生產(chǎn)香紫蘇醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，所述方法包括使具有香紫蘇醇合酶活性的特定多肽與焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯(LPP)接觸。具體而言，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以生產(chǎn)香紫蘇醇，這是一種在香料和調(diào)味料領(lǐng)域非常有用的化合物。本發(fā)明還提供在該方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快樂鼠尾草(Salvia?sclarea)并編碼本發(fā)明多肽的核酸，含所述核酸的表達(dá)載體，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏同一核酸的非人生物體或細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。
【專利說(shuō)明】生產(chǎn)香紫蘇醇的方法
[0001]本發(fā)明是2009年I月26日申請(qǐng)的發(fā)明名稱為“生產(chǎn)香紫蘇醇的方法”的第200980102859.0號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，所述方法包括使具有香紫蘇醇合酶活性的特定多肽與焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯(LPP)接觸。具體而言，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以生產(chǎn)香紫蘇醇，這是一種在香料和調(diào)味料領(lǐng)域非常有用的化合物。本發(fā)明還提供在該方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快樂鼠尾草并編碼本發(fā)明多肽的核酸，含所述核酸的表達(dá)載體，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏同一核酸的非人生物體或細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。
【背景技術(shù)】
[0003]香紫蘇醇是類萜或萜家族中的一員，其包含高含量的天然產(chǎn)物。萜見于大多數(shù)生物體(微生物、動(dòng)物和植物)。這些化合物由稱為異戊二烯的五碳單元構(gòu)成，并由其結(jié)構(gòu)中存在的這些單元的數(shù)目來(lái)劃分。因此，單萜、倍半萜和二萜分別為含10、15和20個(gè)碳原子的職。二職 例如可廣泛見于植物界，并且已描述了超過(guò)2500種的二職構(gòu)造(Connolly andHill, Dict1nary of terpenoids, 1991, Chapman & Hall, London)。職分子由于其風(fēng)味和香味特性以及其化妝、醫(yī)藥和抗微生物效果，一直是數(shù)千年來(lái)的興趣所在。由例如蒸汽蒸餾或溶劑提取等各種手段獲得的植物提取物被用于萜的來(lái)源。萜分子通常原樣使用，但在某些情況下利用化學(xué)反應(yīng)來(lái)將萜轉(zhuǎn)化為其他高價(jià)值分子。
[0004]萜的生物合成生產(chǎn)涉及被稱為萜合酶的酶。這些酶將前體轉(zhuǎn)化為一種或多種萜產(chǎn)物。通常，該前體是非環(huán)狀萜前體，特別地，大多數(shù)二萜合酶對(duì)非環(huán)狀前體焦磷酸香葉基香葉酯的環(huán)化起催化作用。然而，在某些特殊情況下，萜合酶催化由已環(huán)化分子至一種或多種萜產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變。
[0005]自然界存在兩種類型的環(huán)化機(jī)理，它們與可分為I類二萜合酶和II類二萜合酶的兩種類型的二職合酶有關(guān)(Wendt and Schulz, 1998, Structure.6(2):127-33)。對(duì)于某些二萜來(lái)說(shuō)，其環(huán)化機(jī)理與單萜和倍半萜的環(huán)化機(jī)理類似，其自GGPP的焦磷酸酯的酯官能的離子化起始，接著是所得碳陽(yáng)離子與內(nèi)部雙鍵的反應(yīng)。催化這種類型環(huán)化的二萜合酶為I類二萜合酶。二萜的生物合成中由II類二萜合酶催化的第二種環(huán)化模式由GGPP的端末雙鍵的質(zhì)子化起始，并在內(nèi)部重排和質(zhì)子消除之后，產(chǎn)生環(huán)狀二萜焦磷酸酯中間體。
[0006]編碼來(lái)自兩類中每種二萜合酶的基因和cDNA已被克隆出，并且重組酶也已鑒定。編碼不同類型二萜合酶的基因的可獲性為酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)提供了信息。某些氨基酸基序在二萜合酶中保留下來(lái)，并且要么與依賴質(zhì)子化的環(huán)化相關(guān)，要么與依賴離子化的環(huán)化相關(guān)。DDxxD基序見于一些I類二萜合酶。所述基序很可能參與焦磷酸酯部分的連接和離子化。在II類合酶中發(fā)現(xiàn)了保守的DxDD，其中涉及第二天冬氨酸殘基作為質(zhì)子供體。
[0007]香紫蘇醇是天然產(chǎn)生的二萜分子，其廣泛用作用于合成帶有龍涎香香調(diào)的芳香分子的起始材料。開發(fā)這類合成用于提供龍涎香——由抹香鯨的腸分泌的一種蠟狀物質(zhì)一的代用品。龍涎香由于其令人愉快的氣味而備受賞識(shí)，并且在歷史上已被用作加香成分。由于龍涎香高昂的價(jià)格以及日益增長(zhǎng)的需求，并且特別是由于對(duì)鯨類的保護(hù)，已經(jīng)開
發(fā)了帶有龍涎香特征的龍涎香成分和分子的化學(xué)合成。在這些分子中，Ambroxlil (瑞士
Firmenich SA的注冊(cè)商標(biāo))是最受大多數(shù)人賞識(shí)的龍涎香的代用品。用rAmbrOXK合成
的最廣泛使用的起始材料是二萜二醇香紫蘇醇。
[0008]通常，植物天然提取物的價(jià)格和可獲性取決于該植物的豐度、油的收率以及地理來(lái)源。此外，天然提取物的可獲性和品質(zhì)極大地依賴于導(dǎo)致每年差異化的氣候和其他地區(qū)條件，使得在某些年份在高品質(zhì)香料中使用這些成分非常困難，甚至于不可能。因此，提供極少受可獲性和品質(zhì)的波動(dòng)影響的香紫蘇醇來(lái)源是有利的。但是，考慮到其高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，制備香紫蘇醇的經(jīng)濟(jì)的合成方法依舊是困難的。由此，能夠合成香紫蘇醇的生物化學(xué)路徑將引起極大的興趣。
[0009]在植物和其他生物體中進(jìn)行的萜的生物合成早已廣泛研究，在此不贅述，但可參考Dewick，Nat.Prod.Rep., 2002, 19，181-222，其回顧了萜的生物合成路徑的現(xiàn)有技術(shù)狀況。
[0010]一些二萜合酶早已被鑒定出。具體而言，US7，238，514公開了若干二萜合酶，編碼它們的核酸，以及單細(xì)胞生物體，其經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)這些合酶中的每一種連同GGPP合酶，由此在體內(nèi)生產(chǎn)二萜。盡管如此，在該專利中并未具體公開如本文所提供的使用具有香紫蘇醇合酶活性的多肽來(lái)進(jìn)行香紫蘇醇的生物合成的方法。在該專利中公開的氨基酸和核苷酸序列與本發(fā)明的序列極為不同。在該文獻(xiàn)中描述的二萜合酶中，與本發(fā)明的多肽最接近的為用于對(duì)映體貝殼杉烯(ent-kaurene)合酶的黃瓜(Cucumis sativus)mRNA,在US7, 238，514中標(biāo)識(shí)為SEQ ID NO:389,以及用于對(duì)映體貝殼杉烯合酶B的筍瓜(Cucurbitamaxima)mRNA，在 US7, 238，514 中標(biāo)識(shí)為 SEQ ID NO:395，其編號(hào)為 AAB39482.1。這些多肽與本發(fā)明的多肽僅有32%的同一性。此外，在該現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中沒有暗示所描述的二萜合酶能用于生產(chǎn)香紫蘇醇。
