一種水蛭的dna條形碼分子鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水蛭(寬體金線蛭)的DNA條形碼分子鑒定的方法和其CO?I序列，使用該方法進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出水蛭CO?I基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖膠進行驗證后送至測序公司進行測序，將測序結(jié)果通過手工校對、序列拼接，并與公開序列進行比對，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1的同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為寬體金線蛭來源。本發(fā)明采用可靠的DNA分子鑒定技術(shù)，快速、準確的鑒定了寬體金線蛭品種，增強了準確性和可靠性，確保了水蛭作為藥材入藥的安全性。
【專利說明】—種水蛭的DNA條形碼分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種寬體金線蛭DNA條形碼分子鑒定方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]寬體金線蛭(學名:Whitmania pigra)是傳統(tǒng)的名貴中藥材,是2010版《中國藥典》收錄的藥材水蛭主要基原動物之一，具有破瘀通經(jīng)，消積散結(jié)等功效，也是疏血通等眾多治療心臟血管疾病中藥的主要原料。因此，對寬體金線蛭的鑒定是入藥的基礎(chǔ)。在我國的藥材市場，大部分動物藥都是貴重、緊缺藥材，通常以粉末等形式入藥，市場較為混亂，鑒別十分困難。至于水蛭，在藥材市場上，來源相對清晰，但是仍有部分偽品在市場內(nèi)流通。目前，傳統(tǒng)的性狀鑒別缺乏準確的內(nèi)部解剖特征或者是在貯藏、加工炮制過程中形態(tài)被嚴重破壞，基于形態(tài)結(jié)構(gòu)細微差別的歸類描述穩(wěn)定性差，可信度低，導致水蛭的鑒定存在很大困難，因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統(tǒng)分類方法的缺陷。
[0003]DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析，從而快速、準確地進行物種鑒定的技術(shù)。目前在動物中最常用的DNA barcode是細胞色素C氧化酶I號基因(COI)的部分序列。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個行之有效的生物鑒定手段，不僅可對傳統(tǒng)鑒定方法作強有力的補充，而且因為其更客觀、準確，突破以往對經(jīng)驗的過度依賴，能幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關(guān)系等。運用DNA條形碼技術(shù)，可以很好的對水蛭的品種進行快速、有效的鑒定。
[0004]本發(fā)明提 供一種關(guān)于寬體金線蛭DNA條形碼分子鑒定的方法，有利于實現(xiàn)寬體金線蛭的快速準確鑒定，縮短鑒定時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明克服目前以形態(tài)學鑒定水蛭方法存在的缺陷，提高寬體金線蛭鑒定結(jié)果的準確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]首先從采集的各種水蛭提取總DNA，利用一對引物進行PCR擴增一段COI基因片段，將擴增產(chǎn)物測序，然后進行序列分析比對，建立各種水蛭的序列標準數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫DNA的基礎(chǔ)上，通過分析在特定條件下的聚合酶鏈式反應的產(chǎn)物結(jié)果，從而達到快速，準確鑒定寬體金線蛭的目的。對需要鑒定的水蛭樣品，提取其總DNA，在給定的條件下，用設(shè)計的特異引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳確定PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果，然后測序，根據(jù)序列比對可以鑒定出寬體金線蛭。本發(fā)明設(shè)計的用于鑒別寬體金線蛭的分子鑒定方法，采用如下步驟:
[0007]1、提取水蛭總DNA按常規(guī)動物DNA提取方法或者血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1 μ g/ μ 1-2 μ g/μ I。
[0008]2、擴增DNA片段，進行聚合酶鏈式反應，即用特異的引物進行擴增，引物對序列為
[0009]1X01490:5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；[0010]HC02198:5/ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
[0011]擴增程序為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環(huán)94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)72°C延伸5分鐘。
[0012]3、將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA marker檢測PCR片段大小。
[0013]4、鑒定結(jié)果的判斷:若出現(xiàn)明顯清晰的709bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物公司測序。
[0014]5、將測序結(jié)果進行手工校對、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ ID N0.1同源性在99%以上，即可判斷所述的待測組織即為寬體金線蛭。
[0015]其中，所述的水蛭DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。
[0016]所述引物，正向引物為5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'反向引物為 5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。[0017]所使用的DNA聚合酶為Pfu高保真酶。
[0018]所述的電泳為I % -2 %的瓊脂糖凝膠電泳。
