專利名稱：一種中性植酸酶phymj11及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種土地桿菌尸^fo6fl"w sp. MJll，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2503，以及從其中得到的中性植酸酶PHYMJll及其基 因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是一種所有動(dòng)物生長都需要的重要礦物質(zhì)。在動(dòng)物日糧中提供充足的磷是非 常重要的。長期磷缺乏會(huì)導(dǎo)致生長動(dòng)物的佝僂病和成年動(dòng)物的骨質(zhì)疏松癥，從而影響 動(dòng)物的生長性能。目前在動(dòng)物詞料中添加無機(jī)磷如磷酸氫鈣來滿足動(dòng)物對磷的需求。 但是在主要以植物性飼料為主的動(dòng)物日糧中本身就含有豐富的磷，只不過是因?yàn)樗?們主要以動(dòng)物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆類和油料等作物籽實(shí)中磷和肌醇的基本貯存形式，含量高達(dá)1 一5%，它占植物中總磷的60—80%。但是，以植酸磷形式存在的磷卻因單胃動(dòng)物體 內(nèi)缺乏能分解植酸的酶而難以被利用，其利用率僅在0—40%。植酸磷不能被動(dòng)物有 效利用，從而在飼喂過程中造成了許多問題,第一、造成磷源浪費(fèi)， 一方面飼料中的 磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對磷的需求,又必須在詞料中額外添 加無機(jī)磷，提高了飼料成本。在實(shí)際生產(chǎn)中，添加無機(jī)磷時(shí)還常因無機(jī)磷中殘留有 氟、重金屬等元素而造成動(dòng)物中毒。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境，飼料中85% 左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。因 此，防止磷對環(huán)境的污染更具有特殊的意義。第三、植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,它 在動(dòng)物腸胃道的消化吸收過程中會(huì)與多種金屬離子Zn2+、 Ca2+、 Cu2+、 F,等以及蛋白 質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動(dòng)物對這些營養(yǎng)元素的有效利用。
植酸酶(EC. 3. 1. 3. 8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷
酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如枯草芽孢桿菌、假單孢桿菌、乳酸桿菌、大 腸桿菌、酵母及曲霉等。
植酸酶的詞喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證。它可使植物性飼料中磷的利用 率提高60%，糞便中磷排泄量減少40%,還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此對提 高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，植酸酶已經(jīng)成為飼料添加劑和酶制劑研究的熱點(diǎn)。重點(diǎn) 的研究方向之一就是通過基因工程的手段,利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)植酸酶基因， 可望達(dá)到大幅度提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的。
單胃畜禽和淡水魚類詞料中都需要使用植酸酶，但它們對植酸酶的性質(zhì)有不同 的要求。對單胃畜禽而言，植酸酶的主要作用場所是單胃動(dòng)物酸性的胃中，因而要求 植酸酶在酸性條件下要有較高的酶活性，即酶反應(yīng)的最適pH值為酸性的植酸酶。
以往的研究主要集中在用于單胃畜禽動(dòng)物飼料中的植酸酶，如來源于酵母 & ccfejrawt_yces cwW由e(Bajwa W a/" 1984; Meyhack ef cr/" 1982)、 Aj! er^7/ws m'ger(MacRae, 1988)、 A te rei/s禾口 jVfyce/!-o/ 秘ora Ac_pMa (Van Loon, 1995)、 A m'ger(/ cw麵)(Van Hartimgsveldt " a/., 1993; Ehlich W a/., 1993; Bin Y " a/., 1998)、 Aw'ger var, a而腳n'(Piddington " a/.， 1993)、 ra/ara，ces AermopMtw (Pasamontes L fl/" 1997)、 ra/arawyces /a"wg^wsws (Berka R M " a/" 1998)、 ￡>nef7'ce//a m'^/tms (Pasamontes L W a/, 1997)、 5t/2麗朋/畫yces occfc/ento!fc(Mochizuki, 1998)等的植酸酶。 而這些植酸酶在pH6. 5以上基本沒有酶活性。
