專利名稱：雙t-dna植物表達(dá)載體在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，具體涉及雙T-DNA植物表達(dá)載體在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊花是世界上最重要的觀賞花卉之一，也是我國歷史悠久的傳統(tǒng)名花，在花卉生產(chǎn)中占有重要位置。菊花是一種短日照植物，對光周期具有一定的依賴性，滿足菊花周年生產(chǎn)，獲得花期提前或延遲的新品種以適應(yīng)國內(nèi)外市場的需求對提高菊花生產(chǎn)技術(shù)水平、降低成本、搶占國內(nèi)外市場具有十分重要的意義。多年來，雖然傳統(tǒng)育種方法在菊花花期改良上取得了巨大成就，但都受到物種自身基因及雜交親和性的限制。轉(zhuǎn)基因育種可以打破植物物種間的生殖隔離障礙，提高育種研究的精確性，縮短育種時間，并定向地改變植物的性狀，為觀賞植物育種提供了一條新的途徑。LFY基因是一種花分生組織特性基因，它最早是從野生型擬南芥中克隆出來的，前人的研究證明它有促進(jìn)植物開花的作用，因此將其導(dǎo)入菊花中有可能在不進(jìn)行人工光周期處理條件下實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本。然而，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)還存在一些限制因素，轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍使用選擇標(biāo)記來篩選轉(zhuǎn)基因植株，它們大多是一些編碼抗生素抗性或除草劑抗性的基因，一旦獲得轉(zhuǎn)基因植株這些選擇標(biāo)記便失去意義。并且還存在一些潛在的不利因素，主要表現(xiàn)在以下方面1)標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物可能有毒或?qū)θ祟惍a(chǎn)生過敏反應(yīng)。2)這些抗生素抗性基因可能水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入人類腸道微生物或上皮細(xì)胞，使抗生素類藥物失去作用。3)這些基因可能通過轉(zhuǎn)基因植物與其近緣野草自然雜交而垂直轉(zhuǎn)移進(jìn)入野草中，使雜草具有抗除草劑的作用，有可能破壞生態(tài)平衡。4)如果還想導(dǎo)入其他基因便不能重復(fù)使用相同的選擇標(biāo)記，因此不利于多次重復(fù)轉(zhuǎn)化。因此，去除選擇標(biāo)記可以減少人們對轉(zhuǎn)基因植物食品安全性和環(huán)境安全性的憂慮，允許相同的選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化同一植株，還可避免重復(fù)的啟動子、中止信號序列等引起的基因沉默或基因重排現(xiàn)象，有利于多種性狀的組合。另外，去除選擇標(biāo)記還避免了對該標(biāo)記基因進(jìn)行復(fù)雜的風(fēng)險性評價。對于觀賞植物而言，培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因觀賞植物，可最大限度地發(fā)揮轉(zhuǎn)基因技術(shù)在觀賞植物育種中的優(yōu)勢，將更多、更新奇實(shí)用的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中，從而培育出綜合品質(zhì)更高的新品種。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供雙T-DNA植物表達(dá)載體在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述的應(yīng)用是將目標(biāo)基因和選擇標(biāo)記基因分別構(gòu)建到兩個T-DNA結(jié)構(gòu)
3域內(nèi)，再將所述的兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域整合到同一植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化菊花，轉(zhuǎn)基因菊花自交分離后獲得無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系。其中，所述的目標(biāo)基因為LFY基因。在一個具體的實(shí)施方案中，將花期調(diào)控基因LFY和選擇標(biāo)記基因hpt構(gòu)建到兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域內(nèi)，再將所述的兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域整合到同一植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化菊花，轉(zhuǎn)基因菊花自交分離后獲得花期提前且無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系。其中，所述的菊花優(yōu)選為地被菊。本發(fā)明通過將分別攜帶LFY和hpt基因的雙T-DNA植物表達(dá)載體整合進(jìn)菊花基因組，對自交分離后代進(jìn)行鑒定，獲得使花期適當(dāng)提前且不含有選擇標(biāo)記基因的品系。


圖1所示為雙T-DNA表達(dá)載體的構(gòu)建過程。圖2所示為雙T-DNA表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖。圖3所示為含LFY基因重組載體酶切鑒定。M =DNA markerDL15000 ；1為BamHI酶切；2為RiilI酶切；3為未酶切的質(zhì)粒。圖4表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的PCR鑒定結(jié)果。M:DNA markerDL15000 ；1，4為陰性對照；2，3為LFY基因擴(kuò)增產(chǎn)物；5，6為hpt基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5所示為部分Ttl代共轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交分析。P為質(zhì)粒陽性對照；N未轉(zhuǎn)化植株陰性對照；A. hpt探針；B. LFY探針；1，2，3，6共轉(zhuǎn)化植株。圖6所示為部分T2代植株的Southern雜交分析。P為質(zhì)粒陽性對照，N為未轉(zhuǎn)化植株陰性對照，A. hpt探針，B. LFY探針。圖7所示為T2代植株表型性狀。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中涉及的酶均為 Takara ( 。實(shí)施例1雙T-DNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明雙T-DNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖1所示，其中，雙T-DNA的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。同過常規(guī)方法擴(kuò)增擬南芥LFY cDNA全長，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物直接連接在pBS-Τ(可市售獲得)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定以及測序鑒定后，用HindIII和BamHI酶切，切下LFY基因片段，酶切體系如下表1所示。表1酶切反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.雙T-DNA植物表達(dá)載體在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將目標(biāo)基因和選擇標(biāo)記基因分別構(gòu)建到兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域內(nèi)，再將所述的兩個T-DNA結(jié)構(gòu)域整合到同一植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化菊花，轉(zhuǎn)基因菊花自交分離后獲得無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的目標(biāo)基因為LFY基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的選擇標(biāo)記基因為hpt。
5.如權(quán)利要求1 4任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的菊花為地被菊。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙T-DNA植物表達(dá)載體在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過將分別攜帶LFY和hpt基因的雙T-DNA植物表達(dá)載體整合進(jìn)菊花基因組，自交分離后代進(jìn)行鑒定，獲得使花期適當(dāng)提前且不含有選擇標(biāo)記基因的品系。
文檔編號C12N15/82GK102559743SQ201110439988
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者孫磊, 張啟翔, 程堂仁, 高亦珂 申請人:北京林業(yè)大學(xué)