[0011]與本發(fā)明的序列具有一定百分比的序列同一性的萜合酶還見于序列數(shù)據(jù)庫(kù)。盡管如此，已知的二萜合酶與本發(fā)明的多肽之間的同一性百分比非常低。與本發(fā)明最接近的合酶為與本發(fā)明的多肽具有36%同一性的不確定功能的類萜環(huán)化酶(編號(hào)為NCBIAAS98912)，與本發(fā)明的多肽具有32%同一性的黃瓜(Cucumis sativus)的對(duì)映體貝殼杉烯合酶(編號(hào)BAB19275)，與本發(fā)明的多肽具有32%同一性的來(lái)自水稻(Oryzasativa)的對(duì)映體咖薩二烯(ent-cassadiene)合酶(編號(hào) ABH10734,公布于 Xu, Wilderman, Morrone，Xuj Roy, Margis-Pinheiroj Upadhyayaj Coates and Peters, Funct1nal characterizat1nof the rice kaurene synthase-like gene family, Phytochemistry, 68(3)，2007，312-326)以及與本發(fā)明的多肽具有32%同一性的來(lái)自水稻(Oryza sativa)的對(duì)映體貝殼杉烯合酶(編號(hào) AAQ72559，公布于 Margis-Pinheiro，Zhou, Zhuj Dennis and Upadhyayaj Isolat1nand characterizat1n of a DS-tagged rice (Oryza sativa L.)GA-responsive dwarfmutant defective in an early step of the gibberellins b1synthesis pathway, PlantCell R ep.，23(12)，2005，819-833)。在該現(xiàn)有技術(shù)中從未提及這些序列中的任一種具有催化香紫蘇醇生產(chǎn)的潛在能力。[0012]除序列本身之間的區(qū)別外，還需要指出的是，對(duì)映體貝殼杉烯和對(duì)映體咖薩二烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與香紫蘇醇極為不同。具體而言，對(duì)映體貝殼杉烯是一種三環(huán)二萜，其不含任何醇官能團(tuán)，這與香紫蘇醇不同，后者為雙環(huán)二醇。此外，對(duì)映體貝殼杉烯為用于調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的植物激素的前體，其在香料和調(diào)味料領(lǐng)域中沒有任何用途，而如上所述，香紫蘇醇在這些【技術(shù)領(lǐng)域】中備受關(guān)注。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)的一篇文獻(xiàn)與香紫蘇醇合酶特別相關(guān)(Banthorpe, Brown andMorris, Partial purificat1n of farnesyl pyrophosphate:Drimenol cyclase andgeranylgeranyl pyrophosphate: Sclareol cyclase, using cell culture as a source of material, Phytochemistry31, 1992，3391-3395)。在該文獻(xiàn)中，一種來(lái)自粘毛煙草(Nicotianaglutinosa)的部分純化的蛋白質(zhì)被鑒定為香紫蘇醇合酶,但是對(duì)于該蛋白質(zhì)的氨基酸序列、編碼它的核酸的核苷酸序列以及該蛋白質(zhì)在香紫蘇醇的體外或體內(nèi)生物合成的方法中的用途沒有給出任何啟示。
[0014]盡管對(duì)于萜的環(huán)化進(jìn)行了深入的研究，但尤其是在植物中該酶的分離和鑒定依舊十分困難，這是由于它們的低豐度，瞬時(shí)表達(dá)模式，將它們從組織(它們?cè)谠摻M織中表達(dá))中的樹脂和酚化合物的混合物中純化出來(lái)的復(fù)雜性高。
[0015]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如上所述以經(jīng)濟(jì)的方式制造香紫蘇醇的方法。因此，本發(fā)明的目的是生產(chǎn)二萜同時(shí)具有很少的浪費(fèi)，這是一種更加節(jié)能并且節(jié)約資源的方法，同時(shí)降低對(duì)化石燃料的依賴。本發(fā)明的另一目的是提供一種能合成用作香料和/或芳香成分的香紫蘇醇的酶。
[0016]本文中所用的縮寫
[0017]bp 堿基對(duì)
[0018]kb 千堿基
[0019]BSA 牛血清白蛋白
[0020]DNA 脫氧核糖核酸
[0021]cDNA 互補(bǔ) DNA
[0022]dT 脫氧胸腺嘧啶
[0023]dNTP 脫氧核苷酸三磷酸
[0024]DTT 二硫蘇糖醇
[0025]GC 氣相色譜
[0026]GGPP 焦磷酸香葉基香葉酯
[0027]IPTG 異丙基-D-硫代半乳糖苷
[0028] LB溶菌肉湯
[0029]LPP 焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯
[0030]M0PS0 3-(N-嗎啉代)_2_羥基丙磺酸
[0031]MS質(zhì)譜
[0032]ORF 開放閱讀框
[0033]PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0034]RMCE 重組酶介導(dǎo)的盒式交換
[0035]RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[0036]3’ -/5’ -RACE 3’ 和 5’ cDNA 末端快速擴(kuò)增
[0037]RNA 核糖核酸
[0038]mRNA 信使核糖核酸
[0039]nt核苷酸
[0040]RNase 核糖核酸酶
[0041]RuBisCO 核酮糖_1，5_焦磷酸羧化酶
[0042]SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0043]SsLPPs 快樂鼠尾草焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯合酶
[0044]UTR非翻譯區(qū)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0045]本發(fā)明提供一種以經(jīng)濟(jì)、可靠并且可再現(xiàn)的方式通過(guò)生物合成來(lái)生產(chǎn)香紫蘇醇的方法。 [0046]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，包括:
[0047](a)使焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯(LPP)與至少一條具有香紫蘇醇合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列；并且
[0048](b)非強(qiáng)制性選擇地將步驟(a)中生產(chǎn)的香紫蘇醇分離。
[0049]該方法可在體外進(jìn)行，也可在體內(nèi)進(jìn)行，其將進(jìn)一步詳述。
[0050]香紫蘇醇和LPP由圖1所示的它們的結(jié)構(gòu)式定義。
[0051]對(duì)于“香紫蘇醇合酶”或“具有香紫蘇醇合酶活性的多肽”，這里指的是能夠催化由(LPP)起始的香紫蘇醇合成的多肽。多肽催化香紫蘇醇合成的能力可通過(guò)進(jìn)行實(shí)施例中詳述的酶活性測(cè)定來(lái)確認(rèn)。
[0052]根據(jù)本發(fā)明，多肽還表示包括截短的多肽，條件是它們要保持如上所定義的香紫蘇醇合酶活性，并且與SEQ ID NO:1的相應(yīng)片段有至少所定義百分比的同一性。
[0053]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，生產(chǎn)香紫蘇醇的方法包括使LPP與具有香紫蘇醇合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO:1有至少55%，優(yōu)選至少60%，優(yōu)選至少65%，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，甚至更優(yōu)選至少98 %同一性的氨基酸序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:1組成。
[0054]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該香紫蘇醇合酶是截短的多肽，該多肽包含與SEQ IDNO: 102有至少50%同一性的氨基酸序列。最好該多肽包含與SEQ ID N0:96有至少55%，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%,甚至更優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該多肽包含氨基酸序列SEQ IDN0:96。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案，該多肽由SEQ ID NO:96組成。
[0055]兩條肽序列或核苷酸序列之間的同一性的百分比是當(dāng)進(jìn)行這兩條序列的比對(duì)時(shí)，在兩條序列中相同的氨基酸或核酸殘基的數(shù)目的函數(shù)。相同的殘基定義為在兩條序列中在給定比對(duì)位置上的同樣的殘基。這里所用的序列同一性的百分比是由最優(yōu)比對(duì)，通過(guò)將兩條序列中相同的殘基數(shù)目除以最短的序列的殘基總數(shù)再乘以100而計(jì)算得到的。最優(yōu)比對(duì)是這樣一種比對(duì)，其中同一性百分比可能為最高。在一條或兩條序列的一個(gè)或多個(gè)比對(duì)位置可引入間隙以獲得最優(yōu)比對(duì)。在序列同一性的百分比計(jì)算中將這些間隙作為不相同的殘
基來(lái)考慮。
[0056]以確定氨基酸或核酸序列同一性為目的的比對(duì)可使用計(jì)算機(jī)程序(例如為萬(wàn)維網(wǎng)上可得的公用計(jì)算機(jī)程序)以各種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選可使用來(lái)自Nat1nalCenter for B1technology Informat1n(NCBI)的地 址為 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi 的 BLAST 程序(Tatiana 等 FEMS Microb1lLett.，1999，174:247-250, 1999)，其參數(shù)設(shè)為默認(rèn)，以獲得肽序列或核苷酸序列的最優(yōu)比對(duì)，并計(jì)算序列同一性的百分比。