對于淡水養(yǎng)殖的主要魚類一鯉科魚類來說，因?yàn)樗鼈儫o胃，只有pH值呈中性 (p服.5~8. 0)的腸道，因而在魚類飼料中必需使用在中性pH值條件下有高活性的植 酸酶。目前商品化生產(chǎn)的用于單胃畜禽的植酸酶在中性pH值環(huán)境下基本沒有酶活性， 因而不能用于鯉科魚類飼料。到目前為至，還未有在中性環(huán)境下具有高酶活性的植 酸酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種土地桿菌尸^foto"er sp. MJ11 。
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用于淡水魚類的中性植酸酶。
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述中性植酸酶的基因。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中性植酸酶的基因工程方法。
本發(fā)明的另一目的提供上述中性植酸酶的應(yīng)用。
本發(fā)明篩選得到土地桿菌尸^fo&cter sp. MJ11(微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 2503;
保藏時(shí)間是2008年05月19號(hào)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通
4微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。)
本發(fā)明提供了一種中性植酸酶PHYMJll ，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 SEQ ID NO. 1:
MPLFGTTGQQ HVNLYL畫KP NPILCLATSL LLFTTACRQN QPANTAAIKP LYVSEPVQFD 60
SDDPAIWVNP ADSSKSLIIG TDKDENGGLY VFDLQGKIIK EKTVKGLKRP 麗VDVAYGLK 120
LGGKQVDIAV ATERMTHKLR VFSLPDMQPI DNGGLPMFEG ETGELYRDLM GIAMYTDPQG 180
QIYAIVGRKS GPKEGGYLWQ YLLEDNGKGQ LKATLKRKFG KYSGKKEIES IAVDNELGYI 240
YYSDEQFGVR KYYADPAKGN QELALFATTG FKEDNEGISI YKTTDSTGYI LVSDQAANHF 300
QVFNREGTKQ DPNKHVLITS LPTSTNNSDG SDIYSKALNN DFKHGLFVAM SDNKTFQLYR 360
WEDLAGKKLK INK 373
本發(fā)明提供了編碼上述中性植酸酶的基因；^WW力h其基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
SEQ ID NO. 2:
atgccgttgt tcgggacaac cggacaacag catgtaaacc tatatttaat gaataaacct 60
aatccaattc tctgtcttgc aacatcctta ttattattta cgacagcttg ccgccaaaat 120
caaccagcta acaccgctgc tatcaagcca ctttatgtat ctgaacctgt acaattcgat 180
tctgatgacc ctgcgatatg ggtaaatcct gccgatagtt ccaaatcatt aatcattgga 240
accgacaaag atgaaaatgg cggactgtat gtttttgatt tgcagggaaa aatcattaaa 300 gaaaaaaccg taaaaggact aaagcgacct aataacgttg atgtggccta tggcttaaag 360cttggtggga agcaagtaga tattgctgta gctacagagc gaatgacgca taaactcaga420
gtattctctt tacctgatat gcaaccgatc gacaatggtg gactgccgat gtttgaaggt480
gaaaccggcg aactatacag agacctgatg ggcattgcga tgtacacaga tccccaaggg540
caaatctatg ctattgtagg ccgcaaatct ggcccgaagg aagggggata tttgtggcaa600
tacttactgg aagacaatgg caaaggccag ttgaaagcca ccttaaaaag gaagtttggt660
aaatatagcg gcaaaaaaga gatcgaatct atagcggttg acaacgagct aggctatatc720
tactattctg acgagcaatt tggcgttaga aagtactacg ctgatccagc aaaaggaaac780
caggaactgg ctttatttgc tacaactgga tttaaagagg ataacgaagg gatcagtatt840
tataaaacta ccgatagcac tgggtatata ttggtttctg atcaggcagc aaatcacttt■
caggtattta atcgagaggg cactaaacaa gatcccaaca agcatgtgtt gatcactagc960
