專利名稱：玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬草酸脫羧酶的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘
導(dǎo)草酸脫羧酶的方法。
背景技術(shù)：
草酸脫羧酶可以催化草酸脫羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法檢測(cè)草酸含量，
降解工業(yè)廢水中草酸鹽，制備低草酸含量食品以及降低人體內(nèi)草酸濃度等方面具有廣闊的
應(yīng)用前景。彩絨革蓋菌作為生產(chǎn)草酸脫羧酶的重要菌種，如何降低其培養(yǎng)成本，大量生產(chǎn)菌
絲體，并誘導(dǎo)菌絲體合成草酸脫羧酶是一項(xiàng)重要課題。由于碳元素是生物體內(nèi)含量最多的
元素，因此碳源是培養(yǎng)基中用量最大的一種，占生物產(chǎn)品總成本的比例較高，所以通過利用
低成本碳源替代目前使用的純凈葡萄糖能大幅度降低微生物的培養(yǎng)成本。 秸稈是農(nóng)作物收割后的剩余物，作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，農(nóng)村中每年大量的秸稈
主要用來(lái)燒火，或者粉碎后給家畜做飼料用。雖然焚燒后的秸稈可以撒在田里作為肥料，但
在焚燒過程中產(chǎn)生的氣體會(huì)導(dǎo)致溫室效應(yīng)的增加，而且產(chǎn)生的煙塵也會(huì)造成空氣污染。所
以，將秸稈水解后獲得的水解液來(lái)作為培養(yǎng)工業(yè)微生物的碳源，不僅可以降低微生物培養(yǎng)
成本，減輕焚燒對(duì)環(huán)境的污染，而且提高了秸稈應(yīng)用附加值，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效
.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫 羧酶的方法，該方法簡(jiǎn)單，成本低，效率高；底物誘導(dǎo)產(chǎn)草酸脫羧酶不受抑制，產(chǎn)酶量穩(wěn)定。
本發(fā)明的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，包括
(1)將粉碎的玉米稈按照固液比為lg : 5-15mL用酸溶液浸泡10_20h，在 100-15(TC條件下水解反應(yīng)20-60min，離心去除殘?jiān)螅玫接衩锥捤庖?，并用DNS法測(cè) 定水解液中還原糖含量(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖計(jì))； (2)按7-30g/L的還原糖量，將玉米稈水解液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為 4. 0-5. 0，過濾除去雜質(zhì)，并添加氮源和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲得發(fā)酵培養(yǎng)基，檢查并調(diào)節(jié)pH 值至4. 0-5.0，滅菌后備用; (3)取2-3片直徑為9 llmm含菌絲體的瓊脂培養(yǎng)基，接入液體種子培養(yǎng)基，在 3(TC靜置培養(yǎng)4-6天；待菌絲體在液體培養(yǎng)基上方形成白色菌絲群但尚未浮出水面時(shí)，將 菌絲體和培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移到含有無(wú)菌玻璃珠的容器中，對(duì)菌絲體進(jìn)行震蕩破碎獲得含有菌
絲碎片的懸濁液，以3-15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在20-3(TC和100-250rpm轉(zhuǎn)速條件 下培養(yǎng)4-6天； (4)待菌絲球形成時(shí)，加入終濃度為5-20mM的草酸誘導(dǎo)草酸脫羧酶的產(chǎn)生，培養(yǎng) 0. 5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經(jīng)液氮冷凍后研磨破碎，用0. 2M，pH 3. 7的醋酸緩沖液提取 菌絲碎片，離心去除殘?jiān)?，所得上清液即為草酸脫羧酶粗酶液?br> 所述步驟(1)中的酸為硫酸、鹽酸、醋酸，質(zhì)量百分比濃度為0. 5% -8% ;
所述步驟(2)用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值； 所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中組分為玉米稈水解物中的還原糖7-30g(以葡萄 糖為標(biāo)準(zhǔn)糖計(jì))，蛋白胨3. Og， KH2P041. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g， MgS04 7H20 0. 5g以及微 量元素lml，用水定容至1L; 所述的微量元素的組分為:FeS04 *7H20 10g，MnS04 *H20 1. Og， ZnS04 *7H20 1. Og/， CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L ; 所述步驟(3)中的液體種子培養(yǎng)基，以葡萄糖代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原糖，其余 組分含量與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。 本發(fā)明通過水解玉米稈獲得培養(yǎng)彩絨革蓋菌生長(zhǎng)的碳源，并用底物草酸誘導(dǎo)菌絲
體合成草酸脫羧酶。 (1)本發(fā)明利用玉米稈水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)彩絨革蓋菌的碳源，方法簡(jiǎn)單，易于操 作； (2)本發(fā)明使用的的玉米稈產(chǎn)量大，成本低，作為生產(chǎn)碳源的原料價(jià)格低廉；且碳 源的制備可控性強(qiáng)，含糖量穩(wěn)定； (3)與傳統(tǒng)培養(yǎng)基碳源——葡萄糖相比，以該低值碳源生產(chǎn)彩絨革蓋菌獲得的菌 絲體生物量大，轉(zhuǎn)化率高。 (4)與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，以該低值碳源培養(yǎng)菌體時(shí)，底物誘導(dǎo)產(chǎn)草酸脫羧酶不受抑 制，產(chǎn)酶量穩(wěn)定。


