專利名稱：一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達(dá)。
背景技術(shù)：
乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)主要存在于多細(xì)胞動(dòng)物的神經(jīng)元間、神經(jīng)元與肌肉細(xì)胞間的化學(xué)突觸上，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，是主要的信號(hào)傳遞分子。乙酰膽堿酯酶AChE行使水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿Ach的功能，從而終止Ach對(duì)膽堿能受體的興奮作用，保持神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的靈敏性。 研究表明，多種化合物可抑制AChE的活性，導(dǎo)致有機(jī)體類膽堿代謝途徑過(guò)度，膽堿酯不能被有效水解，大量積累于神經(jīng)末梢，有機(jī)體表現(xiàn)出肌肉抽搐，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡。在眾多抑制劑中，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥被認(rèn)為是AChE的專性抑制劑，他們可使昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE的絲氨酸羥基基團(tuán)發(fā)生磷酸化或甲氨?；笰ChE失去活性，不能迅速水解乙酰膽堿，致使昆蟲(chóng)死亡。 我國(guó)是蔬菜生產(chǎn)大國(guó)，目前我國(guó)蔬菜農(nóng)業(yè)上濫用高毒、高殘留農(nóng)藥的現(xiàn)象屢禁不止。有的不按規(guī)范要求使用農(nóng)藥，有的甚至嚴(yán)重違反農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)而使用高毒農(nóng)藥，致使相當(dāng)部分農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留明顯超標(biāo)，食用后在人體內(nèi)積累，引發(fā)疾病，有時(shí)甚至發(fā)生急性中毒，嚴(yán)重危及人們健康和生命安全。與此同時(shí)，農(nóng)藥殘留問(wèn)題也給農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和正常貿(mào)易帶來(lái)了許多負(fù)面影響。近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品因農(nóng)藥殘留超標(biāo)而被進(jìn)口國(guó)拒絕、扣留、退貨、索賠和中止合同的事件時(shí)有發(fā)生。如2002年上海出口到韓國(guó)的紫菘因農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題而遭到退貨，造成直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)500多萬(wàn)元。 一些國(guó)家更是利用國(guó)際貿(mào)易技術(shù)壁壘，人為地對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口設(shè)置障礙，使我國(guó)蔬菜出口屢屢受阻。如何快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出農(nóng)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品中的殘留農(nóng)藥，是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。 目前農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要有兩大類方法色譜檢測(cè)法和快速檢測(cè)法。色譜檢測(cè)法因?yàn)槠浔O(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的精確性和準(zhǔn)確性可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供有力的參考依據(jù)。但其操作程序復(fù)雜、需要高技術(shù)專業(yè)檢測(cè)人員，檢測(cè)儀器和費(fèi)用都相當(dāng)昂貴，不利于大眾化?？焖贆z測(cè)法操作簡(jiǎn)便、不需要昂貴儀器，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及大批樣品的篩選檢測(cè)，主要用來(lái)防止有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜和水果流入市場(chǎng)?？焖贆z測(cè)法中應(yīng)用最為廣泛的是酶抑制法，酶抑制法檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥的毒理特性對(duì)酶分解底物的抑制作用而建立起來(lái)的，其中使用較多的是乙酰膽堿酯酶(簡(jiǎn)稱AChE)。 近年來(lái)，我國(guó)在利用乙酰膽堿酯酶進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的研究取得了一定的成果，并研發(fā)出了相應(yīng)的試劑盒、速測(cè)卡和速測(cè)儀。無(wú)論采用何種方法，酶是決定檢測(cè)方法靈敏度和可靠性的最關(guān)鍵因子。目前采用的酶原料主要有兩類一是從國(guó)外進(jìn)口乙酰膽堿酯酶純酶制劑，如電鰻和牛血清來(lái)源的酶，但價(jià)格較高，而且對(duì)有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥缺乏敏感性；二是直接從昆蟲(chóng)體內(nèi)提取粗酶液，但該類酶產(chǎn)品的純度及穩(wěn)定性較差，影響了檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。