燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，該燕窩酸醛縮酶突變體由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?5位及第275位的至少一個(gè)突變。本發(fā)明通過對(duì)燕窩酸醛縮酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終獲得具有高催化活性的燕窩酸醛縮酶突變體。并且該突變體以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和三磷酸腺苷二鈉(ATP)為底物具有比親本高出至少50%的燕窩酸醛縮酶催化活性。從而使該燕窩酸醛縮酶突變體可用于生產(chǎn)燕窩酸(唾液酸)，降低了生產(chǎn)成本，提高了相應(yīng)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專利說明】燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]燕窩酸(英文名:Sialic acid)又稱唾液酸或N-乙酰神經(jīng)氨酸，其結(jié)構(gòu)如下圖所示，是一類廣泛存在于生物系統(tǒng)中的天然糖類化合物，在生命體許多重要的生理、生化反應(yīng)過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。N-乙酰神經(jīng)氨酸(燕窩酸)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0003]燕窩酸是中國傳統(tǒng)珍稀食品燕窩中具生物活性的主要成份，也是母初乳中對(duì)嬰兒早期大腦發(fā)育及免疫體系的完善所提供的重要組份之一。由于燕窩中有高含量的燕窩酸，所以有報(bào)道將燕窩酸檢測(cè)用于燕窩產(chǎn)品質(zhì)控評(píng)析。
[0004]大量的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，燕窩酸具有許多十分重要的生物學(xué)功能。人類腦細(xì)胞中的燕窩酸含量是其它動(dòng)物的2倍或以上，這或許是人類大腦的智力遠(yuǎn)高于其他所有動(dòng)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。人類神經(jīng)細(xì)胞膜的燕窩酸含量是身體其它細(xì)胞的很多倍，顯然，燕窩酸是神經(jīng)細(xì)胞信息傳遞的重要物質(zhì)。為證實(shí)燕窩酸對(duì)于兒童智力發(fā)展的重要作用，新西蘭的一組科學(xué)家曾對(duì)超過1000名受試兒童進(jìn)行從出生到高中畢業(yè)為期18年的跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)燕窩酸可提高兒童早期智力發(fā)展水平。研究結(jié)果表明:母乳喂養(yǎng)的兒童在IQ測(cè)試、標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試、教師評(píng)價(jià)以及在中學(xué)時(shí)期的綜合表現(xiàn)的分?jǐn)?shù)均高于非母乳喂養(yǎng)的兒童。由于非母乳喂養(yǎng)初生嬰兒，其所攝入的燕窩酸比母乳喂養(yǎng)要少20%，母乳喂養(yǎng)時(shí)間越長，兒童的綜合智力發(fā)展水平分?jǐn)?shù)越高。因此，科學(xué)家們得出如下結(jié)論:對(duì)嬰幼兒補(bǔ)充燕窩酸，可以增加大腦中燕窩酸的濃度并提聞大腦的學(xué)習(xí)能力，從而提聞大腦的學(xué)習(xí)能力。
[0005]此外，燕窩酸的 其它主要功能有:隨年齡的增長，紅血細(xì)胞表面的燕窩酸含量逐步下降。紅血細(xì)胞表面燕窩酸含量的下降使細(xì)胞易被降解，從而加速衰老過程，故燕窩酸可用于抗衰老。人體表皮細(xì)胞的燕窩酸具有抗菌作用。燕窩酸可保護(hù)皮膚抵抗細(xì)菌感染，故燕窩酸可用于護(hù)膚。
[0006]研究還發(fā)現(xiàn):酗酒者紅血細(xì)胞的燕窩酸含量明顯低于正常人。因此，酗酒者面色蠟黃，皮膚干燥而無色澤。而在介酒后一星期，其紅血細(xì)胞的燕窩酸含量與正常人無差別。所以，燕窩酸與人的容顏有關(guān)。
[0007]并且燕窩酸及以燕窩酸為母體的藥物在國外已應(yīng)用于臨床，可用于治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥、老年性癡呆癥、腫瘤等。
[0008]目前燕窩酸基本上都是通過發(fā)酵或合成得到，生產(chǎn)水平較低、不環(huán)保、又或是成本較高。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)燕窩酸時(shí)，通常先產(chǎn)生聚燕窩酸，聚燕窩酸再進(jìn)行酸水解或酶水解后，分離純化得到燕窩酸。發(fā)酵法生產(chǎn)燕窩酸的主要缺點(diǎn)是:發(fā)酵產(chǎn)率低及純化較困難。化學(xué)法生產(chǎn)燕窩酸是采用N-乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸的鉀鹽縮合，再在堿的催化下脫羧作用可生成N-乙 酰神經(jīng)氨酸；又或在酸性醇溶液中，在銦的催化下，對(duì)N-乙酰甘露糖胺用A-溴甲基丙烯酸進(jìn)行丙烯基化，再進(jìn)行臭氧分解得到N-乙酰神經(jīng)氨酸?；瘜W(xué)法生產(chǎn)燕窩酸化學(xué)法生產(chǎn)燕窩酸得率不高，又不環(huán)保。燕窩酸也可從天然產(chǎn)物中提取，如Lekh等從禽蛋的卵帶和蛋黃膜中提取燕窩酸，馮萬樣、高劍峰等人從豬血中提取燕窩酸。由于燕窩酸在天然原料中含量比較低，分離提純過程也比較復(fù)雜，所以回收率低，并造成較大的環(huán)境污染。酶法生產(chǎn)燕窩酸具有轉(zhuǎn)化率高、提取簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。早在1988年，Simon等人[5]用N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和ATP在燕窩酸醛縮酶的催化下合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。Isafumi等[6]用N-?；咸烟前?-差向異構(gòu)酶先將N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為N-乙酰甘露糖胺，后者再經(jīng)燕窩酸醛縮酶制得燕窩酸，實(shí)現(xiàn)了燕窩酸經(jīng)二酶合成，并簡(jiǎn)化了燕窩酸的純化工藝。但由于燕窩酸醛縮酶之活力較低，工業(yè)規(guī)模將N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸鈉轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燕窩酸時(shí)，轉(zhuǎn)化率低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高。
