)明的另一方面，提供用于編碼上述CGT酶的DNA分子，所述DNA分子具有如SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、17，優(yōu)選 SEQ ID NO:3 所示的核苷酸序列。
[0024]本發(fā)明提供上述CGT酶的若干變體。所述變體具有1-5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基置換，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、18所示。此外，還提供了用于編碼這些變體的 DNA 序列，如 SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、17 所示。
[0025]為了獲得上述CGT酶及其變體，本發(fā)明技術(shù)方案為:
[0026]從編碼野生型CGT酶的核苷酸序列出發(fā)，利用定向進(jìn)化技術(shù)建立突變文庫，然后進(jìn)行高通量篩選，從而最終獲得酶活性和/或穩(wěn)定性顯著增加的突變體。
[0027]所述野生型CGT 酶來自 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株。
[0028]編碼野生型CGT酶的DNA片段通過設(shè)計(jì)引物從Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l菌株的基因組PCR擴(kuò)增獲得。
[0029]所述定向進(jìn)化技術(shù)包括但不限于隨機(jī)突變。獲得的含有突變的DNA片段通過酶切連接到PET載體上，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株進(jìn)行表達(dá)。[0030]所述高通量篩選中，酶活性的測定使用甲基橙法:誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體，然后加入適量反應(yīng)混合液(2%的可溶性淀粉，50mM KH2P04-Na2HP04緩沖液，pH6.0)，50°C反應(yīng)IOmin后，加入鹽酸溶液終止反應(yīng)，離心，取上清加入甲基橙顯色，使用分光光度計(jì)在505nm處測定吸光值。定義該條件下每分鐘生成I μ mol α -環(huán)糊精所需的酶量為一個(gè)酶活單位⑶。
[0031]突變體的編碼DNA序列通過測序獲得。
[0032]通過上述方法，獲得了一種新型CGT酶，其活性高達(dá)野生型CGT酶的2_3倍。還獲得了該新型CGT酶的若干變體，變體的活性相比野生型CGT酶也有所增加。
[0033]與野生型CGT酶序列相比，本發(fā)明新型CGT酶及其變體的序列包含以下一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn):55位丙氨酸替代甘氨酸、77位亮氨酸替代苯丙氨酸、121位纈氨酸替代甘氨酸、331位異亮氨酸替代亮氨酸、543位酪氨酸替代蘇氨酸、604位甘氨酸替代天冬酰胺以及615位丙氨酸替代苯丙氨酸突變。
[0034]本發(fā)明還提供一種所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用。
[0035]根據(jù)本發(fā)明所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用，所述在制備2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用為將β -環(huán)糊精與抗壞血酸溶于水中，調(diào)節(jié)PH為5-7，加入所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，在溫度30_60°C反應(yīng)，終止反應(yīng)，經(jīng)分離純化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。 [0036]本發(fā)明提供上述CGT酶及其變體用于以β -環(huán)糊精、維生素C為底物合成AA-2G的用途。其中，反應(yīng)條件為:ρΗ5-7，溫度30-60°C。
[0037]SEQ ID NO:1 為編碼來源于 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株的野生型 CGT 酶的核苷酸序列。SEQ ID NO:2 為來源于 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l菌株的野生型CGT酶的氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO:3為編碼本發(fā)明新型CGT酶的核苷酸序列。SEQ ID NO:4為本發(fā)明新型CGT酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:5為發(fā)明新型CGT酶編碼變體I的核苷酸序列。SEQ IDNO:6為本發(fā)明新型CGT酶變體I的氨基酸序列。SEQ ID NO:7為發(fā)明新型CGT酶編碼變體2的核苷酸序列。SEQ ID NO:8為本發(fā)明新型CGT酶變體2的氨基酸序列。SEQ ID NO:9為發(fā)明新型CGT酶編碼變體3的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10為本發(fā)明新型CGT酶變體3的氨基酸序列。SEQ IDN0:11為發(fā)明新型CGT酶編碼變體4的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12為本發(fā)明新型CGT酶變體4的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13為發(fā)明新型CGT酶編碼變體5的核苷酸序列。SEQ ID NO: 14為本發(fā)明新型CGT酶變體5的氨基酸序列。SEQ ID NO: 15為發(fā)明新型CGT酶編碼變體6的核苷酸序列。SEQ ID NO: 16為本發(fā)明新型CGT酶變體6的氨基酸序列。SEQ ID NO: 17為發(fā)明新型CGT酶編碼變體7的核苷酸序列。SEQ ID NO: 18為本發(fā)明新型CGT酶變體7的氨基酸序列。
[0039]本發(fā)明中概念術(shù)語解釋:
[0040]術(shù)語“變體”多肽或多核苷酸在本文中是指由于在親本序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入、缺失和/或置換而與“親本”多肽或多核苷酸序列在氨基酸或核苷酸序列上不同的分子。變體多肽或多核苷酸具有與親本多肽或多核苷酸類似或相同的功能。變體多肽具有與親本多肽類似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一種:具有同一性為至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%和至少約98 %中的一種或多種和/或被保守取代的氨基酸序列的多肽。變體多核苷酸具有與親本多核苷酸類似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一種:(i)變體核苷酸序列編碼的多肽與親本多肽具有至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%和至少約98%中的一種或多種的同一性；或(ii)變體多核苷酸序列在如本文中定義的嚴(yán)格條件下與親本多核苷酸序列雜交。
