專利名稱：花椰菜雜交種dna指紋圖譜的建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花椰菜種子鑒定技術(shù)，具體地說是花椰菜雜交種DNA指紋圖譜的建立 方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，我國生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的花椰菜(Brassica oleracea L. var. botrytisL)品 種許多為雜種一代。雜種一代能綜合親本的許多優(yōu)良性狀，經(jīng)濟效益較好。但是在制種過程中會由于管理措施不當(dāng)和自交不親和性本身的缺陷而常常產(chǎn)生 自交種子，即假雜種，導(dǎo)致種子純度下降。因此，提高雜交種純度是雜種優(yōu)勢利用研究領(lǐng)域 的重要課題。目前，品種鑒定和種子純度分析方法大致有三種，即大田形態(tài)、生化標(biāo)記和DNA 指紋圖譜鑒定法。傳統(tǒng)的大田鑒定法以種子、幼苗、葉、花、果實、花粉等組織器官的顏色、形 態(tài)等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀測指標(biāo)，在生產(chǎn)實踐中雖然是一種較為可行的方法，但大田鑒 定需要額外占用土地，周期長、花費大，不僅受季節(jié)限制，而且很多性狀的表現(xiàn)受栽培措施 及環(huán)境因子的影響，鑒定者的觀察經(jīng)驗也制約著鑒定的準(zhǔn)確性。大田鑒定最大的缺陷是不 能及時提供種子純度信息，不能在種子大量交易前提供有關(guān)種子的質(zhì)量信息，對種子質(zhì)量 不能起到預(yù)先監(jiān)督的作用。生化鑒定方法包括蛋白質(zhì)電泳和同工酶電泳，已得到日益廣泛 的應(yīng)用，但不能完全顯示品種間的多態(tài)性，難以對親緣關(guān)系較近的品種進行有效的區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種花椰菜雜交種DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用，以克服 現(xiàn)有技術(shù)存在的不足。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的DNA指紋圖譜鑒定法是以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記方法，可以彌補和克服 在種子純度的形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶、種子蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題。本發(fā)明利用 RAPD、SRAP技術(shù)構(gòu)建了花椰菜雜交種與其親本的DNA指紋圖譜，可以為花椰菜雜交種的鑒 定和純度檢測提供科學(xué)依據(jù)，進而保護生產(chǎn)者和使用者的合法權(quán)益。本發(fā)明的花椰菜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜，是由“1”和“0”組 成的數(shù)據(jù)。使用引物S140，花椰菜雜交種母本、Fl和父本的擴增數(shù)據(jù)分別為 001110111111、001111111111 和 110111111111。使用引物 M1-E18，數(shù)據(jù)分別為 11111111110111、11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，數(shù)據(jù)分別為 111111111111110011001,111111111111111111111 和 111011111101110110110。其中所述 數(shù)字“ 1，，表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數(shù)字“0”表示在某個位置上沒有擴增條帶 存在。所說的花椰菜雜交種和親本可以采用上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所公開銷售的 花椰菜DNA指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟
1)提取及純化花椰菜基因組的DNA ；2)用獲得的花椰菜DNA為模板進行RAPD、SRAP分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無構(gòu)建供試材料DNA 指紋圖譜。其中所述花椰菜雜交種及其親本都有其特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開 來。所述RAPD、SRAP擴增中采用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核 苷酸引物。RAPD擴增采用的引物為S140:GGTCTAGAGG。SRAP擴增采用的引物為Ml TGAGTCCAAACCGGATA, M8 :TGAGTCCTTTCCGGTGC，E18 :GACTGCGTACGAATTCCT。本發(fā)明的DNA指紋圖譜可以應(yīng)用于花椰菜雜交種種子純度的鑒定。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明創(chuàng)建了花椰菜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜，公開了用DNA指紋分析 技術(shù)對花椰菜種子鑒定的研究結(jié)果，其建立方法能從遺傳本質(zhì)上對花椰菜種子進行鑒定， 因此準(zhǔn)確、可靠。2、采用本發(fā)明，在對花椰菜種子樣品進行真實檢測時，用目前廣泛應(yīng)用的快速、微 量DNA提取法提取待測樣品的DNA，用提取的DNA作為模板，進行RAPD、SRAP分析，在幾個 小時內(nèi)就可以知道該樣品的DNA指紋，因此，就能迅速判斷出它的真實性。3、由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來比較直觀、易懂；并由于轉(zhuǎn) 換成了數(shù)碼形式，便于計算機識讀和分析。