國(guó)際上先進(jìn)的農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)是利用基因工程技術(shù)獲得高熱穩(wěn)定性膽堿酯酶，并制備速測(cè)試紙條，克服了膽堿酯酶易失活、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，使檢測(cè)效率大幅度提高。 自上世紀(jì)90年代起，多種來(lái)源(包括線蟲(chóng)、果蠅、電鰻、鼠類、人等)的乙酰膽堿酯酶基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞、爪蟾卵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞甚至植物株系中成功獲得了表達(dá)Moreland Massouli6，1997 ;Simon and Massouli6，1997 ;Mendelson et al，1998 ;Hussein etal，1999,2000 ;Mor et al，2001 ;Uccelletti etal，2002 ;0vadia Lazari et al，2003。研究者利用這些重組蛋白注射老鼠、豚鼠和靈長(zhǎng)類，證明在有機(jī)磷中毒時(shí)間中取得了良好的預(yù)防與治療效果。不同生物來(lái)源的AChE對(duì)抑制劑的敏感程度不同。蠅類的AChE發(fā)生磷酸化與甲氨?；乃俣雀哂谄渌锏拿?，也就是說(shuō)，此類酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是最為敏感的。因此，是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的理想生物學(xué)材料。 因此，通過(guò)基因工程手段在酵母中大量表達(dá)家蠅的AChE則會(huì)避免上述農(nóng)藥殘留檢測(cè)中存在的問(wèn)題。通過(guò)分子生物學(xué)手段克隆到家蠅AChE基因后，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變可以顯著地提高酶的活性和穩(wěn)定性，并在酵母表達(dá)系統(tǒng)中快速高效地獲得表達(dá)。用此種方法獲得的活性蛋白經(jīng)過(guò)純化之后便可以獲得純的AChE，避免了昆蟲(chóng)體內(nèi)多種蛋白的干攏，不僅可以進(jìn)一步用于農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)，在農(nóng)藥設(shè)計(jì)和篩選方面也有廣泛的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于通過(guò)分子生物學(xué)手段克隆到家蠅乙酰膽堿酯酶基因后，對(duì)現(xiàn)有的家蠅乙酰膽堿酯酶進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)取代，提供一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，以顯著地提高該酶的活性和穩(wěn)定性，克服農(nóng)殘檢測(cè)中現(xiàn)有技術(shù)的不足，使改造后的家蠅乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥更敏感。 本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)問(wèn)題在于將上述定點(diǎn)突變后的家蠅家蠅乙酰膽堿酯
酶基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中快速高效地獲得表達(dá)。用此種方法獲得的活性蛋白經(jīng)過(guò)純化之后
便可以獲得純的家蠅乙酰膽堿酯酶，最終達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為開(kāi)發(fā)農(nóng)藥生物學(xué)檢測(cè)
產(chǎn)品及農(nóng)藥設(shè)計(jì)和篩選提供有用的蛋白材料。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) —種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，它是在現(xiàn)有的家蠅乙酰膽堿酯酶基因其表達(dá)的成熟蛋白由612個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的核苷酸序列如SEQID NO. 2的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變。所得突變后的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其氨基酸定點(diǎn)突變是指在序列SEQ IDNO. 1的第180、327和374位發(fā)生氨基酸定點(diǎn)取代。即在第180位用纈氨酸(V)取代脯氨酸(P)，在第327位用天冬氨酸(D)取代酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取代異亮氨酸(I)。
本發(fā)明還提供一種載體，含有如前所述SEQ ID N0.4核苷酸序列的載體，包括pPIC9K或本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。 所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)的蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)、利用反向PCR法依次對(duì)序列SEQ ID NO. 1的第180位、327位和374位3個(gè)位
4點(diǎn)進(jìn)行突變，得到突變后的乙酰膽堿酯酶基因序列并測(cè)序驗(yàn)證； 2)、將編碼具有突變乙酰膽堿酯酶基因的核苷酸序列連接于表達(dá)載體pPIC9K中，形成家蠅乙酰膽堿酯酶表達(dá)載體； 3)、將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母宿主細(xì)胞中，形成家蠅乙酰膽堿酯酶的重組細(xì)胞；
4)、在適合乙酰膽堿酯酶表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞；
