一種大伏革菌及其在防治中國(guó)針葉樹根腐病上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大伏革菌(Phlebiopsis?gigantea)，其在CGMCC的保藏號(hào)為CGMCC?No.8653；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間：2013年12月18日。本發(fā)明的大伏革菌可用于防治中國(guó)針葉樹根腐病，對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病病原菌的拮抗率可達(dá)到55.83％。
【專利說明】一種大伏革菌及其在防治中國(guó)針葉樹根腐病上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種生物防治中國(guó)針葉樹根腐病的菌種及其應(yīng)用，特別是涉及一種大伏革菌及在防治中國(guó)針葉樹根腐病上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]針葉樹根腐病是北溫帶地區(qū)普遍分布的一種重要病害，在亞熱帶地區(qū)僅局部分布，危害較小。根據(jù)植物病害分布地圖，該病害在美國(guó)、加拿大、法國(guó)、德國(guó)、印度、日本等全球40多個(gè)國(guó)家均有分布。據(jù)調(diào)查，該病害在我國(guó)東北林區(qū)甚為常見，在四川省西部和云南省西北部高山針葉林區(qū)內(nèi)也比較普遍，在云南鐵杉、黃櫟林內(nèi)有時(shí)也能見到。該病害常導(dǎo)致針葉樹幼林內(nèi)大量林木死亡，在成年林或過熟林內(nèi)，根白腐常導(dǎo)致干基腐朽，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)用材的出材率；而且由于根腐病常引起根部死亡，導(dǎo)致林木生長(zhǎng)量的降低，其在經(jīng)濟(jì)上的損失更大。
[0003]針葉樹根腐病的病原菌是異擔(dān)子菌Heterobasidion,能引起針葉樹根腐病的異擔(dān)子菌有5個(gè)生物種，分別是狹義多年異擔(dān)子菌H.anno sum (Fr.)Bref.sen sostricto、小孔異擔(dān)子菌 H.parviporum NiemeIa&Korhonen> 冷杉異擔(dān)子菌 H.abietienumNiemela&Korhonen、異孔異擔(dān)子菌 H.1rregulare Garbelotto&Otrosina 和西方異擔(dān)子菌
H.0ccidentale Otrosina&Garbelotto。雖然，該病害在我國(guó)的病原菌并不是歐洲和北美地區(qū)真正的多年異擔(dān)子菌Heterobasidion annosum,而是小孔異擔(dān)子菌H.parviporum,但是，在歐洲和北美引起嚴(yán)重病害的多年異擔(dān)子菌隨進(jìn)口原木傳入、擴(kuò)散和定殖我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)很大，需要防患于未然 。該病害自1800年發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，很多國(guó)家對(duì)其防治方法及各種防治方法的生態(tài)影響都進(jìn)行了深入的研究。到目前為止，主要的防治方法有營(yíng)林措施防治、化學(xué)防治和生物防治。
[0004]營(yíng)林措施防治包括在營(yíng)林過程中，避免在有利于異擔(dān)子菌生長(zhǎng)的土壤上造林，如酸性和營(yíng)養(yǎng)豐富及砂質(zhì)土壤；對(duì)感染的樹種要避免營(yíng)造純林；對(duì)林分進(jìn)行撫育時(shí)，選擇在冬天進(jìn)行；對(duì)伐樁進(jìn)行妥善處理；對(duì)已發(fā)生異擔(dān)子菌侵染并造成死亡的樹木進(jìn)行深埋和燒毀等。但是營(yíng)林防治不能在根本上抑制針葉樹根腐病的發(fā)生。
[0005]化學(xué)防治是利用雜酚油、尿素、硼砂和氯氧化銅等處理已感染病原菌的樹干基部，但是化學(xué)防治不能有效控制周圍樹木的感染，并且化學(xué)藥劑會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定的影響。