附圖為本發(fā)明建立的RAPD、SRAP指紋圖譜，其中M為DGL 2000DNA標(biāo)識；1為花 椰菜雜交種母本；2為花椰菜雜交種；3為花椰菜雜交種父本；箭頭標(biāo)出的為互補型特征片 段。A、B、C依次為引物M8-E18、M1-E18、和S140的擴增電泳圖。
具體實施例方式實施例1本實施例采用SDS法提取花椰菜品種“早花60”及其親本的基因組DNA，通過RAPD、 SRAP分子標(biāo)記方法構(gòu)建其DNA指紋圖譜用于種子純度鑒定。具體操作如下1、選用的試驗材料材料為花椰菜雜交種“早花60”及其親本。2、花椰菜DNA的提取及純化按如下程序提取各個花椰菜材料的基因組DNA 取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提取液(IOOmM Tris pH 8. 0,50mM EDTA, 500mM NaCl，1. 5% SDS)，65°C情況下 30 分鐘，不時顛倒混勻，加 2. 5ml 5M乙酸鉀冰浴10分鐘，加· 5ml氯仿，顛倒混勻，IOOOOrmp離心8分鐘，取上清移入 新管，加2/3體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，-20°C置1-2小時，挑出絮狀白色DNA，70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于IOOul (或適量)TE中，并在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，用標(biāo)準(zhǔn)λ DNA作對照， 估算花椰菜DNA樣品的濃度，獲得高純度花椰菜DNA。3、用獲得的高純度花椰菜DNA為模板進行分子標(biāo)記分析
RAPD 擴增反應(yīng)采用 20yL 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgC12 2. 0 μ 1,10XPCR Buffer 2. 0μ 1, lOmmol/L dNTP 0. 5 μ l,5U/y 1 Taq E 0. 2 μ 1，0. 1 μ mol/L 引物 3 μ 1， lOng/μ 1模板DNA 3 μ 1，滅菌雙蒸水9. 3 μ 1。擴增程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 lmin，37°C退火 lmin，72°C延伸 1. 5min，40 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin 后 4°C保存。PCR 產(chǎn)物 在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳1.5h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察并 拍照分析。SRAP 擴增反應(yīng)采用 20yL 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgC12 2. OyL, 10XPCR Buffer 2. 0μ L, 10mmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· 1 μ mol/L 弓 |物 各3. 0 μ L，IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,滅菌雙蒸水6. 4 μ L，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增 程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，5個循環(huán)；94°C 變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin后4°C保存。擴增 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物使用6%聚丙烯酰胺膠電 泳1. 5小時，采用快速銀染法染色定影后拍照。4、引物篩選使用150個RAPD引物和30對SRAP引物對樣品DNA進行PCR擴增，其中有118個 RAPD引物和全部的30對SRAP引物能擴增出清晰的條帶，但大多數(shù)引物的擴增結(jié)果在雙 親及雜交種之間是一致的，不能起到鑒別的作用。最終篩選出2對SRAP引物(M8-E18和 M1-E18)可將雙親和Fl區(qū)分出來，另外還有1個RAPD引物(S140)可以將“早花60”的雙 親和Fl區(qū)分開(見圖)。其中引物組合M1-E8在約650bp、250bp、200bp、190bp、170bp和 150bp處擴增出6條雙親的互補特征帶，在約400bp處只在Fl擴增出特異條帶；引物組合 E18-M1在約500bp處擴增出Fl的特異帶。由此可見，3個(對)引物均能對“早花60”的 雙親和Fl進行有效鑒別。