稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記、標(biāo)記方法、引物與用途
【專利摘要】本發(fā)明是一種稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。本發(fā)明還公開了一種PCR擴(kuò)增稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物；以及稻瘟病抗性基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記在Pi-ta抗性位點(diǎn)的基因分型或者Pi-ta基因的輔助選擇育種中的用途，本發(fā)明還公開了稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記的功能標(biāo)記方法。本發(fā)明具有操作簡便、節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于育種中的大規(guī)模Pi-ta抗性基因鑒定及標(biāo)記輔助選擇育種，適于推廣應(yīng)用。
【專利說明】稻瘍病抗病基因/V-1a輔助育種的InDeI分子標(biāo)記、標(biāo)記方法、引物與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及稻瘟病抗病基因的功能標(biāo)記、標(biāo)記方法、擴(kuò)增引物與用途，屬于作物分子育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻稻痕病由子囊菌Magnaporthe grisea (Hebert)Barr引起，是世界水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，每年因稻瘟病導(dǎo)致的損失，約占總產(chǎn)量的10-15% (Zheng etal.，2009)。目前，控制稻瘟病的主要手段是噴灑農(nóng)藥和應(yīng)用抗病品種，前者會對環(huán)境造成一定的污染，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展；后者雖是安全有效的途徑，但由于稻瘟菌生理小種的易變性，往往會導(dǎo)致單個(gè)抗病位點(diǎn)的水稻品種在種植3-5年后將會喪失抗性。實(shí)踐證明聚合多個(gè)抗病基因可有效持久抵御稻瘟病的侵染，因此，挖掘并合理利用抗病種質(zhì)資源是解決這一病害的最佳舉措。截至2013年8月，已至少報(bào)道了 68個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共83 個(gè)主效基因(http://www.ricedata.cn/gene/gene_p1.htm),據(jù)此，前人已開發(fā)了一批與這些基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或基因序列本身的功能標(biāo)記(Qu et al.，2006，Liu etal.，2008，Zhang et al.，2013)，它們?yōu)樗究共』蚍中图翱共【酆嫌N奠定了基礎(chǔ)。
[0003]P1-ta是一個(gè)具廣譜抗性的顯性稻瘟病抗性基因，該基因編碼產(chǎn)物能與稻瘟病菌的無毒基因J互作，引起抗病反應(yīng)(Byran et al.，2000)。因此，挖掘并有效利用該基因?qū)⒂兄谒镜疚敛〉目剐杂N研究。前人利用該基因抗性位點(diǎn)與感病基因有一個(gè)堿基的差異，開發(fā)出三引物或四引物的SNP標(biāo)記，但其中或存在檢測過程較為復(fù)雜，或?qū)υ囼?yàn)條件要求較高，不利于規(guī)?；瘜π?te抗性位點(diǎn)分型及標(biāo)記輔助育種(Jia etal., 2004, Hayashi et al., 2006, Wang et al., 2007, Zhang et al., 2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種稻瘟病抗性基因P1-1a輔助育種的InDel (insertion-deletion)分子標(biāo)記,其能用于P1-1a基因的輔助選擇育種，同時(shí)有助于抗性位點(diǎn)的快速、系統(tǒng)地分型。
[0005]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供了前述稻瘟病抗病基因朽-te輔助育種的InDel分子標(biāo)記的標(biāo)記方法、擴(kuò)增引物與用途。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種稻瘟病抗性基因輔助育種的InDel分子標(biāo)記,該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0007]本發(fā)明的稻瘟病抗性基因朽輔助育種的InDel分子標(biāo)記，是基于PCR技術(shù)，PCR擴(kuò)增引物為下列引物對，核苷酸序列為5’ 一 3’，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC (SEQ ID N0.2),
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA (SEQ ID N0.3)
本發(fā)明還提供了稻瘟病抗性基因朽-to輔助育種的InDel分子標(biāo)記的具體用途:用于對P1-ta抗性位點(diǎn)的基因分型，或用于P1-1a基因的輔助選擇育種。
[0008]發(fā)明人在發(fā)明過程中，
首先，根據(jù)目前含有PHa抗病基因品種的序列，與感病品種“日本晴”序列比對，在朽-te抗病基因的2373位置，找到一個(gè)感病品種“日本晴”在該位置的一個(gè)“T”堿基的插入。
[0009]然后，本發(fā)明在插入的兩側(cè)開發(fā)了一對引物，利用該標(biāo)記我們已對46份重要品種進(jìn)行抗性位點(diǎn)的基因分型，并與四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR相互比較，分型結(jié)果完