[0009]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，旨在解決目前酶法生產(chǎn)燕窩酸中燕窩酸醛縮酶催化活力低，轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高的問題。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種燕窩酸醛縮酶突變體，其中，由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?5位及第275位的至少一個(gè)突變。
[0012]所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其中，所述燕窩酸醛縮酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形式、氨基端截?cái)嘈问?、羧基端截?cái)嘈问?，及所述序?的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
[0013]所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其中，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第25位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> [0014]所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其中，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第275位的甘氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> [0015]所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其中，所述燕窩酸醛縮酶突變體具有如序列表中序列3或序列4所示的氨基酸序列。
[0016]一種編碼如上所述的燕窩酸醛縮酶突變體的基因，其中，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得。
[0017]一種如上所述的燕窩酸醛縮酶突變體的應(yīng)用，其中，所述燕窩酸醛縮酶突變體用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和三磷酸腺苷二鈉為底物制備燕窩酸。
[0018]有益效果:本發(fā)明提供一種燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，通過對(duì)燕窩酸醛縮酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終獲得具有高催化活性的燕窩酸醛縮酶突變體。并且該突變體以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和三磷酸腺苷二鈉(ATP)為底物具有比親本高出至少50%的燕窩酸醛縮酶催化活性。從而使該燕窩酸醛縮酶突變體可用于生產(chǎn)燕窩酸(唾液酸)，降低了生產(chǎn)成本 ，提高了相應(yīng)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1為燕窩酸分子結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2為燕窩酸醛縮酶親本與突變體G275A之聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明提供一種燕窩酸醛縮酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022]本發(fā)明提供一種燕窩酸醛縮酶突變體，其中，由序列表中的序列2 (親本序列)經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?5位及第275位的至少一個(gè)突變。
[0023]另外，所述燕窩酸醛縮酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形式、氨基端截?cái)嘈问?、羧基端截?cái)嘈问剑八鲂蛄?的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
[0024]進(jìn)一步地，所述點(diǎn)突變具體為:所述親本序列第25位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?，?或者親本序列第275位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?。親本序列第25位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼嵝纬尚蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列。親本序列第275位的甘氨酸突變?yōu)楸彼嵝纬扇缧蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列。
[0025]本發(fā)明還提供一種編碼如上所述的燕窩酸醛縮酶突變體的基因的DNA，所述基因的DNA由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得。通過該基因的DNA可轉(zhuǎn)錄表達(dá)所述的燕窩酸醛縮酶突變體。主要得到的是序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。該燕窩酸醛縮酶突變體 可用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和三磷酸腺苷二鈉(ATP)為底物生產(chǎn)燕窩酸(唾液酸)
所述燕窩酸醛縮酶突變體的制備的大致過程為:首先構(gòu)建含有親本燕窩酸醛縮酶基因的載體質(zhì)粒，然后設(shè)定定點(diǎn)突變的位點(diǎn)以及突變后的氨基酸種類，再合成適當(dāng)?shù)囊?，以所述的含親本燕窩酸醛縮酶基因的載體質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增DNA片段、裝配所擴(kuò)增的DNA片段以及PCR擴(kuò)增全長突變基因。然后將該全長突變基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)篩選出具有燕窩酸醛縮酶活性的陽性克隆。最后從陽性克隆中提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析，以確定引入的突變，在確定目的片段插入到載體上后，可通過LB培養(yǎng)基篩選，從而獲得具高催化活性的燕窩酸醛縮酶突變體。上述描述中，其中，親本是指來自Escherichia coli BL21 (DE3)的燕窩酸醛縮酶，其核苷酸序列如序列表中序列I所示(參考GenBank NC_012971)，其氨基酸序列如序列2所示(參考GenBank YP_003055660)在上述制備方法中，所采用的載體可以為原核表達(dá)載體，如pRSET和pES21等；也可以為克隆載體，如PUC18/19和pBluscript-SK。