ctccctacct ccaccaacaa tagcgatggt tctgatatct attcaaaagc acttaacaat1020
gactttaagc atgggctctt tgttgcgatg agtgataaca aaacgttcca actttatcgc1080
tgggaagacc tggcggggaa gaaattgaag attaataaat aa1122
本發(fā)明還提供了包含上述中性植酸酶基因p M刀7的重組載體，優(yōu)選為本發(fā)明還提供了包含上述述中性植酸酶基因p/y^/7/的重組菌株，優(yōu)選所述菌 株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
本發(fā)明還提供了一種制備中性植酸酶PHYMJll的方法，包括以下步驟
1) 用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組植酸酶表達(dá)；以及
3) 回收并純化所表達(dá)的植酸酶PHYMJll。 本發(fā)明還提供了上述中性植酸酶PHYMJll的應(yīng)用。
本發(fā)明獲得一種中性植酸酶，其最適pH值為7.0，同時(shí)在pH5 9的范圍內(nèi)均具 有高的酶活性。且PhyMJll在偏中性的條件下，水解豆粕中植酸磷的能力優(yōu)于目前 生產(chǎn)中常用植酸酶，這些性質(zhì)使其更適于應(yīng)用于淡水魚類養(yǎng)殖用飼料中。


土地桿菌尸e^6a"wsp. MJ11 (微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 2503;保藏時(shí)間是
62008年05月19號(hào)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。)
圖1在大腸桿菌中表達(dá)的重組植酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋 白質(zhì)Marker; 1:含有植酸酶基因的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；2:純化的重組植酸酶。 圖2重組植酸酶的最適pH。 圖3重組植酸酶的pH穩(wěn)定性。 圖4重組植酸酶的最適溫度。 圖5重組植酸酶的熱穩(wěn)定性。 圖6植酸酶PhyMJll水解豆粕中植酸磷的能力
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)條件
1、 菌株及載體
土地桿菌尸ecfoto"^"sp. MJ11 (微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 2503;保藏時(shí)間是 2008年05月19號(hào)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。)
大腸桿菌^sc/ er油'a c。力'BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-22b(+)-lie (購自 Novagen公司)。
2、 酶類及其他生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 PNPGal、植酸鈉等底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑。
3、 培養(yǎng)基土地桿菌及大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl， pH7.0)。
本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未
作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來進(jìn)行，包括
Sambrook等人，她/ecw/ar C/,'"g, ^ Za6oraZ" Mwwa/ (第3版.2001); Kriegler, Gewe 7hm^r Za60rato 7 Mwwa/ (1990); 禾口 Cw/re"/1 /w
Mo/ecw/ar(Ausubel等人編，1994)。
實(shí)施例l產(chǎn)植酸酶土地桿菌(PWotoc/wsp.MJ11)的篩選和特性
土地桿菌(i^^6"c欣sp.MJ11)來源于低溫環(huán)境天山雪蓮根部土壤，具有低溫
特性。提取其基因組DNA，經(jīng)16SrDNA序列測定，其與i^tto^cter sp. EUinl08具
有最高序列相似性，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特性，確定其屬于P^to&"w屬。利
7用固體LB培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接到低磷培養(yǎng)基(LPM，含有酪蛋白胨lg;大豆蛋白 胨0.45g;葡萄糖4g;谷氨酸鹽0.5g;氯化鈉 5 g; MgC12 1.7mM;MgS04 1.4 mM; KCl，0.47mM; CaC12 0.3 mM;溶于900mL 50 mM pH 7.5 Tris-HCl中，定容至 1000mL，分裝，15磅滅菌15min待用。)，3(TC恒溫旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24-36h。對培養(yǎng) 液分別取上清測酸性植酸酶和中性植酸酶活性，并且對每個(gè)培養(yǎng)物菌體進(jìn)行超聲波 破碎，取破碎液的上清分別進(jìn)行酸性植酸酶和堿性植酸酶活性的測定。結(jié)果在其培 養(yǎng)液上清中檢測到中性植酸酶活性，檢測不到酸性植酸酶活性。