[0006]生物防治是基于以下原理:自然界中很多腐生真菌在相同生境條件下比異擔(dān)子菌生長(zhǎng)迅速，能夠侵占更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位，因此可以抑制異擔(dān)子菌的侵染和擴(kuò)散。生物防治能有效抑制異擔(dān)子菌對(duì)林木的侵染，可以將由異擔(dān)子菌引起的干基腐朽高度控制在最低，并且能夠控制病原菌的傳播速率，不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響，因此生物防治具有更廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)是一種白色腐朽真菌,廣泛腐生于針葉樹死樹特別是伐樁上，和異擔(dān)子菌構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，同時(shí)干涉異擔(dān)子菌菌絲生長(zhǎng)，具有拮抗異擔(dān)子菌的能力，其產(chǎn)生的胞外纖維素酶能夠降解樹木細(xì)胞壁纖維素結(jié)構(gòu)，達(dá)到快速定殖于伐樁的目的，故胞外纖維素酶活可作為高效生防菌株篩選的指標(biāo)之一。
[0008]盡管國(guó)外已有國(guó)家利用大伏革菌防治異擔(dān)子菌引起的針葉樹根腐病，但是針對(duì)我國(guó)針葉樹根腐病的致病菌小孔異擔(dān)子菌的生物防治還未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種防治中國(guó)針葉樹根腐病的大伏革菌高效菌株及其應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明菌株已于2013年12月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)，在CGMCC的保藏號(hào)為:CGMCCN0.8653。
[0011]本發(fā)明的大伏革菌菌株CGMCC N0.8653，可以通過下列兩種方法分離得到:
[0012]1、基質(zhì)分離法:取采集的大伏革菌子實(shí)體下的木組織，將其上、下表面及四周用刀切掉，露出中間的木材組織，將處理過的木材組織在酒精燈焰上移動(dòng)幾次進(jìn)行表面消毒滅菌，然后在無菌條件下將其切成2mmX6mm的長(zhǎng)段(片)接種于麥芽汁培養(yǎng)基(麥芽浸粉20.0g/L，瓊脂粉 18.0g/L，KH2P043.0g/L，pH 自然，121°C高壓滅菌 30min)上，在 28°C條件下恒溫培養(yǎng)，3 - 5天后可見白色菌絲出現(xiàn)，挑取菌絲進(jìn)行純化后保存，每個(gè)子實(shí)體重復(fù)3次。 [0013]2、孢子噴射法:取采集的大伏革菌子實(shí)體，將其在無菌條件下切取長(zhǎng)2 - 2.5cm,寬0.5cm小塊，用透明膠帶將切取的子實(shí)體小塊貼到培養(yǎng)基蓋上(子實(shí)體面朝下)，置于室溫下培養(yǎng)，24 - 48h (子實(shí)體干燥需放置更長(zhǎng)時(shí)間)后，檢查是否有孢子噴射并萌發(fā)，如果有，需將子實(shí)體塊移除防止污染，并挑取已萌發(fā)的孢子進(jìn)行純化后保存，每個(gè)子實(shí)體重復(fù)3次。如果兩種方法分離并純化后的菌絲是一樣的，則證明分離成功，否則重新分離。
[0014]綜合大伏革菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列結(jié)果，將其鑒定為大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。
[0015]本發(fā)明另一方面提供一種大伏革菌菌株CGMCC N0.8653在防治中國(guó)針葉樹根腐病上的應(yīng)用。
[0016]其中，所述大伏革菌以生防制劑的形式實(shí)施。
[0017]特別是，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子懸浮液與蔗糖溶液混合后，密封于聚乙烯小袋中，即得。
[0018]特別是，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子懸浮液制成可濕性粉劑，密封于箔襯袋中，即得。
[0019]其中，所述大伏革菌孢子懸浮液通過如下步驟制備而成:
[0020]將大伏革菌供試菌株在固體培養(yǎng)基上活化；
[0021]取適量活化菌種接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，在28±2°C條件下培養(yǎng)2-4周；
[0022]待大伏革菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水沖洗麥芽汁平板培養(yǎng)基上的孢子，并用血球計(jì)數(shù)板標(biāo)定到1.0X IO4-L 5 X IO4個(gè)大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子懸浮液。
