專利名稱：中藥中龜源性成分的pcr鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及中藥的鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，非常適合于深度加工型龜甲源性產(chǎn)品，尤其是針對因深 度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的龜甲膠，操作簡單，可用于產(chǎn)品檢驗(yàn)部門對市場假 冒偽劣的該種中草藥的靈敏快速鑒定。
背景技術(shù)：
龜甲，即龜科動物烏龜(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲，屬于傳統(tǒng)名貴中藥。 據(jù)最新版的中國藥典記載，服用龜甲能夠滋陰潛陽，益腎強(qiáng)骨，養(yǎng)血補(bǔ)心。近些年來，隨著生 物學(xué)水平的提高，龜甲的相關(guān)研究也不斷深入。有研究表明，龜甲粉末及其提取物不僅能夠 增強(qiáng)肝功能、緩解壓力，還具有抗癌以及調(diào)節(jié)免疫抵抗力的功效。以龜甲為原料而制成的兩 類產(chǎn)品龜苓膏和龜甲膠在整個(gè)中藥市場上占據(jù)著重要的位置。據(jù)2005年版中國藥典記載，龜甲膠是以龜甲為原料，經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體 膠，性成、甘、涼，歸肝、腎、心經(jīng)。能夠滋陰、養(yǎng)血、止血，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝 酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等。長期服用龜甲膠還有利于增強(qiáng)機(jī)體自身調(diào)節(jié)，能夠延年益壽， 也利于陰虛陽亢患者的身體康復(fù)。隨著生活水平的不斷提高，與阿膠類似，龜甲膠也成為人 們進(jìn)補(bǔ)的首選之一。由于龜甲自身比較名貴，藥用價(jià)值顯著，并且龜肉也常常用于烹飪各類補(bǔ)品供人 們食用，近些年來對各種龜類的捕殺現(xiàn)象十分嚴(yán)重，甚至于某些龜類品種瀕臨滅絕。因此， 龜甲原料的供應(yīng)非常有限，并且價(jià)格高昂，也直接影響到了龜甲膠的生產(chǎn)。在龜甲膠市場上 存在某些假冒偽劣產(chǎn)品，其制作原料并非龜甲，而是由其他動物雜皮、碎骨代替，包括豬皮、 牛皮，甚至病死動物之皮，臟皮、爛皮等。該類假冒偽劣產(chǎn)品一旦成形，無論外觀、色澤、氣味 都與正品龜甲膠及其相似，真?zhèn)坞y辨。服用這些偽品不僅沒有任何療效，還很可能對身體有 害，后果十分嚴(yán)重。對于龜甲或龜甲膠的真?zhèn)舞b別，研究人員也已做了大量嘗試，包括基于光譜學(xué) 分析的方法，如衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜法(ATR-FTIR) (Paris C，Lecomte S， Coupry C.ATR-FTIR spectroscopy as a way to identify natural protein-based materials,tortoiseshell and horn, from their protein-based imitation, galalith. Spectrochim Acta A. 2005,62 :532_538)、拉曼光譜法(FT-Raman)等(Edwards HGM, Hunt DE,Sibley MG. FT-Raman spectroscopic study of keratotic materials :horn,hoof and tortoiseshell. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 1998,54A 745-757) UR 基于DNA分子標(biāo)記的分析方法，包括利用線粒體DNA的細(xì)胞色素b基因(Hsieh HM, Huang LH, TsaiLC, Liu CL, Kuo YC, Hsiao CT, Linacre A, Lee JCI. Species identification of Kachugatecta using the cytochrome b gene. J Forensic Sci. 2006,51 :52_56)禾口 12S rRNA 基因等(Lo CF, Lin YR, Chang HC, Lin JH. Identification of turtle shell and its preparations byPCR-DNA sequencing method. J Food Drug Anal. 2006,14 153-158)。光譜學(xué)分析的方法在處理不同深加工程度樣品時(shí)，需要對儀器的檢測參數(shù)作出 相應(yīng)的調(diào)整，操作比較繁瑣，實(shí)用性較差。而已經(jīng)報(bào)道的基于DNA水平的檢測方法大多基 于線粒體DNA，拷貝數(shù)有限，比較適合于DNA保存比較完整，或者輕度破壞的樣品的PCR檢 測。然而對于龜甲膠這類經(jīng)過高溫高壓長時(shí)間作用而導(dǎo)致DNA含量極少，片段極短的深加 工產(chǎn)品，這些方法也略顯不足，有報(bào)道表明，利用基于12S rRNA基因的PCR方法無法鑒別 龜甲膠(Hsieh HM, Huang LH, Tsai LC, Liu CL, Kuo YC, Hsiao CT, Linacre A, Lee JCI. Species identification of Kachuga tecta using the cytochrome b gene. J Forensic Sci. 2006,51 52-56)。事實(shí)上，到目前為止，國內(nèi)外都沒有出現(xiàn)任何有效的、大家公認(rèn)的、能 夠用于龜甲膠真?zhèn)舞b別的方法。 SINE序列是在高等真核生物基因組中廣泛存在的短分散重復(fù)序列，拷貝數(shù)極高， 其拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于細(xì)胞器DNA (包括線粒體DNA、葉綠體DNA等)以及核糖體DNA，并且具有良 好的種屬特異性，大小適中，能夠用于某些物種的特異性鑒別。