[0057]待與LPP體外接觸的多肽可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)或酶提取技術(shù)，從任何表達(dá)它的生物體中提取來(lái)獲得。如果宿主生物體是將本發(fā)明多肽釋放到培養(yǎng)基中的單細(xì)胞生物體或細(xì)胞，該多肽可簡(jiǎn)單地由培養(yǎng)基收集，例如通過(guò)離心，然后非強(qiáng)制性選擇地洗滌并在合適的緩沖溶液中再懸浮。如果該生物體或細(xì)胞在其細(xì)胞內(nèi)積聚了多肽，則該多肽可通過(guò)將該細(xì)胞分解或溶解然后從該細(xì)胞裂解液中提取多肽來(lái)獲得。
[0058]該多肽——要么為分離形式，要么為與其他蛋白質(zhì)在一起的形式，例如為在由經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或微生物獲得的粗蛋白質(zhì)提取物中的形式——可隨后以最優(yōu)PH懸浮于緩沖溶液中。如果合適，可添加鹽、DTT、BSA和其他類型的酶輔助因子，以優(yōu)化酶活性。合適的條件更詳細(xì)地描述于隨后的實(shí)施例中。
[0059]隨后，將LPP添加到懸浮液或溶液中，然后在最優(yōu)溫度下，例如15~40°C，優(yōu)選25~35°C，更優(yōu)選于30°C培養(yǎng)。培養(yǎng)后，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分離步驟，例如溶劑提取和蒸餾，非強(qiáng)制性選擇地在從溶液中移除多肽之后，將所生產(chǎn)的香紫蘇醇從培養(yǎng)液中分離。
[0060]LPP可通過(guò)使GGPP與分離的LPP合酶接觸來(lái)獲得。如下的實(shí)施例1和3示出了從快樂鼠尾草中分離出編碼cDNA的LPP合酶的方法，所述cDNA在大腸桿菌中異源表達(dá)的方法，對(duì)所生產(chǎn)的LPP合酶進(jìn)行純化的方法，以及使用分離的LPP合酶在體外生產(chǎn)LPP的方法。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，生產(chǎn)香紫蘇醇的方法在體內(nèi)進(jìn)行。在該情況下，上述方法的步驟(a)包括在有助于香紫蘇醇生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)能生產(chǎn)LPP并經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)多肽的非人生物體或細(xì)胞，該多肽具有香紫蘇醇合酶活性，并包含與SEQ ID NO:1有至少70%同一性的氨基酸序列。
[0062]根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，該方法還包括:在步驟(a)之前，用編碼多肽的至少一種核酸來(lái)轉(zhuǎn)化能生產(chǎn)LPP的非人生物體或細(xì)胞，從而所述生物體表達(dá)所述多肽，該多肽具有香紫蘇醇合酶活性，并包含與SEQ ID NO:1有至少70%同一性的氨基酸序列。
[0063]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用于轉(zhuǎn)化宿主生物體或細(xì)胞的該核酸包含與SEQ IDNO: 2有至少50 %，優(yōu)選至少55 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75%,優(yōu)選至少80%,優(yōu)選至少85%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%,甚至更優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 2或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸由核苷酸序列SEQ ID NO: 2或其互補(bǔ)序列組成。
[0064]根據(jù)再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，用于轉(zhuǎn)化宿主生物體或細(xì)胞的該核酸是截短的核酸，其包含與SEQ ID NO: 93有至少50 %，優(yōu)選至少55 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，甚至更優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:93或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案,該核酸由核苷酸序列SEQ ID NO:93或其互補(bǔ)序列組成。
[0065]本發(fā)明的這些實(shí)施方案由于能在體內(nèi)實(shí)施該方法而不用預(yù)先分離多肽從而是特別有利的。該反應(yīng)直接在經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述多肽的生物體或細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。
[0066]所述生物體或細(xì)胞意指“表達(dá)”多肽，條件是該生物體或細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏編碼所述多肽的核酸，該核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA，而該多肽見于該宿主生物體或細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括“異源表達(dá)”和“過(guò)表達(dá)”，后者指的是mRNA、多肽和/或酶活性的水平超過(guò)在非轉(zhuǎn)化的生物體或細(xì)胞中測(cè)量的值。轉(zhuǎn)化非人生物體或細(xì)胞的合適方法的更詳細(xì)描述將隨后在說(shuō)明書中專門將該轉(zhuǎn)化的非人生物體或細(xì)胞作為本發(fā)明的特定目標(biāo)的部分以及實(shí)施例中描述。
[0067]特定的生物體或細(xì)胞，當(dāng)其天然生產(chǎn)LPP時(shí)，或當(dāng)其并不天然生產(chǎn)LPP但生產(chǎn)GGPP (或如此轉(zhuǎn)化)并經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)LPP合酶時(shí)，不管是用編碼香紫蘇醇合酶的核酸轉(zhuǎn)化之前，還是與所述核酸一起，都意味著“能生產(chǎn)LPP”。經(jīng)轉(zhuǎn)化以與天然形成的生物體或細(xì)胞相比生產(chǎn)更高的LPP量的生物體或細(xì)胞也包括在“能生產(chǎn)LPP的生物體或細(xì)胞”內(nèi)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該生物體天然積聚LPP，或經(jīng)轉(zhuǎn)化以積聚LPP。
[0068]用于轉(zhuǎn)化生物體從而使它們表達(dá)LPP合酶的方法可以是本領(lǐng)域公知的用于轉(zhuǎn)化宿主生物體的任意方法。這種方法隨后將更詳細(xì)地描述，并且LPP合酶在大腸桿菌中表達(dá)的一個(gè)特定例子在實(shí)施例2中給出。用于轉(zhuǎn)化生物體以生產(chǎn)GGPP的方法也是本領(lǐng)域公知的° 這種方法例如見于 Huang, Roessner, Croteau and Scott, Engineering Escherichiacoli for the synthesis of taxadiene,a key intermediate in the b1synthesis oftaxol, B10rg Med Chem.，9 (9)，2001，2237-2242。
[0069]為了在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明，宿主生物體或細(xì)胞要在有助于香紫蘇醇生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)。因此，如果宿主是轉(zhuǎn)基因植物，要提供最優(yōu)的生長(zhǎng)條件，例如最優(yōu)的光、水和營(yíng)養(yǎng)條件。如果宿主是單細(xì)胞生物體，有助于香紫蘇醇生產(chǎn)的條件可包括在宿主的培養(yǎng)基中添加合適的輔因子。此外，應(yīng)選擇培養(yǎng)基以最大限度地合成香紫蘇醇。最優(yōu)的培養(yǎng)條件將以更詳細(xì)的方式描述于隨后的實(shí)施例中。
[0070]適于在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法的非人生物體可以是任意的非人多細(xì)胞或單細(xì)胞生物體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的非人生物體是植物、原核生物或真菌。