[0026]進(jìn)一步的，所述的燕窩酸醛縮酶突變體基因可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，當(dāng)然也可在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞外表達(dá)。
[0027]進(jìn)一步地，所述載體的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述原核細(xì)胞可以為大腸桿菌。所述真核細(xì)胞可以為釀酒酵母或畢赤巴斯德酵母。
[0028]該突變體可以通過Histag純化方案進(jìn)行純化，經(jīng)酶活測(cè)定后發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的燕窩酸醛縮酶突變體具有比親本高出至少50%的燕窩酸醛縮酶催化活性。
[0029]另外，本發(fā)明提供的燕窩酸醛縮酶的較高催化活性使其可以未經(jīng)純化以粗酶形式使用，也可以是經(jīng)部分純化的或完全純化的酶。當(dāng)然，還可利用固化技術(shù)將本發(fā)明燕窩酸醛縮酶突變體制成固相酶或固相細(xì)胞形式的固化酶。
[0030]在本申請(qǐng)文本中所用的氨基酸三字母或單字母表達(dá)方式，采用IUPAC規(guī)定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem., 138:9-37，1984)。
[0031]以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明制備的燕窩酸醛縮酶突變體及其性能進(jìn)行說明。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。
[0032]實(shí)施例1
親本燕窩酸醛縮酶編碼基因的擴(kuò)增與克隆:
根據(jù)基因庫(GenBank NC_012971)基因序列設(shè)計(jì)引物EC-F和EC-R。用引物對(duì)EC-F和EC-R從Escherichia coli BL21(DE3)中擴(kuò)增燕窩酸醛縮酶編碼基因。
[0033]擴(kuò)增條件為:20mM Tris-HCl (pH 8.8),10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4,
0.1% Triton X-100,50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM 引物EC-F，400 nM引物EC-R，1.0 U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接種環(huán)挑取少許Escherichia coli BL21 (DE3)菌體，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 ml。
[0034]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C 3分鐘，40圈循環(huán):95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分鐘，最后72°C 10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和AscI酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶NdeI和AscI酶切的載體pRSET-A (源自Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-EC。經(jīng)DNA測(cè)序，確定該被克隆的燕窩酸醛縮酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列1，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0035]表1
【權(quán)利要求】
1.一種燕窩酸醛縮酶突變體，其特征在于，由序列表中的序列2經(jīng)點(diǎn)突變所得，所述點(diǎn)突變?yōu)樵谠撔蛄械牡?5位及第275位的至少一個(gè)突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述燕窩酸醛縮酶突變體還包括其變體，其中包括所述序列2所示氨基酸序列中除第25位和第275位外的其它位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形式、氨基端截?cái)嘈问健Ⅳ然私財(cái)嘈问?，及所述序?的部分或全部串聯(lián)重復(fù)形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第25位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述點(diǎn)突變具體為:所述序列2的第275位的甘氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的燕窩酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述燕窩酸醛縮酶突變體具有如序列表中序列3或序列4所示的氨基酸序列。
6.一種編碼如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的燕窩酸醛縮酶突變體的基因，其特征在于，所述基因由序列表中序列I所示的核苷酸序列經(jīng)定點(diǎn)突變所得。
7.—種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的燕窩酸醛縮酶突變體的應(yīng)用，其特征在于，所述燕窩酸醛縮酶突變體用于以N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和三磷酸腺苷二鈉為底物制備燕窩 酸。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK103881997SQ201410126979
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】傅榮昭 申請(qǐng)人:邦泰生物工程(深圳)有限公司