[0023]特別是，所述麥芽汁培養(yǎng)基的成分包括麥芽浸粉、瓊脂粉、KH2PO4、無菌水，其中，每升麥芽汁培養(yǎng)基中，所述麥芽浸粉為20.0±2g，瓊脂粉為18.0±2g、KH2P04S 3.0±0.5g，其余為無囷水。
[0024]特別是，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子和菌絲液接種于滅菌后的山毛櫸木屑中，密封于聚乙烯小袋中，即得。
[0025]其中，所述大伏革菌實(shí)施對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病的方法為:將大伏革菌制劑溶解稀釋后噴灑于伐樁上。
[0026]其中，所述大伏革菌實(shí)施對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病的方法為:將大伏革菌制劑溶解稀釋后噴灑到電鋸鏈條上，用電鋸伐樹的同時(shí)接種伐樁。
[0027]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0028]1、本發(fā)明提供的大伏革菌CGMCC N0.8653菌株對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病病原菌小孔異擔(dān)子菌拮抗率達(dá)到55.83%，具有良好的抑菌效果。
[0029]2、本發(fā)明提供的大伏革菌CGMCC N0.8653菌株可以抑制小孔異擔(dān)子菌在樹樁上的定殖，有效防治針葉樹根腐病，為中國(guó)針葉樹根腐病的生物防治提供一種行之有效的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中大伏革菌CGMCC N0.8653的無性孢子圖；
[0031]圖2為實(shí)施例3中的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0033]本發(fā)明實(shí)施例中選用的幾種培養(yǎng)基的配方如下:
[0034]固體培養(yǎng)基:葡萄糖10.0g/L,麥芽浸粉20.0g/L,瓊脂粉18.0g/L, KH2P043.0g/L,pH自然；
[0035]液體培養(yǎng)基:葡萄糖10.0g/L，麥芽浸粉20.0g/L, KH2P043.0g/L, pH自然；
[0036]篩選培養(yǎng)基:葡萄糖30.0g/L，蛋白胨 5.0g/L, KH2P043.0g/L, MgSO4.7H201.5g/L，初始ρΗ4.0 ；
[0037]麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽浸粉20.0g/L,瓊脂粉18.0g/L, KH2P043.0g/L, pH自然。
[0038]實(shí)施例1大伏革菌CGMCC N0.8653的鑒定
[0039]綜合大伏革菌的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列等，將其鑒定為大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。具體鑒定結(jié)果如下:
[0040]1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0041]菌絲系統(tǒng)一體系，生殖菌絲具簡(jiǎn)單分隔，在Melzer和棉藍(lán)試劑中均無變色反應(yīng)，菌絲組織在KOH試劑中無變色。菌肉菌絲無色，薄壁到稍厚壁，光滑，有分枝，近規(guī)則排列，直徑為2-4 μ m。近子實(shí)層菌絲無色，薄壁，與菌肉菌絲相似，頻繁分枝，近規(guī)則排列，直徑為2-3 μ m ;子實(shí)層中有囊狀體，囊狀體錐形，無色，薄壁或厚壁，頂端較尖，中間有一很窄的腔，被結(jié)晶體，基部具一簡(jiǎn)單分隔，大小為55-86x8-11 μ m,擔(dān)子棍棒狀或近圓柱狀，頂部具4個(gè)擔(dān)孢子梗，基部具一簡(jiǎn)單分隔，大小為20.6-29x4-5 μ m ;擬擔(dān)子與擔(dān)子相似，略小。擔(dān)孢子橢圓形，無色，薄壁，光滑，在Melzer和棉藍(lán)試劑中均無變色反應(yīng),大小為
5.5-7x2.5-3.9 μ m，平均長(zhǎng) L = 6.19 μ m，平均寬 W = 3.02 μ m，長(zhǎng)寬比 Q = 2.05 ;無性孢子磚塊形，由菌絲斷裂而成。
[0042]2、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)鑒定
[0043]提取大伏革菌(Phlebiopsis gigantea) CGMCC N0.8653的基因組,材料及方法如下:
[0044]2.1 材料
[0045]本研究用于DNA提取的樣品直接取材于分離純化后的菌絲。刮取菌絲所用工具為無菌手術(shù)刀片和鑷子，使用前在酒精燈火焰上方滅菌即可。