5、數(shù)字指紋的建立根據(jù)上述兩種分子標(biāo)記指紋圖譜，以1和0分別代表某個等位基因位點擴增DNA 條帶的有無，按照從上到下即由大片段向小片段的讀帶方向，將分子標(biāo)記指紋圖譜轉(zhuǎn)換為 由1和0組成的字符串，即構(gòu)成數(shù)字指紋。使用引物S140，“早花60”花椰菜的母本、雜交種和 父本的擴增數(shù)據(jù)分別為001110111111,001111111111和110111111111。使用引物M1-E18， 數(shù)據(jù)分別為 11111111110111,11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，數(shù)據(jù) 分別為 111111111111110011001、111111111111111111111 和 111011111101110110110。實施例2本發(fā)明的DNA指紋圖譜用于“早花60”種子純度的鑒定從制種基地生產(chǎn)的“早花60”雜交種中隨機抽取50-80個單株，用微量DNA提取法 提取各單株樣品的DNA，用提取的DNA作為模板，用相應(yīng)的引物對其進行PCR擴增和電泳分 析。如利用S 140引物分析查出的單株DNA指紋是“001111111111”即為“早花60”真雜種 株，DNA指紋是“001110111111”或“110111111111”即為“早花60”親本自交株，也就是假 雜種株。再如利用M8-E18引物分析查出的單株DNA指紋是“111111111111111111111”即為 “早花 60”真雜種株，DNA 指紋是“111111111111110011001”或“111011111101110110110” 即為“早花60”親本自交株，也就是假雜種株。然后用假雜種株數(shù)除以總分析的株數(shù)，即可 獲得制種基地生產(chǎn)的花椰菜雜交種的純度，較大田種植調(diào)查純度既省時又便捷，可以為花椰菜雜交種子的銷售及時提供純度信息。如果鑒定的純度低于85%，就不能夠作為種子進 行銷售，以避免假種子傷農(nóng)事件的發(fā)生。如果鑒定的種子純度高于95%以上，就可以作為精 品種子銷售，優(yōu)質(zhì)優(yōu)價，使農(nóng)民和種子經(jīng)銷商均獲得好的經(jīng)濟效益。
權(quán)利要求
1.花椰菜DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟1)提取及純化花椰菜基因組的DNA；2)用獲得的花椰菜DNA為模板進行RAPD、SRAP分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無構(gòu)建供試材料DNA指紋 圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，花椰菜雜交種及其親本的DNA指紋圖 譜，是由“ 1”和“0”組成的數(shù)據(jù)，使用引物S140，花椰菜雜交種母本、雜交種和父本的擴增 數(shù)據(jù)分別為 001110111111,001111111111 和 110111111111。使用引物 M1-E18，數(shù)據(jù)分別 為 11111111110111、11111111111111 和 11111111100111。使用引物 M8-E18，數(shù)據(jù)分別為 111111111111110011001,111111111111111111111 和 111011111101110110110。其中所述 數(shù)字“ 1，，表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數(shù)字“0”表示在某個位置上沒有擴增條帶 存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD擴增采用的引物為S140 GGTCTAGAGG。SRAP 擴增采用的引物為 Ml :TGAGTCCAAACCGGATA，M8 :TGAGTCCTTTCCGGTGC 和 E18 :GACTGCGTACGAATTCCT。
4.權(quán)利要求2所述的方法建立的DNA指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于，用于花椰菜雜交種 種子純度的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花椰菜雜交種及其親本DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。建立方法包括1、花椰菜DNA的提取及純化；2、用獲得的高純度花椰菜DNA為模板進行RAPD、SRAP分析；3、選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜；在DNA指紋圖譜中花椰菜雜交種及其親本都有特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開來。由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來比較直觀、易懂；并將其轉(zhuǎn)換成數(shù)碼表示形式，便于計算機識讀和分析。本發(fā)明可應(yīng)用于花椰菜雜交種的種子純度鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK102108395SQ20091020083
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者繆體云, 薄天岳, 陳燁麗, 陳錦秀 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？茍@種子有限公司, 上海科立特農(nóng)科(集團)有限公司