5)、分離出具有家蠅乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。 所述的酵母宿主細(xì)胞含有如前所述的SEQ ID NO. 4核苷酸序列分子，或者含有如前所述的SEQ ID NO. 3的氨基酸序列的載體。 所述的酵母宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞核哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌或枯草桿菌。 所述的突變的家蠅乙酰膽堿酶基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中快速高效地獲得表達(dá)，其該
突變的家蠅乙酰膽堿酶基因可應(yīng)用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)中。 本發(fā)明還提供了一種DNA分子，其含有SEQ ID NO. 4的核苷酸序列，編碼如前所述
的乙酰膽堿酯酶。所述的DNA分子以合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體中，再
轉(zhuǎn)入到所述的宿主細(xì)胞中，所述的DNA分子可以在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 在眾多表達(dá)系統(tǒng)中，酵母表達(dá)系統(tǒng)具有繁殖迅速、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單和便于工業(yè)化大
規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，不產(chǎn)生毒素，
安全可靠；具有分泌功能，使蛋白分泌到胞外，利于純化；可對(duì)蛋白進(jìn)行多種翻譯后的修
飾，利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性。 本發(fā)明通過(guò)人工分子進(jìn)化獲得新型基因資源，并利用基因工程手段在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)突變基因，獲得大量有活性的乙酰膽堿酯酶。通過(guò)該方法獲得的乙酰膽堿酯酶比直接從昆蟲(chóng)體內(nèi)提取的粗酶液純度更高，對(duì)低濃度的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有更顯著的敏感性，可用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，為發(fā)展新型酶法檢測(cè)農(nóng)藥殘留技術(shù)以及農(nóng)藥的設(shè)計(jì)和篩選提供了高效的酶源，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。 圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖，其中M1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 ;M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;1、2為載體pPIC9K ;3為pPIC9K-AChE-EcoRI/Not I ;4為pPIC9K-VDD-EcoR I/Not I ;5為AChE的PCR產(chǎn)物。 圖3為乙酰膽堿酯酶在畢赤酵母中的SDS-PAGE檢測(cè)，其中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為陰性對(duì)照；2為轉(zhuǎn)入pPIC9K-AChE的酵母重組子；3為轉(zhuǎn)入pPIC9K_VDD的酵母重組子。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例1 家蠅乙酰膽堿酯酶(AChE)基因序列的獲得
提取家蠅總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得家蠅總cDNA的第一條鏈。然后采用正向引物 Ace-F :5，AAAGGATCC(BamH I)ATGGCTAGATCCGTCAG-3，和反向引物Ace-R :5，-AAAGAGCTC(Sac I) TTACTGGAAGATAGAG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得家蠅AChE基因的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行電泳 回收。用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sac I分別雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和pBbluScipt SK+載 體，連接兩者酶切后的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) DH5 a ，獲得含AChE cDNA基 因序列的大腸桿菌克隆，將大腸桿菌中含AChE cDNA序列的質(zhì)粒命名為PBSK-AChE。
實(shí)施例2 家蠅乙酰膽堿酯酶(AChE)基因的突變 根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對(duì)AChE蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，最終確定對(duì)以下
位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變改造 對(duì)于第180位氨基酸突變，設(shè)計(jì)如下引物P180V-up :5' -￡lCGGTGCTTTCGGTTTCCTGCATC-3， 突變位點(diǎn)P180V-dn :5' -TCTGTACTGGAACGAGGCAACGATC-3，
對(duì)于第327位氨基酸突變，分別設(shè)計(jì)如下引物
Y327D-up :5' -^ATCCCTCGGCTCCAACCATCGAT-3'
突變位點(diǎn)Y327D-dn :5' ACTTAAAATTCCAGAATACGAGTTC3'
對(duì)于第374位氨基酸突變，設(shè)計(jì)如下引物
I374D-up :5' -^ATGATTATTTCGATAAGGATGATG-3'