[0046]2.2Aidlab試劑盒方法
[0047]I)破壁，加入100 μ L裂解液PL。
[0048]2)每個(gè)樣品共加400 μ L裂解液PL，搖勻，65°C水浴半小時(shí)左右。
[0049]3)加入24:1氯仿異戊醇溶液400 μ L, 13000轉(zhuǎn)離心5min。
[0050]4)另取干凈1.5mL離心管，各取300 μ L上清液，分別加入450 μ L結(jié)合液PQ，立即混勻。
[0051]5)將溶液移入吸附柱AC中，13000轉(zhuǎn)離心30s，倒掉廢液。
[0052]6)加400 μ L抑制物去除液IR，12000轉(zhuǎn)離心30s，倒掉廢液。
[0053]7)加500 μ L漂洗液WB，12000轉(zhuǎn)離心30s，倒掉廢液。
[0054]8)加500 μ L漂洗液WB, 12000轉(zhuǎn)離心30s，倒掉廢液。再13000轉(zhuǎn)離心2min。
[0055]9)取出吸附柱AC，轉(zhuǎn)入干凈離心管中，開蓋晾幾分鐘，使乙醇充分揮發(fā)。
[0056]10)加入50-80 μ L洗脫液ΕΒ，放3-5分鐘，12000轉(zhuǎn)離心30s。
[0057]2.3PCR擴(kuò)增引物
[0058]ITS5 (F):GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
[0059]ITS4 (R):TCCTCCGCTTATTGATATGC
[0060]2.4ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
[0061]擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1。
[0062]表1PCR基礎(chǔ)擴(kuò)增反應(yīng)體系
組分用量(μι)
2 X Taq PCR MasterMix15
primer ( 10 umol/L) (F)I
[0063]*
primer (10 μηιοΙ/?) (R)I
Template DNA (75 ng/μL」)I
ddH:012
[0064]ITS-PCR 反應(yīng)條件:95 °C 3min 預(yù)變性，94 °C 變性 40s，54。。退火 45s，72 °C 延伸lmin，34個(gè)循環(huán)后；72°C充分延伸10min，4°C保存。
[0065]擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物3 μ L與3 μ L溴酚藍(lán)指示劑混合均勻，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，穩(wěn)壓90V，電泳30min。將所獲得的PCR產(chǎn)物用GelExtraction Kit(OMEGA)回收后由北京華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用BLAST程序在GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株CGMCC N0.8653與大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列相似性達(dá)99% (ITS序列見序列表)。
[0066]綜合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果，將生防菌株CGMCC N0.8653鑒定為大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)。
[0067]實(shí)施例2大伏革菌拮抗小孔異擔(dān)子菌實(shí)驗(yàn)
[0068]I)制備孢子懸浮液
[0069]將大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)供試菌株在固體培養(yǎng)基上活化,取適量活化菌種接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，在28±2°C條件下培養(yǎng)3周，待大伏革菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水沖洗麥芽汁平板培養(yǎng)基上的孢子，并用血球計(jì)數(shù)板標(biāo)定到IO4個(gè)大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子懸浮液，備用；[0070]將小孔異擔(dān)子菌(Heterobasidion parviporum)供試菌株在固體培養(yǎng)基上活化，取適量活化菌種接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，在28±2°C條件下培養(yǎng)3周，待小孔異擔(dān)子菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水沖洗麥芽汁平板培養(yǎng)基上的孢子，并用血球計(jì)數(shù)板標(biāo)定到4000個(gè)小孔異擔(dān)子菌孢子/mL，制得小孔異擔(dān)子菌孢子懸浮液，備用；
