利用dpo-pcr方法檢測(cè)溶藻弧菌的dpo引物序列及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用DPO-PCR方法檢測(cè)溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測(cè)試劑盒。選擇溶藻弧菌collagenase基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)DPO引物，其核苷酸序列為：VA-DPOF：5′-TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT-3′，VA-DPOR：5′-ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA-3′；建立DPO-PCR檢測(cè)方法，可對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行精確定性檢測(cè)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)用試劑盒，含有如上所述的DPO引物對(duì)、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、TaqDNAPolymerase和PCR反應(yīng)液，具有檢測(cè)特異性高、準(zhǔn)確性高、靈敏度好的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用DPO-PCR方法檢測(cè)溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測(cè)試
劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用DPO-PCR方法檢測(cè)溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌,分布于河口和海洋環(huán)境中，是引起魚(yú)、蝦、貝等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起傷口感染、胃腸炎和敗血癥等癥狀，嚴(yán)重威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。此外該菌對(duì)人的致病性也有大量報(bào)道，可引起人食物中毒、耳炎、腹渴等，己經(jīng)引起人們的重視。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道溶藻弧菌引起急性腹灣和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌在自然界中廣泛分布，尤其以海產(chǎn)品中攜帶率最高，是一種重要的引起細(xì)菌性食物中毒的致病菌。世界上各個(gè)國(guó)家食品衛(wèi)生法規(guī)中均把該菌列入法定檢測(cè)項(xiàng)目，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)禁止進(jìn)口和出口。
[0003]目前，對(duì)溶藻弧菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在檢測(cè)效率低、檢測(cè)目標(biāo)單一、靈敏度低且 耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。為滿(mǎn)足致病菌快速檢測(cè)的要求，發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、膠體金試紙條法、API生化鑒定試紙條法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、膠體金試紙法和API法均存在特異性差、靈敏度低等缺陷，而沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用；LAMP法，作為一種新興的檢測(cè)方法，盡管極大地提高了檢測(cè)效率，又降低了檢測(cè)成本，但是產(chǎn)生的假陽(yáng)性率較高；PCR技術(shù)作為一種高度靈敏、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在病原體檢測(cè)方面取得了革命性的成果，成為核酸快速檢測(cè)的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)之上，又發(fā)展了 DNA探針技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)等，而PCR引物的設(shè)計(jì)成為了制約該類(lèi)檢測(cè)方法成敗的關(guān)鍵性因素。常規(guī)的PCR引物設(shè)計(jì)，不僅需要反復(fù)比對(duì)引物的特異性，而且需要優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)與反應(yīng)條件，尤其是退火溫度，以防止非特異性擴(kuò)增，特別是涉及多重PCR時(shí)，需要大量的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。
[0004]Dual priming oligonucleotide (DPO)引物設(shè)計(jì)方法，簡(jiǎn)化了建立常規(guī)PCR方法的操作步驟。該引物的設(shè)計(jì)分為兩部分，中間用多聚次黃嘌呤肌苷連接，5’-端長(zhǎng)18-25bp，3’-端長(zhǎng)6-15bp。由于該類(lèi)引物特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感，試驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，DPO引物與模板發(fā)生錯(cuò)配的幾率小，因?yàn)橹灰?個(gè)以上堿基發(fā)生錯(cuò)配，就不會(huì)成功擴(kuò)增，比常規(guī)PCR引物的特異性更強(qiáng)，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其檢測(cè)結(jié)果比常規(guī)PCR方法更為精確。
[0005]在此情況下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法對(duì)致病性微生物實(shí)施精準(zhǔn)檢測(cè)，對(duì)保障公共衛(wèi)生安全具有現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明根據(jù)溶藻弧菌膠原酶collagenase靶基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了一對(duì)DPO引物，通過(guò)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了溶藻弧菌DPO-PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有一定的實(shí)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供利用DPO-PCR方法檢測(cè)溶藻弧菌的DPO引物序列及檢測(cè)試劑盒。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn):
一種基于DPO引物精準(zhǔn)檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法檢測(cè)用引物對(duì)，
上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示，
下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征:
1、一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法制備陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物， 上引物VA-F:如序列表Seq ID N0.3所示，
下引物VA-R:如序列表Seq ID N0.4所示。
[0009]2、一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法陽(yáng)性對(duì)照品pMD-T-colIagenase的制備方法，包括以下步驟:
(I )、PCR模板的制備:溶藻弧菌基因組DNA的提取和純化
(2)、選擇溶藻弧菌collagenase基因作為靶基因，設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物:上引物VA-F ,如序列表Seq ID N0.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID N0.4所示，并進(jìn)行靶基因的PCR擴(kuò)增；
(3)、陽(yáng)性對(duì)照品pMD-T-colIagenase的制備；
步驟(2)中，靶基因的PCR反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法檢測(cè)用引物對(duì)，其特征在于， 上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示， 下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示。
2.一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法制備陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物對(duì)，其特征在于， 上引物VA-F:如序列表Seq ID N0.3所示， 下引物VA-R:如序列表Seq ID N0.4所示。
3.一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法陽(yáng)性對(duì)照品pMD-T-collagenase的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、PCR模板的制備:溶藻弧菌基因組DNA的提取和純化； (2)、選擇溶藻弧菌collagenase基因作為靶基因，設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物:上引物VA-F ,如序列表Seq ID N0.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID N0.4所示，并進(jìn)行靶基因的PCR擴(kuò)增； (3)、陽(yáng)性對(duì)照品pMD-T-colIagenase的制備； 步驟(2)中，靶基因的PCR反應(yīng)體系如下:

4.一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于， 檢測(cè)溶藻弧菌的PCR反應(yīng)體系如下:

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法檢測(cè)用引物對(duì)，其特征在于，所述的引物對(duì)退火溫度不敏感，有效溫度范圍為48°C~68°C。
6.一種基于DPO引物檢測(cè)溶藻弧菌的PCR方法檢測(cè)用試劑盒，其特征在于， 包括引物對(duì):上引物VA-DPOF:如序列表Seq ID N0.1所示，下引物VA-DPOR:如序列表Seq ID N0.2所示； 陽(yáng)性對(duì)照品(pMD-T-collagenase):如序列表Seq ID N0.5所示； 陰性對(duì)照品(ddH20)和 PCR 反應(yīng)液:10 X PCR Buffer (Mg2+ free) ；dNTP, Mg2+，上游 引物 VA-DPOF,下游引物VA-DP0R和 Taq DNA Polymerase。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103952483SQ201410162619
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】李丹丹, 徐義剛, 高慎陽(yáng), 王綏家 申請(qǐng)人:海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心