圖1稻稈水解液培養(yǎng)基(初始pH 5. 0)生產(chǎn)的菌絲體干重隨發(fā)酵時(shí)間的變化；+ 水解液培養(yǎng)基+葡萄糖培養(yǎng)基； 圖2玉米稈水解液培養(yǎng)基(初始pH 5. 0)中利用草酸誘導(dǎo)合成的酶活力；+水 解液培養(yǎng)基+葡萄糖培養(yǎng)基； 圖3玉米稈水解液培養(yǎng)基(初始pH 5. 0)中添加草酸誘導(dǎo)后提取的菌絲體蛋白含 量；+水解液培養(yǎng)基+葡萄糖培養(yǎng)基； 圖4玉米稈水解液培養(yǎng)基(初始pH 5. 0)中添加草酸誘導(dǎo)后的還原糖含量；+ 水解液培養(yǎng)基+葡萄糖培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。 實(shí)施例1 玉米稈水解液生產(chǎn)彩絨革蓋菌(培養(yǎng)基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 12ml的固液比加入濃度為5%的硫酸溶液，玉
4米稈粉經(jīng)稀硫酸溶液浸泡10小時(shí)后，放置于高壓蒸煮鍋中，在12rC下，反應(yīng)30min，過濾除 去玉米稈殘?jiān)@得玉米稈水解液備用。用DNS法測(cè)定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖)，4t:條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?0mL培養(yǎng)基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計(jì))的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 10g/L)。培養(yǎng)基配制完成 后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至5. 0，滅菌后備用。 取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約10mm含菌絲體的固體培養(yǎng)基薄片，取 2-3片加入液體種子培養(yǎng)基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養(yǎng)基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進(jìn)行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按12%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1-5天，稱取菌絲體絕干重。發(fā)現(xiàn) 玉米稈水解液培養(yǎng)基的菌絲體產(chǎn)量高于對(duì)照培養(yǎng)基(葡萄糖)菌絲體產(chǎn)量，且處于上升趨 勢(shì)(見圖1)。
實(shí)施例2 玉米稈水解液生產(chǎn)彩絨革蓋菌(培養(yǎng)基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 8ml的固液比加入濃度為3%的硫酸溶液，玉 米稈粉經(jīng)稀硫酸溶液浸泡10小時(shí)后，放置于高壓蒸煮鍋中，在15(TC下，反應(yīng)60min，過濾除 去玉米稈殘?jiān)?，獲得玉米稈水解液備用。用DNS法測(cè)定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖)，4t:條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｃ?0mL培養(yǎng)基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計(jì))的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培養(yǎng)基配制完成 后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至5. 0，滅菌后備用。 取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約10mm含菌絲體的固體培養(yǎng)基薄片，取 2-3片加入液體種子培養(yǎng)基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養(yǎng)基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進(jìn)行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1-5天，稱取菌絲體絕干重。發(fā)現(xiàn) 菌絲體產(chǎn)量的變化趨勢(shì)與實(shí)施例1類似，同樣高于對(duì)照培養(yǎng)基(葡萄糖)菌絲體產(chǎn)量，且處
于上升趨勢(shì)。
實(shí)施例3 玉米稈水解液生產(chǎn)彩絨革蓋菌(培養(yǎng)基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 15ml的固液比加入濃度為8%的硫酸溶液，玉 米稈粉經(jīng)稀硫酸溶液浸泡10小時(shí)后，放置于高壓蒸煮鍋中，在IO(TC下，反應(yīng)60min，過濾除 去玉米稈殘?jiān)@得玉米稈水解液備用。用DNS法測(cè)定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖)，4t:條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?0mL培養(yǎng)基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計(jì))的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培養(yǎng)基配制完成 后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至5. 0，滅菌后備用。
取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約lOmm含菌絲體的固體培養(yǎng)基薄片，取 2-3片加入液體種子培養(yǎng)基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養(yǎng)基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進(jìn)行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1-5天，稱取菌絲體絕干重。發(fā)現(xiàn) 菌絲體產(chǎn)量的變化趨勢(shì)與實(shí)施例1類似，同樣高于對(duì)照培養(yǎng)基(葡萄糖)菌絲體產(chǎn)量，且處