因其具有拷貝數(shù)高的特點(diǎn)， 該序列常常被用于微量DNA檢測領(lǐng)域，例如古DNA研究、法醫(yī)鑒定學(xué)研究等。Pol III/SINE序列是廣泛存在于隱頸亞目(Cryptodira)動物基因組上的一類 SINE序列，屬于高度重復(fù)序列，包括陸龜、海龜、鱉等。在不同的龜類種屬間，該SINE序 列存在 9 種亞型，包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 以 及 CryIIE(Sasaki, Τ. , Takahashi, K. , Nikaido, Μ. , Miura, S. , Yasukawa, Y. andOkada, N. 2004. First application of the SINE (Short Interspersed Repetitive Element) method to infer phylogenetic relationships in reptiles -.an example from the turtlesuperfamiIy testudinoidea. Mol. Biol. Evo1. 21 :705_715.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種中藥中龜源性成分 的PCR鑒定方法，該P(yáng)CR鑒定方法操作簡單、靈敏快速、成本低、能有效鑒定龜源性產(chǎn)品的真 偽，特別適用于鑒定因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的深度加工型龜甲膠的真 偽，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特點(diǎn)是，包括下列步驟a)提取所述中藥中的DNA ；b)用根據(jù)隱頸亞目基因組SINE序列設(shè)計(jì)的特異性引物對所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)電泳所述擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增條帶，如 果所述DNA擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥源自隱頸亞目動物，含有龜源性成分；如 果所述DNA沒有擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥并不源自隱頸亞目動物，也不含有 任何龜源性成分。較佳地，在步驟a)中，所述中藥是深度加工型中藥。更佳地，所述深度加工型中藥是深度加工型龜甲源性中藥。更進(jìn)一步地，所述深度加工型龜甲源性中藥是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少， 片段破壞極其嚴(yán)重的龜甲膠。
更佳地，采用消化液和蛋白酶預(yù)處理所述深度加工型中藥，再采用針對短片段DNA 的抽提方法提取所述DNA。
較佳地，所述隱頸亞目基因組SINE序列是Pol III/SINE序列。更佳地，所述Pol III/SINE 序列包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 和 CryllE。更進(jìn)一步地，所述特異性引物根據(jù)所述的CrylA、Cry IB, CrylC、CrylD、CryI ΙΑ, CryIIB、CryIIC、CryIID 和 CryIIE 的 5，同源區(qū)來設(shè)計(jì)的。尤其，所述特異性引物包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。較佳地，所述陽性擴(kuò)增條帶的長度在IOObp以下。采用本發(fā)明的方法，能夠快速檢測龜甲類中藥的物種來源，從而分辨真?zhèn)?，且由?其采用基于種屬特異性的SINE序列設(shè)計(jì)種屬特異性引物，對所要鑒定的DNA樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，因SINE序列是真核細(xì)胞基因組中存在的短分散重復(fù)序列，不同SINE在各個(gè)真核細(xì)胞 基因組中具有種屬特異性的特點(diǎn)，大小適中，相對于rDNA，mtDNA而言，SINE最大的優(yōu)勢在 于其在基因組中拷貝數(shù)極高，基于SINE所建立的PCR檢測方法更適用于DNA破壞嚴(yán)重的樣 品，因此，盡管深度加工的龜甲類中藥特別是由龜甲熬制而成的龜甲膠，其DNA含量極少， 破壞極其嚴(yán)重，但是，本發(fā)明的基于SINE序列的PCR檢測方法完全能夠達(dá)到檢測目的，并 且本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，常規(guī)PCR即可完成檢測，操作簡單、成本 低、靈敏快速、能有效鑒定深度加工型龜甲類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>

圖1是采用基于隱頸亞目動物SINE序列PolIII/SINE設(shè)計(jì)的種屬特異性引物進(jìn) 行PCR反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，用于檢測各種肉源性成分中的龜源性成分。其中M. DNA Marker, 1.龜肉基因組DNA，2.驢肉基因組DNA，3.馬肉基因組DNA，4.牛肉基因組DNA，5.豬 肉基因組DNA，6.空白對照。圖2是采用基于隱頸亞目動物SINE序列設(shè)計(jì)的種屬特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)獲 得的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，用于檢測龜甲膠中的龜源性成分。其中M. DNA Marker, 1.空白對照， 2.龜肉基因組DNA，3.龜甲膠DNA，4.阿膠DNA，5.黃明膠DNA，6.豬皮膠DNA。圖3是采用基于隱頸亞目動物SINE序列設(shè)計(jì)的種屬特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)獲 得的擴(kuò)增產(chǎn)物的測序比對結(jié)果，用于驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的可靠性。