[0071]其中，所述大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)分別為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8653的大伏革菌和購(gòu)于芬蘭Verdra公司的大伏革菌生物制劑Rotstop-F ;所述小孔異擔(dān)子菌(Heterobasidionparviporum)購(gòu)于北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所。
[0072]2)木樁預(yù)處理
[0073]取3個(gè)魚鱗云杉木樁，分別編號(hào)為A、B、C，其中A作為空白對(duì)照組，僅接種小孔異擔(dān)子菌；B、C作為試驗(yàn)組，其中，木樁B接種大伏革菌CGMCC N0.8653和小孔異擔(dān)子菌；木樁C接種大伏革菌生物制劑Rotstop-F和小孔異擔(dān)子菌；實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
[0074]其中，所述魚鱗云杉木樁的高度為20cm，直徑為30_35cm。
[0075]3)分別向木樁B、C的整個(gè)表面均勻噴灑50mL大伏革菌CGMCC N0.8653孢子懸浮液和大伏革菌生物制劑Rotstop-F孢子懸浮液，之后靜置2小時(shí)，木樁A不做任何處理；
[0076]4)待所述大伏革菌孢子懸浮液被木樁B、C完全吸收后，分別向木樁A、B、C的整個(gè)表面噴灑50mL小孔異擔(dān)子菌孢子懸浮液；
[0077]5)將噴灑過小孔異擔(dān)子菌孢子懸浮液的木樁A、B、C置于潮濕陰涼潮濕處培養(yǎng)5-6周，至大伏革菌和小孔異擔(dān)子菌長(zhǎng)出菌絲；
[0078]6)在培養(yǎng)后的木樁上,沿著垂直于木樁的徑向的方向切取樣片,接著用蒸懼水將樣片上的雜質(zhì)沖洗干凈，然后將樣片置于潮濕處培養(yǎng)1-2周，至木樁上的大伏革菌和小孔異擔(dān)子菌產(chǎn)生孢子；
[0079]其中，在每個(gè)木樁垂直于木樁徑向的方向上依次切取3個(gè)樣片，每個(gè)樣片的厚度為 3cm。
[0080]7)計(jì)算拮抗率
[0081]對(duì)空白對(duì)照組和試驗(yàn)組樣片上的小孔異擔(dān)子菌的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算大伏革菌對(duì)小孔異擔(dān)子菌的拮抗率，計(jì)算方法如下:[0082]
拮抗率％ = H(對(duì)，')~H(試珈X100%
H(對(duì)照)
[0083]其中，HmM)代表空白對(duì)照組的小孔異擔(dān)子菌孢子數(shù)，H(M)代表試驗(yàn)組的小孔異擔(dān)子菌孢子數(shù)。
[0084]結(jié)果表明，大伏革菌CGMCC N0.8653對(duì)小孔異擔(dān)子菌的拮抗率可以達(dá)到55.83% ；而大伏革菌生物制劑Rotstop-F對(duì)小孔異擔(dān)子菌的拮抗率僅為42.55%。實(shí)施例3大伏革菌胞外酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0085]I)制備大伏革菌種子懸液
[0086]將大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)供試菌株在固體培養(yǎng)基上活化,取適量活化菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為28±2°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm條件下培養(yǎng)7天，得到一級(jí)發(fā)酵種子，將液體培養(yǎng)基勻漿后，按體積比為1:10的接種量接種到液體培養(yǎng)基中，于溫度為28±2°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm條件下培養(yǎng)3天，得到二級(jí)發(fā)酵種子，備用；
[0087]其中，所述大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)分別為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8653的大伏革菌和購(gòu)于芬蘭Verdra 公司的 Rotstop 生物制劑 Rotstop-F。