[0071]任何植物、原核生物或真菌可用于在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的方法。特別有用的植物為那些天然生產(chǎn)高含量職的植物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物從爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、錦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)中選出。例如，植物從煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica(油菜))、苜猜屬(Medicago (苜猜))、棉屬(Gossypium(棉花))、蒿屬(Artemisia)、鼠尾草屬(Salvia)和薄荷屬(Mentha)中選出。優(yōu)選地，該植物屬于煙草(Nicotianatabacum)種。
[0072] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，非人生物體為微生物。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案，所述微生物為細(xì)菌或真菌，優(yōu)選所述真菌為酵母。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌為大腸桿菌(E.coli)，而所述酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0073]這些生物體中的大多數(shù)并不天然生產(chǎn)LPP。為了適于實(shí)施本發(fā)明的方法，這些生物體必須經(jīng)轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)所述前體。如上所述，它們可以在用編碼具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的核酸修飾之前或同時(shí)如此轉(zhuǎn)化。
[0074]也可以使用分離的高等真核細(xì)胞來(lái)取代完整生物體作為宿主以在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的方法。合適的真核細(xì)胞可以是任何非人細(xì)胞，但優(yōu)選植物細(xì)胞。
[0075]根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，在上述任意實(shí)施方案的方法中使用的多肽或核酸源自快樂鼠尾草(Salvia sclarea)。
[0076]實(shí)施本發(fā)明方法的一個(gè)重要工具是多肽本身。因此，具有香紫蘇醇合酶活性并包含與SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽是本發(fā)明的另一目的。
[0077]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該香紫蘇醇合酶包含與SEQ ID NO:1有至少55%，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，甚至更優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案，該多肽由SEQ ID NO:1 組成。
[0078]根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案,該多肽源自快樂鼠尾草(Salvia sclarea)。
[0079]在此使用的術(shù)語(yǔ) “香紫蘇醇合酶”或者“具有香紫蘇醇合酶活性的多肽”指的是包含于此標(biāo)明的氨基酸序列的一類多肽或肽片段，以及截短的或變體多肽，條件是它們要保持如上定義的香紫蘇醇合酶活性，并且它們與SEQ ID NO:1的相應(yīng)片段有至少所定義百分比的同一'I"生。
[0080]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該香紫蘇醇合酶包含與SEQ ID NO:96有至少50%同一性的氨基酸序列。最好該香紫蘇醇合酶包含與SEQ ID NO: 96有至少55 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95%，甚至更優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案，該多肽由SEQ ID NO:96組成。
[0081]變體多肽的例子為天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其由選擇性mRNA拼接產(chǎn)生，或者由在此描述的多肽的蛋白酶剪切產(chǎn)生。歸因于蛋白水解的變體例如包括:由于從本發(fā)明多肽上一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸的蛋白水解移除而產(chǎn)生的在不同類型宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)N末端或C末端的差異。如此后描述的由本發(fā)明的核酸突變獲得的核酸編碼的多肽同樣包括在本發(fā)明之內(nèi)。
[0082]如上所定義的編碼具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的核酸是在體內(nèi)實(shí)施該方法時(shí)修飾將要使用的非人生物體或細(xì)胞所必需的工具。因此，編碼上述任意實(shí)施方案所定義的多肽的核酸是本發(fā)明的另一目的。
[0083]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸包含與SEQ ID N0:2有至少50%同一性的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述核酸包含與SEQ IDN0:2有至少55 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%,甚至更優(yōu)選至少98%同一'丨生的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸包含與SEQ ID N0:2相同的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸由SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列組成。
[0084]根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案,該核酸源自快樂鼠尾草(Salvia sclarea)。
[0085]本發(fā)明的核酸可定義為包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物(DNA和/或RNA)。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”還應(yīng)理解為單獨(dú)片段形式或作為大型核酸的一部分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子。本發(fā)明的核酸還包含某些分離的核苷酸序列，包括基本上不污染內(nèi)源材料的那些。本發(fā)明的核酸可被截短，條件是它要編碼本發(fā)明包含的如上所述的多肽。特別有用的截短的核酸為與SEQ ID N0:93有至少70%同一性的核酸或其互補(bǔ)序列。
[0086]通過(guò)SEQ ID NO: 2的突變體而得到的核酸或其互補(bǔ)序列也包括在本發(fā)明之內(nèi)，條件是它們與SEQ ID N0:2的相應(yīng)片段有至少所定義百分比的同一性，并且它們要編碼如上所定義的具有香紫蘇醇合酶活性的多肽。突變體可以是這些核酸的任意類型的突變體，例如點(diǎn)突變體、缺失突變體、插入突變體和/或閱讀框移位突變體?？芍苽渥凅w核酸以使其核苷酸序列適應(yīng)特異性表達(dá)體系。例如，已知細(xì)菌表達(dá)體系在氨基酸由優(yōu)選的密碼子編碼的情況下更加有效地表達(dá)多肽。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其中超過(guò)一個(gè)密碼子可編碼同一氨基酸，多條DNA序列可編碼同一多肽，所有這些DNA序列都包括在本發(fā)明之內(nèi)。
[0087]根據(jù)又 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸是截短的核酸，其包含與SEQ ID NO:93有至少50 %，優(yōu)選至少55 %，優(yōu)選至少60 %，優(yōu)選至少65 %，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少75 %，優(yōu)選至少80 %,優(yōu)選至少85 %,優(yōu)選至少90 %,更優(yōu)選至少95 %,甚至更優(yōu)選至少98 %同一'丨生的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:93或其互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸由核苷酸序列SEQ ID N0:93或其互補(bǔ)序列組成。
[0088]通常來(lái)講，本發(fā)明的核酸可通過(guò)大規(guī)模并行測(cè)序方法來(lái)分離，其在實(shí)施例5和6中進(jìn)一步展開說(shuō)明。該方法的第一步為cDNA文庫(kù)的全局測(cè)序。首先，通過(guò)霧化使cDNA文庫(kù)片段化，然后通過(guò)PCR對(duì)片段擴(kuò)增，接著進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，得到了命名為“read”的35個(gè)堿基的短序列。使用軟件以所定義的最小長(zhǎng)度的重疊和同源性設(shè)定百分比將“read”重新拼接到毗連序列(“contig”)中。然后，檢索“read”和“contig”與已知同種類型的酶的序列同一性?；谶@些同源性，選擇“read”和“contig”并用于合成引物，以進(jìn)行全長(zhǎng)香紫蘇醇合酶的PCR擴(kuò)增。
