大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為分析大曲中乳酸菌和芽孢桿菌提供一種新選擇。本發(fā)明的技術(shù)方案是大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，包括如下步驟：a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；b、提取基因組DNA；c、擴增；d、定量分析。本發(fā)明方法可用于分析窖泥中的乳酸菌和芽孢桿菌的變化趨勢。
【專利說明】大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法。
【背景技術(shù)】[0002]大曲是一種以小麥為主要原料制成的體積較大并含有多菌酶類的區(qū)塊，并作為糖化劑與發(fā)酵劑應(yīng)用于白酒釀造過程中。俗語說:“有美酒必備佳曲”，“曲為酒骨”，由此可以知大曲對白酒釀造的重要性。大曲的制作到成曲的貯存，都是一個開放作業(yè)的過程，環(huán)境中的微生物參與了大曲制作的整個過程，在不同微生物的生長代謝作用下，大曲逐漸成為含有微生物菌系、微生物酶系和復(fù)合香味物質(zhì)的微生態(tài)制品。因此，大曲中微生物的種類與數(shù)量是影響大曲質(zhì)量的重要因素。前期研究者采用傳統(tǒng)培養(yǎng)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)等方法，對大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析和研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)是大曲微生物菌群中的優(yōu)勢功能菌，但對這兩類微生物在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化情況不清楚。因此闡明發(fā)酵過程中乳酸菌和芽孢桿菌生物量的動態(tài)變化，對大曲制作過程中的質(zhì)量控制、白酒釀造過程中酒醅微生物群落的形成以及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成都具有重要的意義。
[0003]傳統(tǒng)對大曲中微生物定量檢測，仍采用選擇培養(yǎng)基的篩選和純培養(yǎng)分離計數(shù)的方法，但是，該方法受到外界環(huán)境因素，菌種特性等影響，檢測結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時耗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種用于定量檢測大曲制作過程中乳酸菌、芽孢桿菌生物量的動態(tài)變化的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，包括如下步驟:
[0006]a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:設(shè)計針對乳酸菌和芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的特異性引物，然后進行熒光定量PCR，根據(jù)拷貝數(shù)與CT值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0007]b、提取基因組DNA:利用液氮研磨、酶消化結(jié)合的方法提取大曲微生物群落的總DNA ；
[0008]C、擴增:采用乳酸菌和芽孢桿菌的特異性引物，以大曲微生物群落的總DNA為模板，對乳酸菌和芽孢桿菌的特異性片段進行特異性擴增；
[0009]d、定量分析:通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的CT值對窖泥微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌進行定量分析。
[0010]具體的，步驟a和c中擴增乳酸菌的特異性引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0011]具體的，步驟a和c中擴增芽孢桿菌的特異性引物如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0012]乳酸菌特異性引物序列(5' — 3'):
[0013]Lacto-F:AGAACACCAGTGGCGAAGG (SEQ ID N0.1)；
[0014]Lacto-R:CAGGCGGAGTGCTTAATGC (SEQ ID N0.2)。
[0015]芽孢桿菌特異性引物序列(5' — 3'):
[0016]Bacil-F:ATGGCTGTCGTCAGCT (SEQ ID N0.3)；
[0017]Bacil-R:ACGGGCGGTGTGTAC (SEQ ID N0.4)。
[0018]具體的，步驟a的操作如下:從大曲微生物群落中的篩選到乳酸菌、芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌，分別設(shè)計特異性引物，通過細(xì)菌DNA提取試劑盒提取篩選得到的乳酸菌(Lactobacillus crustorum)、芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的 DNA,分別利用設(shè)計的特異性引物對兩種微生物的DNA進行擴增，得到特異性目的片段，再將目的片段與與TA克隆載體連接，獲得重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，提取得到高濃度質(zhì)粒，然將此高濃度質(zhì)粒做10倍比稀釋，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從而進行熒光定量PCR獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]具體的，步驟a和c中的熒光定量PCR擴增體系:總體積25 μ L，體系包括
2.5 μ LlOXBuffer (含有 Mg2+)，2 μ L25mmol/L dNTP 混合物，0.2 μ LlU Taq DNA 聚合酶，I μ LlO μ mol/L引物(正向、反向)，DNA模板用量為I μ L，用ddH20補足至25 μ L0
