一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，建立了一種改進(jìn)的微滴PCR高通量的擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)方法和試劑方面進(jìn)行了改進(jìn)，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了一些實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，對(duì)試驗(yàn)中需要的儀器進(jìn)行了國(guó)產(chǎn)化，使該方法更容易進(jìn)行，大大減少了人力、物力和財(cái)力的需求，使得微滴PCR技術(shù)可為一般實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員掌握，可在國(guó)內(nèi)大多數(shù)生物實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰可靠，本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量目標(biāo)DNA分子同時(shí)進(jìn)行高通量的擴(kuò)增來(lái)達(dá)到高通量定性檢測(cè)的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及對(duì)一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)生物基因定性、定量PCR檢測(cè)技術(shù)每次只能對(duì)單一一種的基因進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)于基因成分不明確的樣品，需要通過(guò)多種檢測(cè)方法、進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)才能確定，周期長(zhǎng)、工作量大，且成本高。因此，在未來(lái)的生物基因檢測(cè)中，這種檢測(cè)技術(shù)已越來(lái)越不能勝任一次處理含有幾種、十幾種、幾十種生物基因的樣品檢測(cè)的特殊需要，尤其是大數(shù)量的生物樣品，需要更有效的、快速的高通量檢測(cè)方法。雖然多重常規(guī)PCR、定量PCR能一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)幾種基因，但在同一反應(yīng)管中進(jìn)行多重PCR效果常常很差，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，短的片段經(jīng)常會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，在同源區(qū)的重組常會(huì)產(chǎn)生人工片段。其關(guān)鍵是引物的設(shè)計(jì)，引物和引物之間，引物本身，產(chǎn)物和產(chǎn)物之間不能有錯(cuò)配，復(fù)雜的多重PCR引物設(shè)計(jì)必須依賴(lài)于較為大型的數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)模擬PCR結(jié)果，以及后期的驗(yàn)證，這個(gè)不是一般小型實(shí)驗(yàn)室可以完成的事情。 [0003]目前國(guó)內(nèi)外一些機(jī)構(gòu)及公司開(kāi)展了高通量檢測(cè)方法的研究，如Bio-Rad公司、SGS檢測(cè)機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)了一些轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試劑盒等以及已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床研究的基因芯片技術(shù)。然而這些檢測(cè)方法成本非常高，技術(shù)復(fù)雜、人員要求高并且需要昂貴的儀器來(lái)完成。目前國(guó)內(nèi)外的生物基因產(chǎn)品檢測(cè)方法仍以單一的定性、定量PCR的檢測(cè)方法為主。
[0004]微滴PCRUicrodroplet PCR)技術(shù)是一種在乳化劑中進(jìn)行的新型高效的高通量核酸DNA分子擴(kuò)增技術(shù)。一般在微滴PCR中，單個(gè)DNA分子被分配到體積極小(0.5fl到0.5nl的體積)的微滴中，這允許在I微升的乳化劑中形成大約IO7個(gè)反應(yīng)平行進(jìn)行擴(kuò)增，消除了復(fù)合PCR的固有缺陷。提高了目標(biāo)擴(kuò)增的通量，同時(shí)減少了試劑和樣品的消耗。傳統(tǒng)的微滴PCR方法比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)要求太嚴(yán)謹(jǐn)、使用的試劑較多，需要的儀器較多且大多為進(jìn)口。