突變位點(diǎn) I374D-dn :5' AAAGTCGTAGAGCAGAAAATATGTGC3' 利用反向PCR法依次對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行突變，具體操作步聚按TOYOBO定點(diǎn)突變?cè)噭?br> 盒說(shuō)明書進(jìn)行(購(gòu)自TOYOBO公司)，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得含有預(yù)期突變位點(diǎn)的AChE
基因序列。 實(shí)施例3 家蠅乙酰膽堿酯酶(AChE)基因表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)酶母表達(dá)載體pPIC9K(購(gòu)自Invitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)，設(shè) 計(jì)并合成 一 對(duì)引物PI :5' AAAAGAATTC(EcoRI)ATGACAGATCATCTAACGGTTC3'禾P P2 : 5' AAAAGCGGCCGC (Notl) TTACTGGAAGATAGAGTTGAC3'，在5'端分別弓|入酶切位點(diǎn)EcoR I和 Not I。以含有AChE基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物采用EcoR I和Not I進(jìn) 行雙酶切，酶切產(chǎn)物與同樣進(jìn)行雙酶切后的載體pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞， 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序，圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖。構(gòu)建得到的載體 分別命名為pPIC9K-AChE和pPIC9K-VDD(突變位點(diǎn)為P180V， Y327D和I374D)。
實(shí)施例4 線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 在50ml三角瓶中加入5mlYPD，將畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD1168單菌落接 種其中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(3(TC，200rpm)。取0. 1_0. 5ml菌液，接種在100ml新鮮培養(yǎng)液中，再 次劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，至0D6。。 = 1. 3-1. 5。離心(4。C，5000rpm，5min)，用100ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞沉淀。離心(4t:，5000rpm，5min)，用50ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸細(xì)胞沉淀。離心 (4°C ， 5000rpm， 5min)，用4ml預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。離心(4°C ， 5000rpm， 5min)， 用200ul預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。 取80ul經(jīng)上述處理的酵母細(xì)胞懸液，與線性化質(zhì)粒(5-20ug)混合。將混合物轉(zhuǎn) 移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。冰上放置5min。用電轉(zhuǎn)化儀(購(gòu)自E卯endorf公司)進(jìn)行電轉(zhuǎn) 化(參數(shù)2KV， 200 Q ， 25uF)。在電轉(zhuǎn)化杯中迅速加入lml預(yù)冷的1M山梨醇，顛倒數(shù)次，以 混合細(xì)胞，冰浴數(shù)分鐘，取250 ii 1等份，涂布于MD平板，溫育(30°C ， 3-4d)至菌落出現(xiàn)。
實(shí)施例5 誘導(dǎo)甲醇酵母細(xì)胞表達(dá)家蠅乙酰膽堿酯酶(AChE)蛋白 即使在同一個(gè)轉(zhuǎn)化事件中，外源基因也可能以多種形式發(fā)生重組，不同的重組子 表達(dá)外源蛋白的效率不同。實(shí)驗(yàn)中，挑選1000個(gè)酵母重組子，誘導(dǎo)其表達(dá)AChE，篩選表達(dá)水 平高的重組子。為保證表達(dá)活力，從平板上挑選新鮮的單菌落，或從-7(TC凍存的菌種中挑 取一部分培養(yǎng)，誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)過(guò)程如下 從MD平板上挑取單菌落，接種于25ml的BMGY中，振蕩培養(yǎng)(28 °C ， 250rpm)，至 0D6。。 = 2 (約18h)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。離心(室溫，5000rpm， 5min)，收集細(xì)胞。用50ml B匪Y重懸細(xì)胞沉淀，至ODe。。二 1。將菌液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)三角瓶，用兩層紗布蓋住瓶口，繼續(xù) 振蕩培養(yǎng)。為持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，每2處補(bǔ)充甲醇，使其終濃度為0.5%。為確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間， 分別在誘導(dǎo)后第48、72、96、 120、 144小時(shí)，收集500ul培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，離心(室 溫，13000rpm，2min)，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，取出一部分用于SDS-PAGE電泳分析蛋白 表達(dá)情況，結(jié)果表明，含有AChE或突變AChE基因的重組酵母在67kD左右出現(xiàn)特異性表達(dá) 條帶，與預(yù)期蛋白大小相符(參見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例6 家蠅乙酰膽堿酯酶(AChE)酶活的測(cè)定 吸取20 ii 1酵母培養(yǎng)液，加入96孔酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)微孔中，25°C ，放置5min。