[0019]所述的條帶大小需要用DNA maker檢測。
[0020]所述的DNA 序列拼接軟件包括 CodonCode Aligner、Sequencher> Genious、DNAstar等軟件。
[0021]與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實現(xiàn)寬體金線蛭的分子鑒定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]附圖為用COI引物擴增水蛭的電泳檢測圖譜，其中泳道M為DNA Marker,泳道NI為陰性對照，泳道Ml~M3依次為樣品Ml，M2，M3。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步說明:
[0024]1、水蛭標本的采集與保存采集品系:W1_湖面自育幼苗養(yǎng)殖I期水蛭;W2_湖面自育幼苗養(yǎng)殖II期-水蛭；W3-隨機市場收集水蛭樣品。采獲的標本經(jīng)10%酒精麻醉處理約20分鐘，再經(jīng)75%酒精浸泡15分鐘處死并保存。
[0025]2、試驗樣品的前處理:取出保存于75%酒精中的水蛭標本，去內(nèi)臟，避免內(nèi)臟內(nèi)容物的污染，剩余部分用蒸餾水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大約20mg解剖剪置入2mlEP管，加入磁珠，震蕩粉碎。蛋白酶K56°C溫浴I小時，至組織完全溶解。加入350 μ I氯仿:異戊醇(24: I)混勻，10，OOOXg室溫離心5分鐘，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
[0026]3、DNA模板制備:采用天根生物公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒DNA進行提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.5 μ g/ μ I。
[0027]4、引物合成:本實施例所用引物如下:
[0028]正向引物5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0029]反向引物5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0030]5、PCR擴增本實施例的PCR反應體系如下:[0031]PCR 反應體系為 25μ 1:ddH208.5uL，2XTaq PCR Master Mixl2.5uL，正向引物 /反向引物(2.5umol)各 luL，DNA 模板 2uL2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑，濃度為2X，且不含染料；擴增程序:反應條件為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環(huán)94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)72°C延伸5分鐘。
[0032]6、瓊脂糖電泳驗證PCR結(jié)果瓊脂糖電泳顯示W(wǎng)l，W2，W3樣品擴增良好，條帶清晰無雜質(zhì)，可直接送測序公司進行測序。
[0033]7、測序結(jié)果序列拼接將測序結(jié)果用CodonCode Aligner生物軟件，將序列導入，將引物剪切后將序列組裝，然后跟SEQ ID N0.1進行比對，Wl, W2與跟SEQ ID N0.1同源率100%，為寬體金線蛭。W3序列與SEQ ID N0.1差異顯著，與藥用植物研究所構(gòu)建的中藥材DNA鑒定網(wǎng)站進行(網(wǎng)址www.tcmbarcode.cn)為日本水輕。
[0034]本發(fā)明所闡述的實施例并不是對本發(fā)明的限定，上述實施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段可以預見或者微調(diào)的變化和改進，均落入本 發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種水蛭的DNA條形碼分子鑒定方法，其特征在于采用DNA條形碼鑒定的水蛭為螞蟲皇Whitmania pigra Whitman,亦稱寬體金線蛭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA條形碼分子鑒定方法，其步驟主要包括: (1)從待測的水蛭組織中分離提取總DNA; (2)以該DNA為模板用一對引物，通過聚合酶鏈式反應擴增出水蛭COI基因； (3)然后取適量步驟(2)的聚合酶鏈式反應擴增出的COI基因產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離鑒定擴增產(chǎn)物大小，送生物公司測序； (4)根據(jù)測序結(jié)果，進行分析比對，如果與所述基因序列SEQID N0.1的同源性在99%以上，即可判斷所述的待測組織即為寬體金線蛭來源。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于引物DNA的序列為:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ；
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚合酶鏈式反應，其特征在于擴增條件為94°C預變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環(huán)；94°C變性I分鐘，50。。退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)；72°C延伸5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述擴增產(chǎn)物，其特征在于擴增片段為709bp，用1%-2%瓊脂糖電泳檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種水蛭的DNA條形碼標準檢測基因序列，其特征在于所述條形碼標準檢測基因為CO I基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID N0.1:
【文檔編號】C12Q1/68GK103898235SQ201410162545
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】李振國, 陳艷明, 務勇圣 申請人:牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司