實(shí)施例2 土地桿菌植酸酶編碼基因p/^M/l 的克隆
提取土地桿菌(尸^fotocrwsp. MJ11)基因組DNA:取37'C培養(yǎng)2天后的菌液10000 rpm離心10 min。取IOO mg菌體加500 pL無菌水清洗，離心取沉淀。沉淀重懸于500 提取液混合液，于37。C溫育60 min， 10000 rpm離心10 min去沉淀。上清液用等體積 酚、酚氯仿、氯仿依次抽提。取上層溶液加0.6-l倍體積的異丙醇常溫沉淀10min。 12000 rpm離心15min。沉淀用70%乙醇清洗，稍離心，將沉淀烘干后用30 pL無菌水 溶解，備用。
根據(jù)中性植酸酶的保守序列設(shè)計(jì)合成了簡并引物。以土地桿菌基因組DNA為模 板進(jìn)行兼并性PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94"C變性3 min后冷卻至4'C;然后9fC 變性30sec， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin ， 32個(gè)循環(huán)后72。C保溫10 min。得到植 酸酶保守性片段，將該片段回收后測序。
根據(jù)已知序列，采用TAIL-PCR方法分別設(shè)計(jì)上下游特異性引物，擴(kuò)增得到基因 的全部序列。最后經(jīng)過正確的拼接，最終得到一個(gè)植酸酶基因，p4k#j77。該植酸酶 基因以ATG為起始密碼子，由1122個(gè)堿基組成，編碼373個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼 子。
實(shí)施例3植酸酶的活性分析方法
酶活測定方法為將酶液用含有0.05%BSA和0.05°/。Triton X-100的O.lmol/L的 pH7.0 Tris-HCl并且加入ImM CaCl2的緩沖液稀釋，取50^L稀釋酶液加底物 l,5mmol/L植酸鈉950[iL(用O.lmol/L的pH7.0 Tris-HCl緩沖液配制，并且加入ImM CaCl2)， 37。C反應(yīng)15min，力n lmL10%TCA終止反應(yīng)，加2mL顯色液(10g四水合 鉬酸銨+32mL硫酸+73.2g硫酸亞鐵，加水定容至1L)。對照則加酶液后先加TCA混 勻，再加底物。顯色后700nm下測其OD值，計(jì)算酶活。
一個(gè)酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出lnmol無機(jī)磷所需酶量為一個(gè)酶活性單位。
實(shí)施例4重組植酸酶的制備
根據(jù)己克隆的植酸酶成熟蛋白編碼基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物MJllmF， 5-GACGAATTCAATCAACCAGCTAACACCGCTGCTATCAAGCCAC國3'， MJ1 lmR,
物MJllmF的末端引入酶切位點(diǎn)五coRI，在引物MJllmR的末端引入7Vo/1，以 戶e^6flcto"sp. MJ11基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到成熟蛋白編碼序列。用 I和WW I酶切，連接到載體pET-22b-lic中，獲得含有該植酸酶編碼基因i /^M/77 的重組質(zhì)粒^五7^26-/!'0;^)^<^并轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡. co//BL21(DE3),獲得重組菌株
取含有重組質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株和含有pET-22b ( + )空質(zhì)粒的BL21 (DE3) 菌株(作對照)，分別接種于3 mLLB (加有100 ng/mL的氨芐青霉素和lmM CaCl2) 培養(yǎng)液中，37'C快速振蕩培養(yǎng)過夜;按照1/100體積接種過夜培養(yǎng)液于含有100嗎/mL 氨芐青霉素的20mLLB (lmMCaCl2)培養(yǎng)液中(100mL三角瓶)，快速振蕩培養(yǎng) 約2 h (OD,達(dá)到0.6)，加入1/1000體積1 mol/L的誘導(dǎo)劑IPTG， 3(TC振蕩培養(yǎng)24 h，使其表達(dá)目的蛋白。取培養(yǎng)液，10,000 rpm離心5 min，收集上清和沉淀。上清 液檢測植酸酶活性，用丙酮沉淀濃縮100倍，將此濃縮液取出20 pL加入5x電泳上 樣緩沖液，沸水煮5 min，與同樣處置的含有空質(zhì)粒pET-22b(+)-lic的菌體BL21進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果上清液和菌體破碎液中均檢測到植酸酶活性，上清液中 測的酶活約為0.48U/mL。 SDS-PAGE結(jié)果(圖l， lanel)也表明，基因； /^M///在 大腸桿菌培養(yǎng)液上清中得到了表達(dá)。