[0020]具體的，步驟a和c中的熒光定量PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性4min后，進入30個循環(huán)，95°C lmin ；55°C lmin ；72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin0
[0021]具體的，步驟b中利用液氮研磨、酶消化結(jié)合的方法操作如下:稱取Ig大曲樣本，在研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)移至50mL的離心管中。轉(zhuǎn)入離心管加入ImL CTAB抽提液(2%CTAB、5mol/L NaClUmol/L Tris-HCl (pH8.0),0.5mol/L EDTA)和 20 μ L 巰基乙醇至離心管中，65°C恒溫混勻儀振蕩30min，加入5 μ L20mg/mL蛋白酶k，37°C 220r/min30min,室溫6000 X g離心lOmin，收集上清(ImL)加入等體積Tris-飽和酚-氯仿-異戊醇，抽提一次，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積氯仿-異戍醇12000rpm離心IOmin,取上清，重復(fù)兩次；上清液加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，-20°C沉淀lh, 12000rpm離心IOmin,倒掉液體；沉淀用70%乙醇洗滌，12000r/min離心IOmin ;洗滌后的DNA吹干后TE溶解，-20V冰箱保存?zhèn)溆茫黄渲兴龅腃TAB抽提液配方為2%CTAB、5mol/L NaClUmol/L ρΗ8.0的Tris-HCl、0.5mol/L EDTA ;Tris-飽和酚-氯仿-異戊醇的體積比25: 24: I;氯仿-異戊醇的體積比24: I。
[0022]本發(fā)明建立了漸變、快速、準(zhǔn)確的大曲中主要功能微生物的定量方法，以簡化大曲中功能微生物的檢測程序、提高檢測效率，加強對大曲中主要微生物的監(jiān)控，為大曲風(fēng)味物質(zhì)的形成、白酒釀造過程中酒醅微生物群落的形成以及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成機理提供了技術(shù)支持。本發(fā)明運用熒光定量PCR技術(shù)對大曲生產(chǎn)過程中的優(yōu)勢微生物一乳酸菌、芽孢桿菌進行定量分析，并得到這兩類微生物在大曲發(fā)酵和貯存階段的生物量變化情況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1大曲樣品中乳酸菌拷貝數(shù)的動態(tài)變化曲線
[0024]圖2大曲樣品中芽孢桿菌拷貝數(shù)的動態(tài)變化曲線[0025]圖1和圖2中X軸天數(shù)表示大曲生產(chǎn)天數(shù)和儲存天數(shù)【具體實施方式】
[0026]在本發(fā)明中，熒光定量PCR采用Bio-Rad專用定量PCR試劑SsoFast EvaGreen預(yù)混液，該預(yù)混液使用專利的Sso7d融合蛋白技術(shù)，在廣泛的定量PCR應(yīng)用中有卓越的表現(xiàn)。通過新型的熱啟動工程融合聚合酶結(jié)合優(yōu)化的緩沖液和ROX惰性參照染料，在短時間內(nèi)可以獲得重復(fù)性更好，靈敏度更高的定量PCR結(jié)果。飽和的熒光染料EvaGreen能有效增強其與雙鏈DNA結(jié)合的強度和反應(yīng)靈敏度，確保了最好的擴增效率，靈敏性和重復(fù)性，同時熒光強度相較于SYBR Green更高。
[0027]實施例1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
[0028]1、合成針對于乳酸菌、芽孢桿菌的特異性引物，并對大曲中篩選的乳酸菌、芽孢桿菌進行特異性擴增[0029]乳酸菌特異性引物序列(5' — 3'):
[0030]Lacto-F:AGAACACCAGTGGCGAAGG
[0031]Lacto-R:CAGGCGGAGTGCTTAATGC
[0032]芽孢桿菌特異性引物序列(5' — 3')
[0033]Bacil-F:ATGGCTGTCGTCAGCT
[0034]Bacil-R:ACGGGCGGTGTGTAC
[0035]2、大曲中乳酸菌、芽孢桿菌的篩選及標(biāo)準(zhǔn)菌株的確定:
[0036]a.乳酸菌的篩選:
[0037]乳酸菌的篩選培養(yǎng)基:葡萄糖2%w/w,蛋白胨l%w/w,牛肉膏l(xiāng)%w/w,酵母提取物 0.5%w/w, K2HPO40.2%w/w,檸檬酸三銨 0.2%w/w,乙酸鈉 0.5%w/w,吐溫 800.1%ν/ν,MgSO4.7Η200.05%w/w, MnSO4.4Η200.025%w/w, ρΗ6.2 ~6.4，瓊脂 1.5%w/w, 121。。，20min 滅菌后,加入滅菌的CaCO3溶液2%v/v。
[0038]取Ig大曲樣品梯度稀釋至10_6，稀釋涂布，37 °C培養(yǎng)48h，挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落，多次分離純化，鏡檢得到純種，16S rDNA鑒定，_20°C甘油管保存。
[0039]b.芽孢桿菌的篩選:
[0040]芽孢桿菌篩選培養(yǎng)基:胰蛋白胨l%w/w,酵母提取物0.5%w/w,氯化鈉(NaCl) l%w/w,瓊脂 1.5%w/w, pH7.2 ~7.4,121 °C，20min 滅菌。
[0041]取Ig大曲樣品制成菌懸液，80°C水浴lOmin，梯度稀釋至10_5，稀釋涂布，37°C培養(yǎng)48h，挑選生長菌落，多次分離純化，鏡檢得到純種，16S rDNA鑒定，_20°C甘油管保存。
[0042]選取篩選的I株乳酸菌(Lactobacillus crustorum)、I株芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒對2種微生物的DNA進行提取。
[0043]3、得到特異性擴增目的片段
[0044]分別以2株純菌的DNA為模板，以Lacto-F/Lacto-R、Baci 1-F/Baci1-R為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系:總體積25 μ L，體系包括2.5 μ LlO X Buffer (含有Mg2+)，2μ L25mmol/L dNTP 混合物，0.2 μ LlU Taq DNA 聚合酶，I μ LlO μ mol/L 引物(正向、反向)，DNA模板用量為I μ L，用ddH20補足至25 μ L。[0045]PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性4min后，進入30個循環(huán)，95°C lmin ；55°C lmin ；72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin0