全一致。[0010]本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容如下:為了能夠找到一個(gè)便于應(yīng)用的朽-1a分子功能標(biāo)記，我們根據(jù)已公布的抗病位點(diǎn)在不同品種中的序列，比較抗感序列之間的單核苷酸多態(tài)性，于朽-h基因的2373位置找到一個(gè)在感病品種中的單“T”插入(圖1)。利用這個(gè)SNP設(shè)計(jì)了一個(gè)InDel分子標(biāo)記，并對46份重要品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用12%PAGE(polyacrylamide gelelectrophoresis)電泳檢測到25份和陽性對照一致的帶型，其余21份則為陰性帶型；同時(shí)，我們還應(yīng)用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測這些品種，得到完全一致的結(jié)果(圖2，3)。該InDel標(biāo)記能對很多品種進(jìn)行有效的分型，可提高A'-1a基因在育種中的效率。
[0011]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有操作簡便、節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于育種中的大規(guī)模抗性基因鑒定及標(biāo)記輔助選擇育種，適于推廣應(yīng)用。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1,含P1-ta抗性基因的不同水稻品種與感病品種“日本晴”在InDel標(biāo)記位點(diǎn)的序列Alignment分析圖,框內(nèi)堿基即為本發(fā)明的InDel標(biāo)記所在的SNP位點(diǎn)；
圖2,本發(fā)明InDel標(biāo)記的設(shè)計(jì)圖；
圖3,不同水稻品種的InDel分子標(biāo)記的電泳分析圖；
圖3中:M:marker; 1-48:Tet印、日本晴、早恢89、圭630、鹽都295、鎮(zhèn)稻187、連嘉粳I號、長粒爪、C101PKT、培矮64、連豐糯、F-124-1、明恢63、桂朝2號、寧恢627、吉粳509、鹽豐47、鹽粳456、圣稻068、鹽粳16、嘉花I號、新稻22、新稻10號、明恢86、蜀恢527、廣恢128、遼粳727、臺灣50、連粳7號、密陽46、9311、揚(yáng)稻2號、臺灣65、抗鹽100、Tequing、臺灣30、寧恢311、津1007、先恢207、津原85、津粳235、鄭稻19、蜀恢881、中花15、廣占63S、巴西陸稻、淮糯12、臺灣65。
[0013]圖4，按圖3不同水稻品種的順序，采用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR擴(kuò)增的電泳分析圖；
圖5，按明恢86和蜀恢527配組的F2代，1:明恢86，2:蜀恢527，3-23是F2代株系。
[0014]【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0015]實(shí)施例1，一種稻痕病抗病基因輔助育種的InDel分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0016]實(shí)施例2，一種PCR擴(kuò)增實(shí)施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a輔助育種的InDel分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物，所述的PCR擴(kuò)增引物為下列引物對，其核苷酸序列為5’ 一 3’正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
[0017]實(shí)施例3，實(shí)施例1所述的稻瘟病抗性基因P1-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記在P1-ta抗性位點(diǎn)的基因分型或者基因的輔助選擇育種中的用途。
[0018]實(shí)施例4，參照圖1-5，實(shí)施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a輔助育種的InDel分子標(biāo)記的功能標(biāo)記方法，其步驟如下:
1.根據(jù)對含朽-1a抗性基因的7個(gè)品種——(Tetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1)測序，其序列分別參見SEQ ID N0.4 — SEQ ID N0.10，并與日本晴序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)在朽-te基因的2373位點(diǎn)處，感病品種“日本晴”有一個(gè)” T”插入，由此，我們在此SNP前后設(shè)計(jì)一對PCR引物，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，
PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在朽-te抗性基因?yàn)?4 bp,感病基因?yàn)?5 bp。圖1為以Tet印的P1-ta基因?yàn)閰⒄?，與截取其它品種中的包含設(shè)計(jì)引物序列的比對。
[0019]2.DNA提取:按CTAB法提取水稻基因組DNA。
[0020]3.PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 X Taq Master Mix 12.5 μ I,上游引物(10μ mol/L) I μ?，下游引物(10 μ mol/L) I μ?,模板DNA I μ?,反應(yīng)總體積25 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min，4°C保存。
[0021 ] 4.PCR產(chǎn)物電泳:配制12%的PAGE，取步驟3擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物2.0 μ I，以DNAMARKERDL500作為分子量對照，親本分型采用雙垂直電泳槽，在170V恒壓下電泳1:30小時(shí)，F(xiàn)2分型采用垂直電泳槽，在100V恒壓下電泳10:00小時(shí)。銀染顯示DNA條帶。