[0088]2)制備纖維素 酶液
[0089]將大伏革菌二級(jí)液體發(fā)酵種子按1:20體積比接種量接種至篩選培養(yǎng)基中，在溫度為28±2°C，轉(zhuǎn)速150r/min條件下培養(yǎng)7天后，取上層發(fā)酵液，在轉(zhuǎn)速12000r/min條件下離心10min，取上層清液即為纖維素酶液，備用；
[0090]3)測(cè)定纖維素酶活力
[0091]采用常規(guī)的羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測(cè)定方法測(cè)定纖維素酶活力:取
0.1mL纖維素酶液，加入1.9mL羧甲基纖維素鈉溶液，混勻，置于40°C水浴鍋中保溫30min后,立即加入1.5mL DNS試劑,沸水浴5min,取出冷卻至室溫,用蒸懼水稀釋至25mL,顛倒混勻后，于540nm處測(cè)定吸光值，以0.1mL煮沸的纖維素酶液加1.9mL底物羧甲基纖維素鈉溶液做對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。
[0092]纖維素酶活力計(jì)算:根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CMC-Na被羧甲基纖維素酶分解的葡萄糖含量，I個(gè)酶活單位定義為每分鐘生成Iumol葡萄糖所需要的酶量。
[0093]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到大伏革菌菌株菌株CGMCCN0.8653纖維素酶活力為3494.12U/L ;而大伏革菌生物制劑Rotstop-F纖維素酶活力僅為3332.65U/L。
[0094]由于大伏革菌分泌的胞外纖維素酶能夠降解樹木細(xì)胞壁纖維素結(jié)構(gòu)，達(dá)到快速定殖于伐樁的目的，因此，本發(fā)明的大伏革菌CGMCC N0.8653對(duì)于引起中國(guó)針葉樹根腐病的小孔異擔(dān)子菌具有明顯的抑制作用。
[0095]實(shí)施例4大伏革菌生防制劑的制備
[0096]I)將大伏革菌(Phlebiopsis gigantea) CGMCC N0.8653在固體培養(yǎng)基上活化,取適量活化菌種接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，在28±2°C條件下培養(yǎng)3周，待大伏革菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水沖洗麥芽汁平板培養(yǎng)基上的孢子，并用血球計(jì)數(shù)板標(biāo)定到IO4個(gè)大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子懸浮液；[0097]上述固體培養(yǎng)基的配制如下:葡萄糖10.0g，麥芽浸粉20.0g,瓊脂粉18.0g,ΚΗ2Ρ043.0g，加水至 1000mL, pH 自然;
[0098]麥芽汁培養(yǎng)基的配制如下:麥芽浸粉20.0g,瓊脂粉18.0g, KH2P043.0g,加水至1000mL, pH 自然。
[0099]2)將3mL大伏革菌孢子懸浮液與7mL蔗糖溶液(aw0.854，粘度為816mPa.s)混合后，密封于聚乙烯小袋中，即得。
[0100]實(shí)施例5大伏革菌生防制劑的制備
[0101]I)大伏革菌孢子懸浮液的制備方法與實(shí)施例1相同；
[0102]2)將大伏革菌孢子懸浮液濃縮后，自然晾干,制得大伏革菌孢子粉；
[0103]3)將大伏革菌孢子粉 與硅藻土、甲基纖維素、硝酸鉀、十二烷基苯磺酸鈉混合，制成可濕性粉劑；
[0104]其中，各組分的重量份配比為:大伏革菌孢子粉1-10、硅藻土 80-90、甲基纖維素
0.5-1、硝酸鉀0.1-1、十二烷基苯磺酸鈉8-10。
[0105]4)將可濕性粉劑密封于箔襯袋中，即得。
[0106]實(shí)施例6大伏革菌生防制劑的制備
[0107]I)大伏革菌孢子和菌絲液的制備:
[0108]將大伏革菌(Phlebiopsis gigantea) CGMCC N0.8653在固體培養(yǎng)基上活化,取適量活化菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為28±2°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm條件下培養(yǎng)7天，得到大伏革菌發(fā)酵液；
[0109]用勻漿機(jī)將大伏革菌發(fā)酵液勻漿，得到大伏革菌孢子和菌絲液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>
[0110]其中，所述液體培養(yǎng)基的配制如下:葡萄糖10.0g/L，麥芽浸粉20.0g/L，KH2P043.0g/L, pH 自然；