[0046]擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，乳酸菌目的片段大小為170bp、芽孢桿菌的目的片段大約為300bp，并將PCR產(chǎn)物割膠回收。
[0047]4、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0048]挑取JM109平板上單菌落至5mL LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)的種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接入15mL LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm培養(yǎng)1.5h左右至0D600為
0.3~0.5之間；分裝ImL菌液至1.5mL離心管中，冰浴20min后迅速離心,4°C、5000rpm離心IOmin ;徹底棄去上清，加入400 μ L0.lmol/L預(yù)冷的CaCl2溶液重懸菌體，再冰浴30min ；4°C、5000rpm離心lOmin,棄去上清液,倒置Imin ;用80 μ L0.lmol/L預(yù)冷的CaCl2溶液重懸菌體，冰上放置30min。
[0049]5、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0050]將pMD19-T Vector和目的片段以1: 3比例連接，16°C連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，然后將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞涂布于含有氨卞青霉素(lOOyg/mL)的LB平板上，37°C培養(yǎng)12~16h，挑取陽性菌落，于含有氨芐青霉素(100μ g/mL)的液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)8~10h。用培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，在此利用設(shè)計的引物進行質(zhì)粒擴增驗證，如果瓊脂糖凝膠在170bp、300bp左右有可見的目的條帶，可以確定目的片段已成功插入PMD19-T Vector，將其提取的質(zhì)粒做10倍比稀釋，測定OD值，取平均值計算拷貝數(shù)，具體計算公式如下:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，其特征在于:包括如下步驟: a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:設(shè)計針對乳酸菌和芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌的特異性引物，然后進行熒光定量PCR，根據(jù)拷貝數(shù)與CT值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線；b、提取基因組DNA:利用液氮研磨、酶消化結(jié)合的方法提取大曲微生物群落的總DNA ； C、擴增:采用乳酸菌和芽孢桿菌的特異性引物，以大曲微生物群落的總DNA為模板，對乳酸菌和芽孢桿菌的特異性片段進行特異性擴增； d、定量分析:通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的CT值對窖泥微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌進行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，其特征在于:步驟a和c中擴增乳酸菌的特異性引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，其特征在于:步驟a和c中擴增芽孢桿菌的特異性引物如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
4.如權(quán)利要求1~3任一項所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，其特征在于:步驟a的操作如下:從大曲微生物群落中的篩選到乳酸菌、芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌，分別設(shè)計特異性引物，通過細(xì)菌DNA提取試劑盒提取篩選得到的乳酸菌、芽孢桿菌的DNA，分別利用設(shè)計的特異性引物對兩種微生物的DNA進行擴增，得到特異性目的片段，再將目的片段與與TA克隆載體連接，獲得重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，提取得到高濃度質(zhì)粒，然將此高濃度質(zhì)粒做10倍比稀釋，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從而進行熒光定量PCR獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.如權(quán)利要求1~4任一項所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢桿菌的定量分析方法，其特征在于:步驟a和c中的熒光定量PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性4min后，進入30個循環(huán)，95°C Imin ；55°C Imin ；72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin0
【文檔編號】C12Q1/06GK103834745SQ201410119397
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 肖辰, 王松濤 申請人:瀘州品創(chuàng)科技有限公司, 江南大學(xué)