其中1.龜肉基因組擴(kuò)增產(chǎn) 物，2.龜甲膠DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，3.隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE序列片段。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。本發(fā)明以鑒定龜甲膠真?zhèn)螢槔?，為了檢測龜甲膠中龜源性成分，并與其他各類雜 皮膠進(jìn)行區(qū)分，基于隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE,包括CryIA(GenBankAccession No. AB125500)、CryIB (GenBank Accession No. AB125508)、CryIC(GenBankAccession No. AB125524) XryID (GenBank Accession No. AB125555)以及CryIIA(GenBank Accession No.AB125536)、CryIIB(GenBank Accession No.AB125447)、CryIIC(GenBank Accession No.AB125517)、CryIID(GenBank Accession No.AB125488)、CryIIE(GenBank AccessionNo. AB125499)的5，端同源區(qū)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)引物如下根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE設(shè)計(jì)引物，理論目標(biāo)條帶大小72bp，用于檢測龜甲膠中龜源性成分。其序列如下上游引物Tortoise up =SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列下游引物Tortoise down =SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列各實(shí)施例提取膠類中藥的DNA的具體步驟如下1、膠類中藥的預(yù)處理將膠塊錘擊成顆粒狀，取出若干加入一只50ml無菌離心 管中，并向其中加入消化緩沖液，該緩沖液PH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA， 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 5% SDS構(gòu)成，然后將離心管置于50°C _60°C水浴中保溫，其間不時(shí)輕微 攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。待溶液冷卻至室溫后，加入蛋白酶K溶液，混勻，56°C 保溫1小時(shí)，其間不時(shí)輕微搖勻。2、膠類中藥DNA的提取向上述膠類中藥預(yù)處理液中加入PN緩沖液，混勻，分若干 次加入硅吸附柱中，離心，將溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入 PE緩沖液洗滌吸附柱膜，除去附著在膜上的少量蛋白及脂類物質(zhì)，完畢之后用熱的PH 8. 0 的TE緩沖液將吸附柱膜上的DNA洗脫收集下來并置于_20°C保存。提取得到的DNA可用紫 外分光光度法定量。上述提取操作過程中所用試劑、耗材皆來自商業(yè)化試劑(德國QIAGEN公司)，包括 PN 緩沖液(Cat. No. 19071)、PE 緩沖液(Cat. No. 19065)、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。用上述方法提取得到各個(gè)膠類制品DNA樣之后，利用上述引物進(jìn)行常規(guī)的PCR操 作，將產(chǎn)物加于2% -3%的添加了熒光染料的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外下觀察，根據(jù)是否出 現(xiàn)陽性擴(kuò)增條帶判斷待檢測樣品中是否含有龜源性成分，從而完成對這些樣品的檢測。實(shí)施例1檢測各種肉基因組中所含有的龜源性成分1材料和試劑材料各種肉類包括龜、驢、馬、牛、豬的基因組DNA提取液(lng/yL)。試劑PCR預(yù)混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (購于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 熒光染料 10000 XGelRed =DNA 熒光染料(購于 Biotium，Cat. No.41000)。2檢測方法取各種肉基因組DNA提取液備用，使用根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE 所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物用無菌水溶解至濃度10 μ M備用。25 μ L反應(yīng)體系的具體 加樣情況如下Premix Εχ-Taq Hot Start Version 12· 5 μ L，弓L Tortoise up 0. 5μ L,^!^ Tortoisedown 0. 5 μ L,基因組DNA提取液1 μ L,無菌雙蒸水10. 5 μ L ；(在該反應(yīng)體系中，上游及下游引物終濃度皆0.4 μ Μ,各種肉類DNA模板量lng。)擴(kuò)增條件-MV6min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (30 循環(huán))；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作結(jié)束后，用IXTAE電泳緩沖液制備2. 5%瓊脂糖凝膠并按照參考比例混 入熒光染料GelRed 。按照比例將10 μ 1的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合，加入凝膠孔 中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40-60分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠 塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照。