在孔中 加入180 ii 1 Ellman試劑(20mM ATChI， 20mM DTNB， 0. 1M磷酸鈉緩沖液)，混勻，立即將96 孔板置于酶標(biāo)儀中，測(cè)定405nm波長(zhǎng)下3min的吸光值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的收集樣品平行測(cè)定3 次。測(cè)定的結(jié)果表明工程菌株中表達(dá)的乙酰膽堿酯酶都具有較高的活性，突變后的乙酰膽 堿酯酶比突變前的活性高，對(duì)低濃度的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥更敏感，可以用來(lái)對(duì)蔬 菜、瓜果中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等同物界定。 附本發(fā)明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表
〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 〈120〉 一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達(dá)
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 3
7
〈210>SEQ IDNO. 1〈211>612〈212>PRT〈213>家蟲(chóng)雖(Musca domestica)〈220〉〈221>CHAIN〈22:..(612)〈400>1MetThrAspHisLeuThrValGinThrThrSerGlyProValArgGly151015ArgSerValThrValGinGlyArgAspValHisValPheThrGlylie202530ProTyrAlaLysProProValAspAspLeuArgPheArgLysProVal354045ProAlaGluProTrpHi s Gly Val Leu Asp Ala Thr Arg Leu Pro Ala
505560ThrCysValGinGluArgTyrGluTyrPheProGlyPheSerGlyGlu65707580GluMetTrpAsnProAsnThrAsnValSerGluAspCysLeuPheMet859095AsnlieTrpAlaProAlaLysAlaArgLeuArgHisGlyArgGlyThr100105110AsnGlyGlyGluHisSerSerLysThrAspGinAspHisLeulieHis115120125SerAlaThrProGinAsnThrThrAsnGlyLeuProlieLeulieTrp130135140lieTyrGlyGlyGlyPheMetThrGlySerAlaThrLeuAsplieTyr145150155160AsnAlaGlulieMetSerAlaValGlyAsnVallieValAlaSerPhe165170175GinTyrArgProGlyAlaPheGlyPheLeuHisLeuSerProValMet180185190ProGlyPheGluGluGluAlaProGlyAsnValGlyLeuTrpAspGin195200205AlaLeuAlaLeuArgTrpLeuLysGluAsnAlaArgAlaPheGlyGly210215220AsnProGluTrpMetThrLeuPheGlyGluSerAlaGlySerSerSer225230235240ValAsnAlaGinLeuMetSerProValThrArgGlyLeuValLysTrp
8
245250255 [o川]GlyMetMetGin 260SerAlaThrMetAsn 265AlaProTrpSerHis 270MetThrSerGluLysAlaValGlulieGlyLysAlaLeuValAsnAspCysAsn275280285CysAsnAlaSerLeuLeuProGluAsnProGinAlaValMetAlaCys290295300MetArgGinValAspAlaLysThrlieSerValGinGinTrpAsnSer305310315320TyrSerGlylieLeuSerTyrProSerAlaProThrlieAspGlyAla325330335PheLeuProAlaAspProMetThrLeuLeuLysThrAlaAspLeuSer340345350GlyTyrAsplieLeulieGlyAsnValLysAspGluGlyThrTyrPhe355360365LeuLeuTyrAspPhelieAspTyrPheAspLysAspAspAlaThrSer370375380LeuProArgAspLysTyrLeuGlulieMetAsnAsnliePheGinLys385390395400AlaSerGinAlaGluArgGluAlalieliePheGinTyrThrSerTrp405410415GluGlyAsnProGlyTyrGinAsnGinGinGinlieGlyArgAlaVal420425430GlyAspHisPhePheThrCysProThrAsnGluTyrAlaGinAlaLeu435440445AlaGluArgGlyAlaSerValHisTyrTyrTyrPheThrHisArgThr450455460SerThrSerLeuTrpGlyGluTrpMetGlyValLeuHisGlyAspGlu465470475■lieGluTyrPhePheGlyGinProLeuAsnAsnSerLeuGinTyrArg485490495ProValGluArgGluLeuGlyLysTrpMetLeuAsnSerVallieGlu500505510PheAlaLysSerGlyAsnProAlaValAspGlyGluGluTrpProAsn515520525PheSerLysGluAspProValTyrTyrValPheSerThrAspGluLys530535540lieGluLysLeuGinArgGlyProLeuAlaLysTrpCysSerPheTrp545550555560