[0111]2)將5mL大伏革菌孢子和菌絲液接種于5g滅菌后的山毛櫸木屑中，待大伏革菌生長(zhǎng)到一定程度后，密封于聚乙烯小袋中，即得。
[0112]實(shí)施例7大伏革菌生防制劑的實(shí)施方法
[0113]將實(shí)施例4制備的大伏革菌生防制劑IOmL溶解于10L自來水中，制成生防治劑稀釋液；
[0114]在生防治劑稀釋液中加入少量水溶性染料，用于標(biāo)記噴灑面積；
[0115]將添加了染料的生防治劑稀釋液噴灑于伐樁上。
[0116]其中，每平方米伐樁上噴灑稀釋后的大伏革菌制劑1±5% L，噴灑時(shí)間為采伐后24h內(nèi)，直到采伐樹樁水分飽和為止,伐樁噴灑面積為100%，噴灑季節(jié)為每年4-10月。
[0117]實(shí)施例8大伏革菌生防制劑的實(shí)施方法
[0118]將實(shí)施例4制備的大伏革菌生防制劑IOmL溶解于10L自來水中，制成生防治劑稀釋液；
[0119]在生防治劑稀釋液中加入少量水溶性染料；
[0120]將添加了染料的生防治劑稀釋液噴灑在電鋸鏈條上，用電鋸伐樹的同時(shí)接種伐樁。
[0121]其中，每平方米伐樁上接種稀釋后的大伏革菌制劑1±5%L，接種季節(jié)為每年4-10 月。[0122]實(shí)施例9大伏革菌生防制劑的實(shí)施方法
[0123]稱取5g實(shí)施例5或6制備的大伏革菌生防治劑，加入5L自來水，攪拌混勻后噴灑于伐樁上。
[0124]其中，每平方米伐樁上噴灑稀釋后的大伏革菌制劑1±5% L，噴灑時(shí)間為采伐后24h內(nèi)，直到 采伐樹樁水分飽和為止,木樁噴灑面積為100%，噴灑季節(jié)為每年4-10月。
【權(quán)利要求】
1.一種大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)，其特征在于，在CGMCC的保藏號(hào)為:CGMCCN0.8653。
2.如權(quán)利要求1所述的大伏革菌在防治中國(guó)針葉樹根腐病上的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大伏革菌以生防制劑的形式實(shí)施。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子懸浮液與蔗糖溶液混合后，密封于聚乙烯小袋中，即得。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子懸浮液制成可濕性粉劑，密封于箔襯袋中，即得。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大伏革菌孢子懸浮液通過如下步驟制備而成: 將大伏革菌供試菌株在固體培養(yǎng)基上活化； 取適量活化菌種接種于麥芽汁平板培養(yǎng)基上，在28±2°C條件下培養(yǎng)2-4周； 待大伏革菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水沖洗麥芽汁平板培養(yǎng)基上的孢子，并用血球計(jì)數(shù)板標(biāo)定到1.0X IO4-L 5 X IO4個(gè)大伏革菌孢子/mL，制得大伏革菌孢子懸浮液。
7.如權(quán)利要求6所 述的應(yīng)用，其特征在于,所述麥芽汁培養(yǎng)基的成分包括麥芽浸粉、瓊脂粉、KH2PO4、無菌水，其中，每升麥芽汁培養(yǎng)基中，所述麥芽浸粉為20.0±2g，瓊脂粉為18.0 ±2g、KH2PO4 為 3.0±0.5g，其余為無菌水。
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生防制劑通過如下步驟制備而成:將大伏革菌孢子和菌絲液接種于滅菌后的山毛櫸木屑中，密封于聚乙烯小袋中，即得。
9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大伏革菌實(shí)施對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病的方法為:將大伏革菌生防制劑溶解稀釋后噴灑于伐樁上。
10.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大伏革菌實(shí)施對(duì)中國(guó)針葉樹根腐病的方法為:將大伏革菌生防制劑溶解稀釋后噴灑到電鋸鏈條上，用電鋸伐樹的同時(shí)接種伐樁。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103923844SQ201410162801
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】李杏春, 崔寶凱, 何雙輝, 戴玉成 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)