[0022]5.電泳圖譜分析:用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過比對DNAMarker找到目標(biāo)條帶，根據(jù)片段大小判斷抗感基因。
[0023]SEQ ID N0.1中2343— 2435序列為該發(fā)明設(shè)計(jì)引物的區(qū)域。
[0024]為了證明本發(fā)明的適用性，本發(fā)明設(shè)置了如下對比試驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)1，隨機(jī)選取國內(nèi)不同地區(qū)比較有代表性的品種46個(gè)，以本發(fā)明的PCR標(biāo)記與前人開發(fā)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增對比分析，結(jié)果完全一致。
[0025]實(shí)驗(yàn)2，以本發(fā)明標(biāo)記分型的抗性品種明恢86與感性品種蜀恢527雜交，F(xiàn)2代隨機(jī)取樣21株進(jìn)行抗性位點(diǎn)的基因分型(如圖5)，結(jié)果顯示抗性、感性及雜合帶型都能比較明顯區(qū)分出來。
[0026]以上列舉的僅限于本發(fā)明具體實(shí)施例，事實(shí)上還應(yīng)有許多變形，若本領(lǐng)域的相關(guān)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或引申出的所有變形，均應(yīng)為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]SEQUENCE LISTING
〈110〉江蘇金萬禾農(nóng)業(yè)科技有限公司 江蘇勝田農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司 〈120〉稻痕病抗病基因P1-ta輔助育種的InDel分子標(biāo)記、標(biāo)記方法、擴(kuò)增引物與用途 〈160〉 10
<170> PatentIn version 3.3
【權(quán)利要求】
1.一種稻痕病抗病基因/輔助育種的InDel分子標(biāo)記,其特征在于:該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.—種PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗病基因輔助育種的InDel分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增引物為下列引物對，其核苷酸序列為5’ 一3’
正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2 ； 反向引物:TAGITTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
3.權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗性基因輔助育種的InDel分子標(biāo)記在Pi_ta抗性位點(diǎn)的基因分型或者基因的輔助選擇育種中的用途。
4.權(quán)利要求1所述的稻瘟病抗病基因輔助育種的InDel分子標(biāo)記的功能標(biāo)記方法，其特征在于，其步驟如下: (I)引物設(shè)計(jì):根據(jù)對含朽-1a抗性基因的7個(gè)品種SEQ ID N0.4- SEQ ID N0.10, BPTetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1 進(jìn)行測序，并與日本晴序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)在朽-te基因的2373位點(diǎn)處，感病品種“日本晴”有一個(gè)“T”插入，由此，在此SNP前后設(shè)計(jì)一對PCR引物，正向引物:GTACATGTTTCATACCC,反向引物:TAGTTTAGTCGCCTM，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在朽-1a抗性基因?yàn)?4 bp,感病基因?yàn)?5 bp ; (2) DNA提取:按CTAB法提取水稻基因組DNA ； (3)PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:2 X Ta^Master Mix 12.5 μ 1,10 μ mol/L 上游引物I μ 1， 10 μ mol/L下游引物I μ I,模板DNA I μ I,反應(yīng)總體積25 μ I ;反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min， 94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸.10 min，4°C保存； (4)PCR產(chǎn)物電泳:配制12%的PAGE，取步驟3擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物2.0 μ 1，以DNAMARKERDL500作為分子量對照，親本分型采用雙垂直電泳槽，在170V恒壓下電泳1:30小時(shí)，F(xiàn)2分型采用垂直電泳槽，在100V恒壓下電泳10:00小時(shí)；銀染顯示DNA條帶； (5)電泳圖譜分析:用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過比對DNAMarker找到目標(biāo)條帶，根據(jù)片段大小判斷抗感基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK103834648SQ201410112643
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】溫以斌, 劉輝, 查日揚(yáng), 孟德龍, 潘啟民 申請人:江蘇金萬禾農(nóng)業(yè)科技有限公司, 江蘇勝田農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司