Asn Asp Tyr Leu Pro Lys Val ArgSer Trp lie Gly Ser Glu Cys Glu565570575Asn Lys Ser Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ala lie Tyr Glu Met Lys Met580585590Gin Gin Leu Thr Leu Leu Ala ValAla lie lie Leu Thr Met Val Asn595600605Ser lie Phe Gin610〈210>2〈211>1839〈212>DNA〈213>Muscadomestica〈220〉〈221>gene〈222〉 (1) (1839)〈400>2atgacagatcatcteacggttcaaacgaccagcggtccagteagagg朋g atcggttecc60gttcagggtegagatgtecacgtcttteccggcattccgtatgccaagcc tcctgttgat120gatttgagattcag朋朋cctgtecctgctgaaccttggcatggtgtcct agatgcaact1803g3CtgCC3gcaacatgcgttetgagtecttccctggctt ttccggtgaa240g卿tgtgg3atccteacacaaatgtetctg朋gattgtttgtttetgaa tetctgggct300cctgcteaggc朋gattgag3catggteg3gg朋cc朋tggtggtgagca ttcatcte朋3603CCg3tC3ggaccattteatccategcgcaactccacagaacaccaccaa cggtttgcct420atctteatctggatttetggcggtggctttatgactggctcagccacatt ggacatttec■朋CgC3g3g3ttetgtcggccgtgggc朋tgtgatcgttgcctcgttcca gtecagaccc540ggtgctttcggtttcctgcatctttcacctgttetgccaggttttg朋ga ag朋gctccc600ggc雄gtgggcctttgggatcaggccttggccttgagatggctc朋gga g朋tgCC3g3660gcctttggtggcaatcctga3tgg￡ltg￡lCgctgtttggtgaatcggctgg ttcgagttcc720gtgaatgctcaactgatgtctcctgtcacg卿ggcctggtcaaatgggg tetgatgcag780tcggccacaatgaatgctccctggagccac3tg3C3tC3g卿郷ctgt tg卿ttggt840朋ggctttggtcaacgactgteactgteatgcctcattgttecctgagaa tccacaagct■gtcatggcttgtetgagacaggtcgatgctaagaccatctctgtccaaca atggaactcg960tettctggaatttteagttetccctcggctccaaccatcg atggagcatt cttgcctgca1020gatcc朋tgaccctgttgaagaccgcagaccttegtggtt acgatettct gattggaaat1080gtte朋gatg朋ggcacatettttctgctctecgacttte ttgattettt cgataaggat1140gatgctecatccttgccaagagac朋gtecctggagatca tg朋C朋C3t CttCC3g3朋1200gccagtc朋gagcaattetcttccagteca c朋gttggga gggteatcca1260ggcteccaga3tC3gC朋C3gatcggtega gctgtgggtg atcacttttt cacctgtccc1320atgcccaggcattggctgaa agaggtgcttctgttcacte ctectecttc1380
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〈222〉 (180) . (180)〈223>P-V〈220〉〈221〉MUTAGEN
〈222〉 (327) . (327)〈223>Y-D〈220〉〈221〉MUTAGEN
〈222〉 (374) . (374)〈223>I-DMet Thr Asp His Leu
15
0213: 0214: 0215: 0216: 0217: 0218: 0219: 0220: 0221: 0222: 0223: 0224: 0225'
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12
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[0310:[03":
[0312:[0313:[0314:[0315:[0316:[0317:[0318:[0319:[0320:[0321:[0322:[0323:[0324:[0325:[0326:[0327:[0328:[0329:[0330:[0331:[0332:[0333:
GTTCAGGGTAGATTTGAGATAGACTGCCAGGAGATGTGGACCTGCTMGGACCGATCAGGATCTTAATCTAACGCAGAGAGGTGCTTTCGGGCAACGTGGGCCTTTGGTGGTGAATGCTCTCGGGCACAAAAGGCTTTGGGTCATGGCTTTATTCTGGMGATCCMTGAGTTAMGATGGATGCTACATGCCAGTCMGGGCTACCAGAACAMTGMTACCCATAGMATTGMTATTGAGTTAGGCAGTTGATGGCGACAGATGAMMCGACTACCACATCCGCTTGCMTCATCT
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GGCATTCCGT ATGCCAAGCC TCCTGTTGAT 120GAACCTTGGC ATGGTGTCCT AGATGCAACT 180TATGAGTACT TCCCTGGCTT TTCCGGTGM 240GAAGATTGTT TGTTTATGAA TATCTGGGCT 300GGAACCAATG GTGGTGAGCA TTCATCTAAA 360ACTCCACAGA ACACCACCAA CGGTTTGCCT 420ATGACTGGCT CAGCCACATT GGACATTTAC 480GTGATCGTTG CCTCGTTCCA GTACAGACCC 540GTTATGCCAG GTTTTGAAGA AGAAGCTCCC 600GCCTTGAGAT GGCTCAAGGA GAATGCCAGA 660CTGTTTGGTG AATCGGCTGG TTCGAGTTCC 