結(jié)果見圖1，由于引物根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列設(shè)計(jì)，泳道1具有陽性條帶，而 其它泳道均沒有出現(xiàn)陽性條帶，可見該方法能夠特異性檢測龜源性成分，而與其他各種動 物源性成分包括驢、馬、牛、豬等進(jìn)行區(qū)分。實(shí)施例2檢測膠類中藥中所含有的龜源性成分1材料和試劑材料龜甲膠(山東東阿股份有限公司生產(chǎn))DNA提取液(lOng/μ ；阿膠(山東 東阿股份有限公司生產(chǎn))DNA提取液(lOng/μ ；黃明膠(山東東阿股份有限公司研究所 采用牛皮熬制)DNA提取液(lOng/μ ；豬皮膠(山東東阿股份有限公司研究所采用豬皮 熬制)DNA提取液(lOng/μ 。試劑PCR預(yù)混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version ；(購于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 熒光染料 lOOOOXGelRed =DNA 熒光染料(購于 Biotium，Cat. No.41000)。2檢測方法取各種膠DNA提取液(lOng/μ L)備用，使用根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列PolIII/ SINE所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物用無菌水溶解至濃度10 μ M備用。25 μ L反應(yīng)體系 的具體加樣情況如下Premix Taq Hot Start Version 12. 5 μ L，弓L Tortoise up 0.5yL，弓L Tortoise downO. 5 μ L,模板 5 μ L,無菌雙蒸水 6. 5 μ L ；(在該反應(yīng)體系中，上游及下游引物終濃度皆0.4 μ Μ，待檢測膠類DNA模板量 50ngo )擴(kuò)增條件:94°C6min -MV 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (40 循環(huán))；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作結(jié)束后，用IXTAE電泳緩沖液制備2. 5%瓊脂糖凝膠并按照參考比例混 入熒光染料GelRed 。按照比例將10 μ 1的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合，加入凝膠孔 中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40-60分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠 塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照。
結(jié)果見圖2，由于引物根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列設(shè)計(jì)，所以泳道2，泳道3都具 有陽性條帶，可見盡管由膠類中藥中得到的DNA含量極少，利用針對隱頸亞目動物SINE序 列設(shè)計(jì)的引物，通過PCR能夠檢測出膠類制品中的龜源性成分，而在其它樣品中沒有擴(kuò)增 出陽性條帶。接著對該實(shí)施例中的龜基因組擴(kuò)增產(chǎn)物以及龜甲膠擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接載體并 測序，將所得到的測序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見圖3，同源性良好，并且與所設(shè)計(jì)的產(chǎn)物序列相 符，進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測結(jié)果的可靠性。因此利用這種方法能夠?qū)敿啄z與其他各種雜皮膠 進(jìn)行區(qū)分。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，針對隱頸亞目動物基因組SINE序列設(shè)計(jì)引物，以龜甲膠DNA 提取液作模板，確實(shí)能夠得到清晰的條帶。由于SINE序列具有極高的拷貝數(shù)以及良好的種 屬特異性，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增就能夠特異性識別龜甲膠中的龜源性成分， 從而將龜甲膠與其他各類雜皮膠區(qū)分開來。另一方面，在上述這些PolIII/SINE的不同亞 型序列間，其5’端是相對比較保守的，而3’端則相互間變化較大，因此根據(jù)這些序列的5’ 端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增就能夠保證檢測結(jié)果的可靠性和有效性。因此，利用隱頸亞目動 物種屬特異性的SINE序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR就可以識別龜源性成分，達(dá)到深度加工龜甲膠產(chǎn)品的檢測目的。SINE序列相對rDNA及mtDNA而言，拷貝數(shù)高，特異性好。所以，本發(fā)明對待檢測樣品的初始DNA模板質(zhì)量要求較低，因此盡管從深度加工膠類中藥中提取得到的DNA濃度極 低，破壞極其嚴(yán)重，但是，利用本發(fā)明進(jìn)行檢測，依然能夠得到較為理想的結(jié)果。本發(fā)明的基 于隱頸亞目動物SINE的PCR檢測方法能夠適用于因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極 短的龜甲膠產(chǎn)品的檢測。這也是本發(fā)明最大的特點(diǎn)和優(yōu)勢。并且該法并不需要十分昂貴的 儀器和繁瑣的操作，常規(guī)PCR即可完成檢測。因此，這種基于隱頸亞目動物SINE序列構(gòu)建的深度加工型產(chǎn)品檢測方法是整個(gè) 深度加工型龜甲膠鑒定方法的關(guān)鍵。