[0089]另一個(gè)用于轉(zhuǎn)化適于體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法的宿主微生物或細(xì)胞的重要工具是包含至少一種本發(fā)明任一實(shí)施方案的核酸的表達(dá)載體。因此,這類載體也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0090]在此使用的“表達(dá)載體”包括任意的直鏈或環(huán)狀重組載體，包括但不限于病毒載體、曬菌體和質(zhì)粒。技術(shù)人員能根據(jù)表達(dá)體系選擇合適的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中,表達(dá)載體包括本發(fā)明的核酸，其可操作地連接至至少一條控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、起始、終止的調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子或增強(qiáng)子或mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并非強(qiáng)制性選擇地包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。當(dāng)調(diào)控序列功能性地與本發(fā)明核酸關(guān)聯(lián)時(shí)，稱核苷酸序列為“可操作地連接”。
[0091]本發(fā)明的表達(dá)載體可在如下進(jìn)一步描述的用于在包藏本發(fā)明核酸的宿主微生物和/或細(xì)胞中制備遺傳轉(zhuǎn)化的宿主微生物和/或細(xì)胞的方法中，以及用于生產(chǎn)或制造具有香紫蘇醇合酶活性的多肽的方法中使用。
[0092]經(jīng)轉(zhuǎn)化以包藏至少一種本發(fā)明的核酸從而異源表達(dá)或過(guò)表達(dá)至少一條本發(fā)明多肽的重組非人生物體和細(xì)胞也是實(shí)施本發(fā)明方法的非常有用的工具。因此，這類非人生物體和細(xì)胞是本發(fā)明的另一目的。
[0093]本發(fā)明的非人生物體可以是任何非人多細(xì)胞或單細(xì)胞生物體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人生物體是植物、原核生物或真菌。所述生物體可以是任何植物、原核生物或真菌。特別有用的植物為那些天然生產(chǎn)高含量萜的植物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物從爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、錦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)中選出。例如，植物從煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica(油菜))、苜猜屬(Medicago (苜猜))、棉屬(Gossypium(棉花))、蒿屬(Artemisia)、鼠尾草屬(Salvia)和薄荷屬(Mentha)中選出。優(yōu)選地，該植物屬于煙草(Nicotianatabacum)種。
[0094]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，非人生物體為微生物。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案，所述微生物為細(xì)菌或酵母。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌為大腸桿菌(E.coli)，而所述酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0095]分離的高等真核細(xì)胞也可經(jīng)轉(zhuǎn)化以代替完整的生物體。作為高等真核細(xì)胞，在此我們指除酵母細(xì)胞外的任何非人真核細(xì)胞。優(yōu)選的高等真核細(xì)胞為植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
[0096]術(shù)語(yǔ)“經(jīng)轉(zhuǎn)化”指的是這樣一種事實(shí):宿主經(jīng)過(guò)遺傳工程以包含本發(fā)明任意核酸的一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)轉(zhuǎn)化”涉及異源表達(dá)本發(fā)明多肽和過(guò)表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體，其中本發(fā)明多肽的表達(dá)量高于未經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的同一生物體中的表達(dá)量。
[0097] 已知本領(lǐng)域中有多種方法用于創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因宿主生物體或細(xì)胞，例如植物、真菌、原核生物，或高等真核生物的細(xì)胞培養(yǎng)物。用于與細(xì)菌、真菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主一同使用的合適的克隆和表達(dá)載體例如描述于Pouwels等的Cloning Vectors:ALaboratory Manual, 1985, Elsevier, New York 以及 Sambrook 等的 Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd edit1n, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中。用于高等植物和/或植物細(xì)胞的克隆和表達(dá)載體尤其是技術(shù)人員可獲得的，見例如Schardl等Gene61:1-11, 1987。
[0098]用于轉(zhuǎn)化宿主微生物或細(xì)胞以包藏轉(zhuǎn)基因核酸——例如本發(fā)明的那些核酸——的方法是技術(shù)人員所熟悉的。例如，對(duì)于創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物來(lái)說(shuō)，現(xiàn)行的方法包括:植物原生質(zhì)體的電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法、粒子轟擊法、植物細(xì)胞顯微注射法以及使用病毒的轉(zhuǎn)化方法。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA整合到非人宿主生物體和/或細(xì)胞的染色體中，從而得到了穩(wěn)定的重組體系。本領(lǐng)域公知的可用于本發(fā)明實(shí)踐的染色體整合方法包括但不限于重組酶介導(dǎo)的盒式交換(RMCE)、病毒位點(diǎn)特異性染色體插入法、腺病毒法以及核內(nèi)注射法。
[0100]為了實(shí)施如上所公開的體外生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，提供一種制備具有香紫蘇醇合酶活性的至少一條多肽的方法是非常有利的。因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)具有香紫蘇醇合酶活性的至少一條多肽的方法，包括:
[0101](a)培養(yǎng)用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的非人生物體或細(xì)胞，從而使其包藏本發(fā)明的核酸并表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼并具有香紫蘇醇合酶活性的多肽；
[0102](b)將該具有香紫蘇醇合酶活性的多肽從步驟(a)中培養(yǎng)的非人生物體或細(xì)胞中分離。
[0103]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法還包括:在步驟(a)之前，用本發(fā)明的至少一個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞，從而使其包藏至少一種本發(fā)明的核酸并表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼的至少一條多肽。
[0104]非人生物體或細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)可以如上所述的用于體內(nèi)生產(chǎn)香紫蘇醇的方法來(lái)進(jìn)行。步驟(b)可以本領(lǐng)域公知的用于從生物體或細(xì)胞中分離特定多肽的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
[0105]在此所指的“多肽變體”意味著這樣一種多肽，其具有香紫蘇醇合酶活性，并實(shí)質(zhì)上與天然多肽同源，但由于一個(gè)或多個(gè)缺失、插入或取代，其氨基酸序列與由本發(fā)明的任何核酸序列編碼的氨基酸序列不同。