720AGAGGCCTGG TCAAATGGGG TATGATGCAG 780ATGACATCAG AGAAGGCTGT TGAGATTGGT 840GCCTCATTGT TACCTGAGAA TCCACAAGCT 900AAGACCATCT CTGTCCAACA ATGGAACTCG 960CCMCCATCG ATGGAGCATT CTTGCCTGCA 1020CTTAGTGGTT ACGATATTCT GATTGGAMT 1080TACGACTTTG ATGATTATTT CGATMGGAT 1140CTGGAGATCA TGMCMCAT CTTCCAGAM 1200TTCCAGTACA CMGTTGGGA GGGTMTCCA 1260GCTGTGGGTG ATCACTTTTT CACCTGTCCC 1320AGAGGTGCTT CTGTTCACTA CTACTACTTC 1380GMTGGATGG GTGTCTTGCA CGGCGATGM 1440MTTCACTGC MTACAGACC TGTGGAMGA 1500ATTGMTTTG CCAMTCTGG CMCCCTGCC 1560MGGMGATC CCGTTTACTA TGTCTTCAGT 1620GGTCCATTGG CCAMTGGTG CTCATTCTGG 1680ATTGGTTCCG MTGTGMM CMMGCTCA 1740MGATGCMC AGCTGACCTT GCTGGCTGTG 1800TTCCAGTM 1839
權(quán)利要求
一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，它是在現(xiàn)有的家蠅乙酰膽堿酯酶基因的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變而得，所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，所述的氨基酸定點(diǎn)突變發(fā)生在序列SEQ ID NO. 1的第180、327和374三個(gè)位點(diǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，所述的氨基酸定點(diǎn)突變?nèi)缦略诘?80位用纈氨酸V取代脯氨酸P，在第327位用苯丙氨酸F取代酪氨酸Y，在第327位用天冬氨酸D取代酪氨酸Y，在第374位用天冬氨酸D取代異亮氨酸I 。
5. 包含權(quán)利要求1所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，該載體為pPIC9K。
7. 權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)的蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1) 、利用反向PCR法依次對(duì)序列SEQ ID NO. 1的第180位、327位和374位3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到突變后的乙酰膽堿酯酶基因序列并測(cè)序驗(yàn)證；2) 、將編碼具有突變乙酰膽堿酯酶基因的核苷酸序列連接于表達(dá)載體pPIC9K中，形成家蠅乙酰膽堿酯酶表達(dá)載體；3) 、將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母宿主細(xì)胞中，形成家蠅乙酰膽堿酯酶的重組細(xì)胞；4) 、在適合乙酰膽堿酯酶表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞；5) 、分離出具有家蠅乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的酵母宿主細(xì)胞含有如權(quán)利要求2所述的SEQ ID NO. 4核苷酸序列分子，或者含有權(quán)利要求1所述具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列的載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述的酵母宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述的真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求io所述的制備方法，其特征在于，所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌或枯草桿菌。
12. 權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酶基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
13. 權(quán)利要求1所述的突變的家蠅乙酰膽堿酶基因在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達(dá)。所述基因是在現(xiàn)有的家蠅乙酰膽堿酯酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO.1的第180、327和374三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸定點(diǎn)突變而得。所述基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，該基因能在酵母表達(dá)系統(tǒng)中快速高效地獲得表達(dá)。本發(fā)明的突變的乙酰膽堿酯酶基因?qū)Φ蜐舛鹊挠袡C(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥具有顯著的敏感性，可以用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，為研制農(nóng)藥生物學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品提供更為靈敏的蛋白酶材料，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101712963SQ20091020068
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉華, 吳瀟, 唐雪明, 朱宏, 王利剛, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院