實(shí)施例5重組植酸酶的純化
將菌液于4。C、 12,000 rpm離心10 min，獲得上清(粗酶液)；將400 mL粗酶液 濃縮到50 mL左右進(jìn)一步進(jìn)行離子交換層析，將濃縮后的酶液過HiTrap Q XL(5 mL) 陰離子柱。平衡緩沖液為pH7.5， 20 mmol/L的Tris-HCl，洗脫液為含lmol/L NaCl 的pH7.5， 20mmol/LTris陽HCl，上樣量2.0mL， 0-100%洗脫12 CV，流速2 mL/min， 分部收集，每管lmL。然后對收集管中的溶液測酶活及蛋白電泳分析。圖l(lane 2) 顯示純化后的植酸酶蛋白僅有一條單一的條帶，表明得到了電泳純植酸酶。
實(shí)施例6植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
9最適pH的測定為底物植酸鈉用一系列不同pH值的緩沖液(pH2.0-3.5， HCl-Gly 緩沖液；pH4.0-5.8， HAc-NaAc緩沖液；pH6.0-6.5，咪唑-HCl; pH7.0-9.0， Tris-HCl緩
沖液)配制，37'C下在這些不同的緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定酶活性。結(jié)果(圖2) 表明，該酶的最適pH為7.0，在pH6.0 7.5范圍內(nèi)，酶活性維持在90%以上。植酸 酶PhyMJll在一系列不同pH值的緩沖液中37。C下處理lh后，測定其穩(wěn)定性，結(jié)果 表明(圖3)，在pH5.0 9.0之間較穩(wěn)定，剩余酶活性均在70%以上，這說明此酶在堿 性條件下具有較好的pH穩(wěn)定性。
酶促反應(yīng)在pH7.0、不同溫度下保溫所測定的植酸酶PHYMJ11的最適溫度(圖 4)表明，它的最適溫度為45"C。酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在5(TC及10mMC^+濃度下將酶 液處理不同的時(shí)間，結(jié)果表明，保溫20 min對于酶活性影響不大；添加終濃度為5mM 和lmM的Ca^時(shí)，酶活分別還剩下原來的57%和12% (圖5)。
實(shí)施例7植酸酶水解豆粕中植酸磷能力
在20。C，不同的pH (2.5、 4.4、 6.5、 7.5)的條件下，測定A "扭r、 漢和PhyMJll植酸酶水解豆粕植酸磷的能力。在1 g豆粕中加入9 mL不同 pH的緩沖液，包括pH2.5的0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH4.5的0.1 mol/L醋酸 鈉-醋酸緩沖液，pH6.5的0.1 mol/LTris-醋酸緩沖液，pH7.5的0.1 mol/LTris-鹽酸緩 沖液。將此混合液在37t:的水浴搖床中搖30 min，然后加入1 mL用相應(yīng)緩沖液稀 釋的酶液(加入的酶量按照2000U/kg豆粕)，在20。C的水浴搖床中反應(yīng)30min，后 加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液中所釋放的無機(jī)磷的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表 明，在pH2.5、 4.5時(shí)，￡. co/!'、 A m'ger酸性植酸酶水解豆粕的能力高于及s由跑 和PhyMJll中性植酸酶，在偏中性的條件下，及仰to'fc和PhyMJll植酸酶水解豆粕 的能力明顯的高于五.co//、丄"扭r植酸酶。尤其是PhyMJll在2(TC、偏中性的條件 下，水解豆粕植酸磷的能力更高(圖6)。序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
<120> —種中性植酸酶PHYMJll及其基因和應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211>373
<212>PRT
<213>土地桿菌(Pedobacter sp. MJ11) <400> 1
MPLFGTTGQQ HVNLYLMNKP NPILCLATSL LLFTTACRQN QPANTAAIKP LYVSEPV, 60
SDDPAIWVNP ADSSKSLIIG TDKDENGGLY VFDLQGKIIK EKTVKGLKRP 麗VDVAYGLK 120
LGGKQVDIAV ATERMTHKLR VFSLPDMQPI DNGGLPMFEG ETGELYRDLM GIAMYTDPQG 180
QIYAIVGRKS GPKEGGYLWQ YLLEDNGKGQ LKATLKRKFG KYSGKKEIES IAVDNELGYI 240
YYSDEQFGVR KYYADPAKGN QELALFATTG FKEDNEGISI YKTTDSTGYI LVSDQAANHF 300
QVFNREGTKQ DPNKHVLITS LPTSTNNSDG SDIYSKAL麗DFKHGLFVAM SDNKTFGLYR 360
WEDLAGKKLK INK 373
<210〉2
<211>1122
<212>DNA
<213>土地桿菌(Pedobacter sp. MJ11)