[0005]傳統(tǒng)的微滴PCR實(shí)驗(yàn)中，破乳過(guò)程用的是乙醚法。將PCR產(chǎn)物離心吸出油相后，每管加入1ml水飽和乙醚,潤(rùn)旋振蕩,室溫13000rpm離心5min,去上層油相，重復(fù)2-3次該步驟，用真空裝置 Vacuum centrifuge (Concentrator5301; Eppendorf)真空抽去乙醚，再進(jìn)行檢測(cè)。乙醚抽提對(duì)PCR產(chǎn)物的損耗較大，影響PCR產(chǎn)物的收集。而且乙醚具有危險(xiǎn)性，大量吸入乙醚后可導(dǎo)致頭暈、頭痛等癥狀,遇明火易爆炸,用真空離心裝置Vacuum centrifuge真空抽去乙醚增加實(shí)驗(yàn)儀器的需求,提高了實(shí)驗(yàn)的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，將微滴復(fù)合PCR擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)組合應(yīng)用于產(chǎn)物檢測(cè)，可以極大地提高核酸DNA分子分析的通量，作為生物學(xué)研究中高通量DNA分子分析的一種手段，可對(duì)多個(gè)DNA分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，提高了分析的通量，減少了寶貴樣品和試劑的消耗。
[0007]本發(fā)明所述的一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，是將油相和PCR反應(yīng)體系的水相混合在一起，利用“油包水”的乳化技術(shù)將PCR反應(yīng)體系分隔成IO9的獨(dú)立微滴，每個(gè)微滴含有一個(gè)或二個(gè)模板和引物，每個(gè)微滴代表一個(gè)反應(yīng)，這些反應(yīng)可以在相同的條件下平行地進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行多重PCR;由于每個(gè)不同品系的轉(zhuǎn)基因的PCR產(chǎn)物片段序列或長(zhǎng)度有差異，通過(guò)微滴PCR進(jìn)行擴(kuò)增，不同的PCR產(chǎn)物片段序列或大小有差異，進(jìn)而可以通過(guò)變性梯度凝膠電泳(DGGE)對(duì)生物基因進(jìn)行定性檢測(cè)；由于同一個(gè)PCR管中的多種不同生物基因擴(kuò)增的產(chǎn)物不同，因此可以同時(shí)檢測(cè)多種生物基因，進(jìn)而可以進(jìn)行高通量檢測(cè)。
[0008]具體來(lái)講，本發(fā)明所述的一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0009]第一步，針對(duì)待測(cè)生物樣品的DNA序列分別設(shè)計(jì)PCR特異性引物(包括上游引物或下游引物)，要求各對(duì)引物Tm值要相近、各目標(biāo)片段的長(zhǎng)度分別要盡可能相近，從而有利于在等同的PCR參數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，引物長(zhǎng)度一般在20-25bp之間，擴(kuò)增的目的片段大小在200-250bp之間。本發(fā)明針對(duì)如下四種轉(zhuǎn)基因玉米(Btll、M0N863、TC1507、NK603)設(shè)計(jì)的特定引物如表1所示。
[0010]表1
【權(quán)利要求】
1.一種多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，針對(duì)待測(cè)生物樣品分別設(shè)計(jì)PCR特異性引物對(duì)； 第二步，使用上述特異性引物對(duì)在水油乳化劑中對(duì)相應(yīng)的DNA模板進(jìn)行微滴PCR擴(kuò)增； 所述水油乳化劑具體配制方法為:25°C下，取I體積份的微滴PCR水相，以6秒/滴的滴速，勻速滴入到2體積份的微滴PCR油相中，混合后形成均勻的水油乳化劑，其包含大小不等的微滴；所述水油乳化劑中微滴的直徑為I~8 μ m，每微升的水油乳化劑包含3X IO6到IXlO7個(gè)微滴； 第三步，PCR產(chǎn)物分離及純化:收集微滴PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物之后，經(jīng)離心，取下層水相，清潔PCR產(chǎn)物或者直接進(jìn)行相應(yīng)的產(chǎn)物分析； 第四步，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，使用變性梯度凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)生物樣品和對(duì)應(yīng)的特異性引物對(duì)如下所示:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，其特征在于，所述微滴PCR水相組成為:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，其特征在于，所述微滴PCR油相各組分的體積百分比為:司盤(pán)804.5%，吐溫800.4%，曲拉通Χ-1000.05%，石蠟油 95.05%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重微滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的生物基因高通量定性檢測(cè)方法，其特征在于，第三步中，使用Anygen AxyPrep PCR清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966333SQ201410215717
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】趙凱, 施偉, 趙笑, 唐雪明, 任方方, 吳洋洋, 胡瑞麗, 劉華, 史斌, 宋美萱, 趙斌安, 潘磊 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院