[0041]本發(fā)明中Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株:木聚糖降解嗜熱菌，嗜熱菌，極端微生物的一種。在工業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】嗜熱菌是很好的基因來源菌種。本發(fā)明中 Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-1l 菌株 CGT 基因序列來源于 NCBI 數(shù)據(jù)庫公開(Sequence ID:ref | YP_004470341.11)，經(jīng)由中美泰和公司全基因合成而來。
[0042]本發(fā)明中菌株大腸桿菌BL21(DE3)購買自全式金公司。
[0043]本發(fā)明中的LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.4。
[0044]本發(fā)明采用的易錯(cuò)PCR技術(shù):易錯(cuò)PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴(kuò)增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。
[0045]本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基(Na2HPO4 6g/L ；KH2PO4 3g/L ； (NH4) 2S04
2.24g/L ；NaCl 0.5g/L ；MgS04.7H20 0.246g/L ;葡萄糖 2g/L ;)，補(bǔ)料為 60%葡萄糖，氨水調(diào)節(jié)pH。發(fā)酵培養(yǎng)控溫37°C，pH6.5 ;培養(yǎng)8h時(shí)溶氧突變，0D20,開始補(bǔ)料。0D30誘導(dǎo)，IPTG終濃度ImM，誘導(dǎo)溫度控至25°C，pH7.0。培養(yǎng)2Ih時(shí)放罐。
[0046]本發(fā)明采用的篩選:易錯(cuò)PCR產(chǎn)物通過基因工程構(gòu)建方式最終轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)菌株中。平板生長單克隆。通過挑取不同單克隆誘導(dǎo)表達(dá)的方式確定正向突變菌株，將酶活提升的菌株送測序確定突變位點(diǎn)。
[0047]應(yīng)用本發(fā)明的新型CGT酶，AA-2G產(chǎn)量可達(dá)170g/L，維生素C的轉(zhuǎn)化率可達(dá)55% -60%。轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方式為:用實(shí)際生成的AA-2G的質(zhì)量比上初始反應(yīng)投入的Vc質(zhì)量對(duì)應(yīng)的理論AA-2G產(chǎn)量。
[0048]本發(fā)明的有益技術(shù)效果:
[0049]本發(fā)明提供的一種新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用，該新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性好，活性高，將該酶應(yīng)用于生產(chǎn)AA-2G，提高產(chǎn)率，提高維生素C轉(zhuǎn)化率，該環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶適合AA-2G的大規(guī)模生產(chǎn)。利用本發(fā)明的新型CGT酶，AA-2G產(chǎn)量可達(dá)170g/L，維生素C的轉(zhuǎn)化率可達(dá)55% -60%。
【具體實(shí)施方式】
[0050]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0051] 本實(shí)施例涉及的實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑:如下表
[0052]表1
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征是:所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1_5個(gè)的氨基酸殘基置換的突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征是:所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18 所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征是:所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
4.一種編碼權(quán)利要求2所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ IDΝΟ:3、5、7、9、11、13、15、17 所示。
5.一種編碼權(quán)利要求3所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ IDNO:3所示。
6.一種制備權(quán)利要求1-3所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括如下步驟:提取和擴(kuò)增編碼野生型CGT酶的DNA序列，利用易錯(cuò)PCR、定向進(jìn)化技術(shù)建立突變文庫，經(jīng)篩選，獲得所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。
7.—種權(quán)利要求1-3所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用，其特征是:所述在制備2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應(yīng)用為將β -環(huán)糊精與抗壞血酸溶于水中，調(diào)節(jié)PH為5-7，加入所述新型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，在溫度30_60°C反應(yīng)，終止反應(yīng)，經(jīng)分離純化得到2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK104017784SQ201410236224
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】邢將軍 申請(qǐng)人:江蘇誠信制藥有限公司