于上升趨勢(shì)。
實(shí)施例4 玉米稈水解液生產(chǎn)菌絲體并誘導(dǎo)合成草酸脫羧酶(培養(yǎng)基初始pH值5. 0)
任取實(shí)施例1 3培養(yǎng)4 6天的菌絲，加入終濃度為5-20mM的草酸，誘導(dǎo)0. 5_6 天后，收取菌絲體，保存發(fā)酵液，將菌絲體液氮冷凍研磨破碎后，用0. 2M， pH 3. 7的醋酸緩 沖液提取菌絲碎片，離心去除殘?jiān)锨寮礊榇置敢?。殘?jiān)嬷两^干稱重，上清測(cè)定草酸脫 羧酶活力(圖2)及酶液蛋白含量(圖3)，發(fā)酵液測(cè)定殘留還原糖濃度(圖4)。
對(duì)照組采用葡萄糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法相同，在培養(yǎng)彩絨革蓋菌4天后，加入終濃度 為5-20mM的草酸，誘導(dǎo)0. 5至5天后，收取菌絲體，保存發(fā)酵液，將菌絲體液氮冷凍研磨破 碎后，用0. 2M， pH 3. 7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心去除殘?jiān)?，上清即為粗酶液。殘?jiān)?烘至絕干稱重，上清測(cè)定草酸脫羧酶活力(圖2)及酶液蛋白含量(圖3)，發(fā)酵液測(cè)定殘留 還原糖濃度(圖4)。
權(quán)利要求
一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，包括(1)將粉碎的玉米稈按照固液比為1g∶5-15ml用酸溶液浸泡10-20h，在100-150℃條件下水解反應(yīng)20-60min，離心去除殘?jiān)?，得到玉米稈水解液，并用DNS法測(cè)定水解液中還原糖含量；(2)按7-30g/L的還原糖量，將玉米稈水解液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為4.0-5.0，過濾除去雜質(zhì)，并添加氮源和無(wú)機(jī)鹽獲得發(fā)酵培養(yǎng)基，再檢查并調(diào)節(jié)pH值至4.0-5.0，滅菌后備用；(3)取2-3片直徑為9～11mm含菌絲體的瓊脂培養(yǎng)基，接入液體種子培養(yǎng)基，在30℃靜置培養(yǎng)4-6天；待菌絲體在液體培養(yǎng)基上方形成白色菌絲群但尚未浮出水面時(shí)，將菌絲體和培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移到含有無(wú)菌玻璃珠的容器中，對(duì)菌絲體進(jìn)行震蕩破碎獲得含有菌絲碎片的懸濁液，以3-15％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在20-30℃和100-250rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)4-6天；(4)待菌絲球形成時(shí)，加入終濃度為5-20M的草酸誘導(dǎo)草酸脫羧酶的產(chǎn)生，培養(yǎng)0.5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經(jīng)液氮冷凍后研磨破碎，用0.2M，pH 3.7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心去除殘?jiān)?，所得上清液即為草酸脫羧酶粗酶液?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(1)中的酸為硫酸、鹽酸或醋酸，質(zhì)量百分比濃度為0. 5% -8%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(2)用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中組分為玉米稈水解物中的還原糖7-30g，蛋白 胨3. Og， KH2P04 1. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g，MgS04 7H20 0. 5g以及微量元素lml，用水定容 至1L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述的微量元素的組分為FeS04 *7H20 10g，MnS04 *H20 1. 0g，ZnS04 *7H20 1. Og， CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(3)中的液體種子培養(yǎng)基，以葡萄糖代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的還原糖，其余 組分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米稈碳源培養(yǎng)彩絨革蓋菌誘導(dǎo)草酸脫羧酶的方法，包括(1)將粉碎的玉米稈用酸溶液浸泡，在100-150℃條件下水解；(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為4.0-5.0；(3)取菌絲體接入液體種子培養(yǎng)基，待形成白色菌絲群但尚未浮出水面時(shí)，將菌絲體和培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移到含有無(wú)菌玻璃珠的容器中，震蕩破碎，以3-15％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)培養(yǎng)4-6天，加入草酸，培養(yǎng)0.5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經(jīng)液氮冷凍后研磨破碎，用醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于操作，成本低，且碳源的制備可控性強(qiáng)，含糖量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N9/88GK101735995SQ20091020093
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者曹張軍, 楊光, 楊雪霞, 洪楓 申請(qǐng)人:東華大學(xué)