[0106]變體可包括保守取代的序列，這意味著某特定氨基酸殘基可被具有相似物化特性的殘基所取代。保守取代的例子包括:用一個(gè)脂肪族殘基取代另一個(gè)，例如用Ile、Val、Leu或Ala彼此取代；或者用一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)，例如Lys和Arg之間,Glu和Asp之間，或 Gln 和 Asn 之間的取代。JAL Zubay, B1chemistry, Addison-ffesley Pub.C0., (1983)。這類取代的效果可用Altschul，(J.Mol.B1l.219:555-65, 1991)中論述的取代打分矩陣如PAM-120, PAM-200和PAM-250來(lái)計(jì)算。其他的這類保守取代，例如具有相似疏水特性的整個(gè)區(qū)域的取代，也是公知的。
[0107] 天然形成的肽變體也包括在本發(fā)明之內(nèi)。這類變體的例子為由選擇性mRNA拼接產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或由在此描述的多肽的蛋白酶剪切產(chǎn)生。歸因于蛋白水解的變體例如包括:由于從由本發(fā)明的序列編碼的多肽上一個(gè)或多個(gè)端末氨基酸的蛋白水解移除而產(chǎn)生的在不同類型宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)N末端或C末端的差異。
[0108]本發(fā)明的多肽變體可用于獲得所需的提高或降低的酶活性，修飾的區(qū)域化學(xué)或立體化學(xué)，或改變的底物應(yīng)用或產(chǎn)物分布。此外，制備變體以具有至少一種改良的特性，例如對(duì)底物的增強(qiáng)的親和性，對(duì)一種或多種化合物生產(chǎn)的改善的特異性，不同的產(chǎn)物分布，不同的酶活性，酶促反應(yīng)的提高的速率，在特定環(huán)境(pH、溫度、溶劑等)中的更高的活性或穩(wěn)定性，或者在所需表達(dá)體系中提高的表達(dá)水平。變體或定位突變可由本領(lǐng)域公知的任何方法產(chǎn)生。如上所述，本發(fā)明提供重組和非重組、分離并提純的多肽，例如快樂鼠尾草(Salviasclarea)。天然多肽的變體和衍生物可通過(guò)分離不同或相同植物品系或種的天然形成的變體或變體的核苷酸序列而得到，或通過(guò)對(duì)編碼天然香紫蘇醇合酶的核苷酸序列突變進(jìn)行人工規(guī)劃性突變(programming mutat1n)而得到。對(duì)天然氨基酸序列的改變可通過(guò)多種常規(guī)方法中的任一種來(lái)完成。
[0109]由附加肽序列在本發(fā)明多肽的氨基末端或羧基末端的融合產(chǎn)生的多肽變體可用于增強(qiáng)多肽的表達(dá)，有助于蛋白純化或提高多肽在所需環(huán)境或表達(dá)體系中的酶活性。這類附加肽序列例如可以是信號(hào)肽。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的變體，例如通過(guò)與其他寡肽或多肽融合而得到的那些和/或與信號(hào)肽連接的那些。[0110]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備具有香紫蘇醇合酶活性的變體多肽的方法，包括步驟:
[0111](a)選擇如上所公開的任何實(shí)施方案中的核酸；
[0112](b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸；
[0113](C)用該突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或單細(xì)胞生物體以表達(dá)由該突變核酸序列編碼的多肽；
[0114](d)對(duì)該多肽進(jìn)行至少一種修飾特性的篩選；并且
[0115](e)非強(qiáng)制性選擇地，如果該多肽不具備想要的變體香紫蘇醇合酶活性，則重復(fù)步驟(a)至(d)直至獲得具有所需變體香紫蘇醇合酶活性的多肽；
[0116](f)非強(qiáng)制性選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所需變體香紫蘇醇合酶活性的多肽，則分離在步驟(C)中獲得的相應(yīng)突變核酸。
[0117]步驟(b)中，例如通過(guò)隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變或DNA改組會(huì)產(chǎn)生大量的突變核酸序列?；蚋慕M的具體步驟見于 Stemmer, DNA shuffling by random fragmentat1n andreassembly:1n vitro recombinat1n for molecular evolut1n.Proc Natl Acad Sci U SA.，1994，91 (22): 10747-1075。簡(jiǎn)言之，DNA改組指的是已知序列在體外隨機(jī)重組的過(guò)程，涉及至少兩種被選 定用于重組的核酸。例如，可通過(guò)合成含突變序列的寡核苷酸而在特定位點(diǎn)引入突變，所述突變序列側(cè)生有能連接至天然序列的片段的限制位點(diǎn)。在連接之后，所得的重構(gòu)序列編碼具有所需氨基酸插入、取代或缺失的類似物。或者，可采用寡核苷酸定位的位點(diǎn)特異性誘變步驟來(lái)提供改變的基因，其中預(yù)定的密碼子可通過(guò)取代、缺失或插入而被改變。
[0118]因此，SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 93可與編碼核酸(例如由除快樂鼠尾草外的其他生物體中分離出的)的其他任何二萜合酶重組。因此，可獲得并分離出突變核酸，其可用于根據(jù)例如本實(shí)施例中公開的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0119]步驟(d)中，對(duì)步驟(C)獲得的多肽進(jìn)行至少一種修飾特性——例如所需的經(jīng)修飾的酶活性——的篩選。對(duì)表達(dá)多肽進(jìn)行篩選的所需酶活性的例子包括由Km或Vmax值量度的提高或降低的酶活性，修飾的區(qū)域化學(xué)或立體化學(xué)以及改變的底物應(yīng)用或產(chǎn)物分布。酶活性的篩選可通過(guò)技術(shù)人員熟知的并在本實(shí)施例中公開的那些程序進(jìn)行。
[0120]提供步驟(e)用于重復(fù)步驟(a)~(d)的過(guò)程，優(yōu)選其可并行操作。因此，通過(guò)創(chuàng)造大量的突變核酸，可用不同的變體核酸同時(shí)轉(zhuǎn)化多種宿主細(xì)胞，從而允許后續(xù)的更多數(shù)量的多肽的篩選。由此，獲得所需變體多肽的機(jī)會(huì)可任由技術(shù)人員而增加。
[0121]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備編碼具有香紫蘇醇合酶活性的變體多肽的核酸的方法，該方法包括如上公開的步驟(a)至(e)，并且還包括步驟:
[0122]本申請(qǐng)中提及的出版物均以參照的方式并入于此，以公開并描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0123]圖1:說(shuō)明書中引用的各種化合物的結(jié)構(gòu)。
[0124]圖2:由SsTpsll32(SEQ ID NO:1)催化、從LPP起始的香紫蘇醇的推定生物合成路線。[0125]圖3:來(lái)自I類二萜合酶樣片段的氨基酸序列與來(lái)自水稻(Orizasativa)的stemodene合酶(編號(hào)AAZ76733)的序列的比對(duì)。
[0126]圖4:由 SsTpsll32(SEQIDN0:l)和 SsTpsll37 (SEQ ID N0:86)推斷出的氨基酸序列與選自數(shù)據(jù)庫(kù)的二萜合酶氨基酸序列的比對(duì)。
[0127]圖5:在大腸桿菌中異源表達(dá)的 SsTpsll32(SEQ ID NO:1)和 1132-2-5 (SEQ IDNO:96)的氨基酸序列的比對(duì)。
[0128]圖6:不同的1132重組蛋白與LPP培養(yǎng)之后所獲得的產(chǎn)物的GC分析。來(lái)自大腸桿菌、表達(dá)重組SsTpsll32和1132-2-5蛋白(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:96)的粗蛋白提取物與LPP培養(yǎng)于最終體積為ImL的50mMM0PS0(pH7)，其添加了 15mM的MgCl2和ImM的DTT。
[0129]圖7:通過(guò)重組1132-2-5蛋白由LPP產(chǎn)生的產(chǎn)物的GC-MS分析。(A) LPP與提取自大腸桿菌、由pET101-1132-2-5(SEQ ID NO:93)轉(zhuǎn)化的粗蛋白一起培養(yǎng)所得的產(chǎn)物的總離子色譜圖。(B)保留時(shí)間為14.3時(shí)的峰的質(zhì)譜圖。(C)可靠香紫蘇醇標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)譜圖。
[0130]圖8:SsTpsll32 和 1132-2-5 重組蛋白(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:96)與存在于GGPP的SsLPPs3(SEQ ID NO:24)重組蛋白共培養(yǎng)后所得的產(chǎn)物的GC分析。
【具體實(shí)施方式】
[0131]通過(guò)如下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0132]實(shí)施例1
[0133]通過(guò)PCR方法分離編碼來(lái)自快樂鼠尾草的cDNA的LPP合酶