這一點(diǎn)在利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別深度加工型龜甲膠 的領(lǐng)域意義重大。目前利用SINE序列來進(jìn)行龜甲膠的分子鑒別技術(shù)國內(nèi)外尚未見報(bào)道。綜上所述，本發(fā)明的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法操作簡單、靈敏快速、成本 低、能有效鑒定龜源性產(chǎn)品的真?zhèn)?，特別適用于鑒定因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段 極短的深度加工型龜甲膠的真?zhèn)危m于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的 而非限制性的。序列表<110>華東理工大學(xué)，山東東阿阿膠股份有限公司<120>中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (20)<223>根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE設(shè)計(jì)的上游引物<400>1gagcattggc ctgctaaacc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (20)<223>根據(jù)隱頸亞目動物SINE序列Pol III/SINE設(shè)計(jì)的下游引物<400>2
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權(quán)利要求
一種中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟a)提取所述中藥中的DNA；b)用根據(jù)隱頸亞目基因組SINE序列設(shè)計(jì)的特異性引物對所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)電泳所述擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增條帶，如果所述DNA擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥源自隱頸亞目動物，含有龜源性成分；如果所述DNA沒有擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥并不源自隱頸亞目動物，也不含有任何龜源性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，在步驟a) 中，所述中藥是深度加工型中藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述深度加 工型中藥是深度加工型龜甲源性中藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述深度加 工型龜甲源性中藥是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段破壞極其嚴(yán)重的龜甲膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，采用消化液 和蛋白酶預(yù)處理所述深度加工型中藥，再采用針對短片段DNA的抽提方法提取所述DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述隱頸亞 目基因組SINE序列是Pol III/SINE序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述 PolIII/SINE 序列包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 和 CryllE。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述特異 性引物根據(jù)所述的 CryIA、CryIB、CryIC、CryID、CryIIA、CryIIB、CryIIC、CryIID 和 CryIIE 的5’同源區(qū)來設(shè)計(jì)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述特異性 引物包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，其特征在于，所述陽性 擴(kuò)增條帶的長度在IOObp以下。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中藥中龜源性成分的PCR鑒定方法，包括下列步驟a)提取中藥中的DNA；b)用根據(jù)隱頸亞目基因組SINE序列設(shè)計(jì)的特異性引物對所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)電泳所述擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳結(jié)果判斷所述DNA是否擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增條帶，如果所述DNA擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥源自隱頸亞目動物，含有龜源性成分；如果所述DNA沒有擴(kuò)增出所述陽性擴(kuò)增條帶，則所述中藥并不源自隱頸亞目動物，也不含有任何龜源性成分。本發(fā)明操作簡單、靈敏快速、成本低、能有效鑒定龜源性產(chǎn)品的真?zhèn)?，特別適用于鑒定因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少、片段極短的深度加工型龜甲膠的真?zhèn)?，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101838684SQ20091020077
公開日2010年9月22日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者呂品, 周祥山, 尤金花, 張?jiān)d, 田守生, 秦玉峰 申請人:華東理工大學(xué);山東東阿阿膠股份有限公司