<400>2atgccgttgt tcgggacaac cggacaacag catgtaaacc tatatttaat gaataaacct 60 aatccaattc tctgtcttgc aacatcctta ttattattta cgacagcttg ccgccaaaat 120 caaccagcta acaccgctgc tatcaagcca ctttatgtat ctgaacctgt acaattcgat 180 tctgatgacc ctgcgatatg ggtaaatcct gccgatagtt ccaaatcatt aatcattgga 240 accgacaaag atgaaaatgg cggactgtat gtttttgatt tgcagggaaa aatcattaaa 300 gaaaaaaccg taaaaggact aaagcgacct aataacgttg atgtggccta tggcttaaag 360 cttggtggga agcaagtaga tattgctgta gctacagagc gaatgacgca taaactcaga 420 gtattctctt tacctgatat gcaaccgatc gacaatggtg gactgccgat gtttgaaggt 480 gaaaccggcg aactatacag agacctgatg ggcattgcga tgtacacaga tccccaaggg 540 caaatctatg ctattgtagg ccgcaaatct ggcccgaagg aagggggata tttgtggcaa 600 tacttactgg aagacaatgg caaaggccag ttgaaagcca ccttaaaaag gaagtttggt 660 aaatatagcg gcaaaaaaga gatcgaatct atagcggttg acaacgagct aggctatatc 720
tactattctg acgagcaatt tggcgttaga aagtactacg ctgatccagc aaaaggaaac 780 caggaactgg ctttatttgc tacaactgga tttaaagagg ataacgaagg gatcagtatt 840
tataaaacta ccgatagcac tgggtatata ttggtttctg atcaggcagc aaatcacttt 900 caggtattta atcgagaggg cactaaacaa gatcccaaca agcatgtgtt gatcactagc 960
ctccctacct ccaccaacaa tagcgatggt tctgatatct attcaaaagc acttaacaat 1020
gactttaagc atgggctctt tgttgcgatg agtgataaca aaacgttcca actttatcgc 1080
tgggaagacc tggcggggaa gaaattgaag attaataaat aa 1122
1權(quán)利要求
1、一種土地桿菌Pedobacter sp.MJ11，其保藏號(hào)為CGMCC No.2503。
2、 一種中性植酸酶PHYMJll，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
3、 一種中性植酸酶基因p/7;;M力h其特征在于，編碼權(quán)利要求2所述的中性植 酸酶PHYMJll。
4、 如權(quán)利要求3所述的中性植酸酶基因p iWy/7，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID N0.2所示。
5、 包含權(quán)利要求3或4所述中性植酸酶基因;^少7W77/的重組載體。
6、 包含權(quán)利要求3或4所述中性植酸酶基因p&A^W的重組載體
7、 包含權(quán)利要求3或4所述中性植酸酶基因的重組菌株。
8、 如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽 孢桿菌或乳酸桿菌。
9、 一種制備中性植酸酶PHYMJll的方法，其特征在于，包括以下歩驟1) 用權(quán)利要求5的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組植酸酶表達(dá)；以及3) 回收并純化所表達(dá)的植酸酶PHYMJll 。
10、 權(quán)利要求2所述中性植酸酶PHYMJll的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種土地桿菌Pedobacter sp.MJ11，其保藏號(hào)為CGMCC No.2503，以及從其中得到的中性植酸酶PHYMJ11及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種中性植酸酶PHYMJ11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述中性植酸酶的基因phyMJ11。本發(fā)明獲得一種中性植酸酶，其最適pH值為7.0，同時(shí)在pH5～9的范圍內(nèi)均具有高的酶活性。其在中性條件下水解豆粕中植酸磷的能力優(yōu)于目前應(yīng)用的植酸酶，這些性質(zhì)使其能應(yīng)用于淡水魚類飼料中。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101457210SQ20081011334
公開日2009年6月17日 申請日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 羅會(huì)穎, 詹志春, 娜 邵, 黃火清 申請人:武漢新華揚(yáng)生物有限責(zé)任公司