[0134]A.植物材料和RNA提取
[0135]從瑞士 Bassins的野外收集生長(zhǎng)了花蕾(1.5~2cm長(zhǎng)，I~2日齡)的快樂鼠尾草(Salvia sclarea),并直接在液氮中冷凍。
[0136]用來(lái)自Invitrogen (Carlsbad, CA)的 Concert? 植物 RNA 試劑提取總 RNA,根據(jù)制造商手冊(cè)，用 FastTrack '} 2.0mRNA 分離試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)通過(guò)oligodT-纖維素親和層析法純化mRNA。用Marathon?cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech, MountainView, CA)構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)。
[0137]B.用于擴(kuò)增二萜合酶cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0138]使用正向引物DT3F (5’ -GAYRTNGAYGAYACNGCNATGG-3’ (SEQ ID NO: 3))和反向引物 DT4R(5’ -GTYTTNCCNAKCCANACRTCRYYT-3’ (SEQ ID NO:4))來(lái)進(jìn)行 PCR。PCR 混合物含有0.4μΜ的各引物、300μΜ的各dNTP、5y L的1X HotStartTaq? DNA聚合酶緩沖液(Qiagen)、2μ L 的 100 倍稀釋的 cDNA、0.5μ L 的 HotStartTaq? DNA 聚合物，總體積為50 μ L0循環(huán)條件為:94°C下45秒、50°C下45秒和72°C下2分鐘共35個(gè)循環(huán)，以及72°C下10分鐘。在1%的瓊脂糖凝膠上評(píng)價(jià)PCR產(chǎn)物的大小。將相應(yīng)于預(yù)期大小的條帶從
凝膠上切除，用(5丨八411泌丨<1<凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化,并使用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒
(Invitrogen, Carlsbad, CA)在pCRK 2.1-TOPO載體中克隆。隨后，對(duì)所插入的cDNA片段進(jìn)行 DNA 測(cè)序，接著使用 BLASTX 算法(Altschul 等的 J.Mol.B1l.215，403-410，1990)將序列與GenBank非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)比較。獲得了命名為FN23 (SEQ ID NO: 5)的354bp的序列。該DNA片段具有預(yù)期大小，并顯示出與二萜合酶同源。
[0139]C.通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA分離
[0140]設(shè)計(jì)對(duì)FN23序列(SEQ ID NO:5)具有特異性的寡核苷酸:FN23_F1 (3’-GCACGGATACGACGTCGATCCMATGTAC-5’ (SEQ ID NO: 6))、FN23_F2 (3’-GGGCTGCTCAACTMGATTTCCAGGAG_5’ (SEQ ID NO: 7))和 FN23-F3 (5’ -GGGTGATATCCGACCACTTATTTGATGAG-5’ (SEQ ID NO: 8))。這些引物與用接頭序列(5，-AATTCGGTACCCGGGATCC(T)17-3’ ) (SEQ ID NO:9)延長(zhǎng)的 oligodT 引物一起用于RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)混合物的組成如下:10μ I的5Χ Qiagen OneStep RT-PCR緩沖液、400 μ M 的各 dNTP、400nM 的各引物、2 μ I 的 Qiagen OneStep RT-PCR 酶混合物、I μ I
的RNasin?核糖核酸酶抑制劑(Promega C0., Madisson, WI)以及1250ng的總RNA,總體
積為50ml。熱循環(huán)儀條件為:50°C下30分鐘(反轉(zhuǎn)錄)；95°C下15分鐘(DNA聚合酶活化);94°C下45秒、50°C下45秒和72°C下90秒共35個(gè)循環(huán)；以及72°C下10分鐘。使用RT-PCR 產(chǎn)物作為模板與 adapterP 引物(5，-AATTCGGTACCCGGGATCC-3’ (SEQ ID NO: 10))連同相同或巢式FN23特異性引物一起進(jìn)行第二輪PCR。該P(yáng)CR方法得到了 1271bp的cDNA片段(FN30(SEQ ID NO: 11))，該片段與FN23片段(SEQ ID NO: 5)有192bp完全重疊，并且含有含終止密碼子的3’末端和相應(yīng)cDNA的3’非編碼序列。 [0141]為了擴(kuò)增cDNA的5’末端，設(shè)計(jì)了對(duì)FN23有特異性的反義寡核苷酸:FN23-R1(5’_CATGGCATCTTCAACCCCAGCTTTATCTCATC-3’(SEQ ID NO:12))、FN23_R2 (5’_GTGGTCGGATATCACCCATCTTTCTTGAAGTCG-3’(SEQ ID NO:13))、FN23_R3(5’-CATTGGAGATGCAGACTCGACCGATTGACC_3’(SEQ ID NO: 14))。根據(jù) Marathon?cDNA 擴(kuò)增試劑盒方案(Clontech, Mountain View, CA),使用快樂鼠尾草cDNA文庫(kù)將這些引物用于5’RACE。熱循環(huán)條件如下:94°C下I分鐘，94°C下30秒和72°C下4分鐘共5個(gè)循環(huán)，94°C下30秒和70°C下4分鐘共5個(gè)循環(huán)，94°C下30秒和68°C下 4 分鐘共 20 個(gè)循環(huán)。該 5’RACE 得到了 1449bp 的 cDNA 片段(FN40 (SEQ ID NO: 15)，該片段與FN23(SEQ ID NO:5)有227bp完全重疊。與已知二萜合酶序列的比較顯示出，F(xiàn)N40片段(SEQ ID NO: 15)翻譯起始密碼子和87bp的非編碼區(qū)。三條cDNA片段(FN23、FN30和FN40 (SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 15)的拼接得到了 2655bp 的全長(zhǎng) cDNA 序列(SaTpsl) (SEQ ID NO: 16)，其帶有編碼具有785個(gè)殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 17)的2355bp的開放閱讀框。
[0142]實(shí)施例2
[0143]快樂鼠尾草LPP合酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)
[0144]為在T7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)而設(shè)計(jì)的pETDuet-1 (Novagen, Madison, WI)用于大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)。為構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，使用設(shè)計(jì)為在緊鄰起始密碼子之前引入NdeI位點(diǎn)并在終止密碼子之后引入KpnI位點(diǎn)的正向引物和反向引物SaTps-Nde (3’-TACTGACATATGACTTCTGTAAATTTGAGCAGAGCACC-5’ (SEQ ID NO: 18))和 SaTps-Kpn (3，-TTGGTACCTCATACAACCGGTCGAMGAGTACTTTG-5’ (SEQ ID NO: 19))，通過(guò)PCR從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出 SaTpsl (SEQ ID NO: 16)的開放閱讀框。由于該閱讀框在該閱讀框的1614位置處含有NdeI位點(diǎn)，本次擴(kuò)增通過(guò)重疊延伸PCR(Horton等的Gene77, 61-68，1989)分兩步操作，其中使用引物SaTps-Nde (SEQID NO: 18)和 SaTps-Kpn(SEQ ID NO: 19)連同引物 Satps_mutlf(5’-GTTGGAGTGGATCCACATGCAGGAATGGTAC-3’ (SEQ ID NO:20))和Satps-mutlr (3’-GTACCATTCCTGCATCTGGATCCACTCCAAC-5’ (SEQ ID NO: 21))的組合，它們?cè)O(shè)計(jì)用來(lái)移除NdeI位點(diǎn)而不改變氨基酸序列。所得cDNA首先用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)連接到PCR2.1-Topo質(zhì)粒中，在將Nde1-KpnI片段亞克隆到pETDuet_l載體之前對(duì)插入物的序列進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0145]使用SaTpsl特異性引物從cDNA文庫(kù)擴(kuò)增所得幾條克隆的序列分析顯示出在cDNA序列中幾個(gè)位置處具有一些變異性。鑒定了七個(gè)位置，其中可發(fā)現(xiàn)兩種不同的氨基酸。所發(fā)現(xiàn)的一個(gè)位置為在某些克隆中出現(xiàn)的絲氨酸殘基的插入。這些位置列于下表:
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)香紫蘇醇的方法，包括: (a)使焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯(LPP)與具有香紫蘇醇合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO:1有至少70%同一性的氨基酸序列；并且 (b)非強(qiáng)制性選擇地將步驟(a)中生產(chǎn)的香紫蘇醇分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO:1有至少80%，更優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述多肽包含SEQID NO:1所規(guī)定的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽由SEQID NO:1所規(guī)定的氨基酸序列組成。
5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)通過(guò)在有助于香紫蘇醇生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)能生產(chǎn)LPP并經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述多肽的非人生物體或細(xì)胞而進(jìn)行。
6.權(quán)利要求5的方法，還包括在步驟(a)之前，用編碼所述多肽的核酸來(lái)轉(zhuǎn)化該能生產(chǎn)LPP的非人生物體或細(xì)胞，從而所述生物體表達(dá)所述多肽。
7.權(quán)利要求5或6 的方法，其中所述非人生物體是植物、原核生物或真菌。
8.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述非人生物體是微生物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述微生物是細(xì)菌或酵母。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli)，所述酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
11.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述非人細(xì)胞是從植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞中選出的高等真核細(xì)胞。
12.分離的多肽，該多肽具有香紫蘇醇合酶活性并包含與SEQID NO:1有至少70%同一性的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求12的分離的多肽，該多肽包含與SEQID NO:1有至少80%，更優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的分離的多肽，該多肽包含SEQID NO:1所規(guī)定的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求14的分離的多肽，該多肽由SEQID NO:1所規(guī)定的氨基酸序列組成。
16.權(quán)利要求12~15中任一項(xiàng)的分離的多肽，該多肽源自快樂鼠尾草(SalviaSclarea)。
17.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求12~16中任一項(xiàng)的多肽。
18.權(quán)利要求17的分離的核酸，該核酸包含與SEQID NO: 2有至少70%同一性的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
19.權(quán)利要求18的分離的核酸，該核酸包含與SEQID NO: 2有至少80%，優(yōu)選至少90%同一性的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
20.權(quán)利要求19的分離的核酸,該核酸包含與SEQID NO:2相同的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
21.權(quán)利要求20的分離的核酸，該核酸由SEQID NO:2所規(guī)定的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
22.權(quán)利要求17~21中任一項(xiàng)的分離的核酸，該核酸源自快樂鼠尾草。
23.表達(dá)載體,該表達(dá)載體包含權(quán)利要求17~22中任一項(xiàng)的核酸。
24.權(quán)利要求23的表達(dá)載體，其形式為病毒載體、噬菌體或質(zhì)粒。
25.權(quán)利要求23或24的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括本發(fā)明的核酸，所述核酸可操作地連接至至少一條控制轉(zhuǎn)錄、翻譯的起始或終止的調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子或增強(qiáng)子或mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并非強(qiáng)制性選擇地包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。
26.非人生物體，其用權(quán)利要求23~25中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，從而包藏權(quán)利要求17~22中任一項(xiàng)的核酸并異源表達(dá)或過(guò)表達(dá)權(quán)利要求12~16中任一項(xiàng)的多肽。
27.權(quán)利要求26的非人生物體，其中所述非人生物體是植物、原核生物或真菌。
28.權(quán)利要求26的非人生物體，其中所述非人生物體是微生物。
29.權(quán)利要求28的非人生物體，其中所述微生物是細(xì)菌或酵母。
30.權(quán)利要求29的非人生物體，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌，所述酵母是釀酒酵母。
31.高等真核細(xì)胞,其用權(quán)利要求23~25中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，從而包藏權(quán)利要求17~22中任一項(xiàng)的核酸并表達(dá)權(quán)利要求12~16中任一項(xiàng)的多肽。
32.權(quán)利要求31的高等真核細(xì)胞，其中所述高等真核細(xì)胞是植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
33.生產(chǎn)具有香紫蘇醇合酶活性的至少一條多肽的方法，包括: (a)培養(yǎng)用權(quán)利要求23~25中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的非人生物體或細(xì)胞，從而使其包藏權(quán)利要求17~22中任一項(xiàng)的核酸并表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼并具有香紫蘇醇合酶活性的多肽； (b)將該具有香紫蘇醇合酶活性的多肽從步驟(a)中培養(yǎng)的非人生物體或細(xì)胞中分離。
34.權(quán)利要求33的方法，還包括在步驟(a)之前，用權(quán)利要求23~25中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞，從而使其包藏權(quán)利要求17~22中任一項(xiàng)的核酸并表達(dá)或過(guò)表達(dá)由所述核酸編碼的多肽。
35.制備具有香紫蘇醇合酶活性的變體多肽的方法，包括步驟: (a)選擇權(quán)利要求17~23中任一項(xiàng)的核酸； (b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸； (c)用該突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或單細(xì)胞生物體以表達(dá)由該突變核酸序列編碼的多肽； (d)對(duì)該多肽進(jìn)行至少一種修飾特性的篩選；并且 (e)非強(qiáng)制性選擇地，如果該多肽不具備想要的變體香紫蘇醇合酶活性，則重復(fù)步驟(a)至(d)直至獲得具有所需變體香紫蘇醇合酶活性的多肽； (f)非強(qiáng)制性選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所需變體香紫蘇醇合酶活性的多肽，則分離在步驟(C)中獲得的相應(yīng)突變核酸。
【文檔編號(hào)】C12P7/02GK104031945SQ201410171781
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2009年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2008年1月29日
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