專利名稱：抗衰老番茄育種方法
所屬領域本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域或植物基因工程領域，尤其是一種抗衰老番茄育種方法。
背景技術：
目前使用的番茄育種技術是常規(guī)的雜交育種。該方法的缺點是1、在傳統(tǒng)育種技術中，農(nóng)作物的新品種主要通過有性雜交、品種選育，以及自然界產(chǎn)生的突變再通過選育獲得。這個過程只能在同種內(nèi)進行，就是說水稻只能在水稻中進行，小麥只能在小麥中進行，不能跨越這個界限。與轉基因育種技術有所不同的是，非同種的基因不能相互轉化。轉基因育種技術是通過一定的生物的或者物理的方法，把外源基因?qū)氲绞荏w作物中去，以獲得新品種。所以從某種角度來講，它不受物種的限制，可以跨越物種，轉移遺傳物質(zhì)。不但可以跨越不同的種類，甚至屬、綱、門、界等這樣大的生物之間的門檻全部能跨越。就是說可以把動物的相關基因轉移到植物中去，也可以把微生物的基因轉移到農(nóng)作物中去。所以它的有效性和它的技術的廣泛性是常規(guī)育種無法比擬的。
2、傳統(tǒng)育種過程目的性不是很強，經(jīng)驗和運氣成分比較大。通過選擇，有時候自然界也會產(chǎn)生自發(fā)突變，然后通過人工選擇，有可能獲得一個植物的新品種。而轉基因技術目的性非常強，你可以有預見性地轉移一個基因。之后，這個轉基因植物能夠獲得什么性狀都完全是可預見的。
3、常規(guī)育種周期相對較長，花費相對要高一些。
4、精確性差。
5、雜交育種對親本的選擇要求高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種抗衰老番茄育種方法。該方法采用番茄衰老基因沉默育種技術即反義構建乙烯基因技術，通過調(diào)控乙烯信號轉導中基因產(chǎn)物的表達，實現(xiàn)番茄的抗衰老和耐儲藏。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的該番茄抗衰老基因育種方法，其育種方法為
(一)該基因克隆的步驟為(1)番茄的乙烯基因的RNA的提取；(2)通過該RNA的反轉錄基因cDNA的合成；(3)對合成的cDNA的PCR擴增；(4)乙烯基因-PCR擴增基因的分離和純化；(5)乙烯基因-PCR擴增基因的克??；(6)基因轉化大腸桿菌；(7)克隆基因的篩選；(8)克隆基因的酶切鑒定；(9)基因序列的分析技術；(二)該基因構建的步驟為(1)帶特異性粘性末端的乙烯基因的大量富積A乙烯基因/TEM-T克隆的大量培養(yǎng)；B大量提取乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒；C用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒；D電泳分離該酶切產(chǎn)物；E從膠上純化帶特異性粘端的乙烯基因；F濃縮該基因；(2)帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒PCB302-3的大量富積A大量培養(yǎng)帶有PCB302-3質(zhì)粒的菌株；B大量提取PCB302-3質(zhì)粒；C用SstI和BamHI酶切PCB302-3質(zhì)粒；D電泳分離帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒PCB302-3；E純化；F濃縮；(3)構建A反向連接帶有特異性粘性末端的反義乙烯基因和PCB304-3質(zhì)粒；B轉化感受態(tài)細胞EcolI.大腸桿菌；C在抗性培養(yǎng)基上篩選；D對抗性單克隆進行分別培養(yǎng)；E分別提取質(zhì)粒和酶切鑒定；F測序；
G轉化農(nóng)桿菌和在抗性培養(yǎng)基上篩選；(三)反義乙烯基因轉化番茄(四)轉反義乙烯基因番茄植株的篩選其特征在于在對合成的cDNA的PCR擴增步驟時，根據(jù)番茄的抗衰老基因的基因序列以及PRIMER3軟件設計引物，該引物包括全長的基因片段兩端帶有酶切位點和根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的一對引物，這一對引物建立如下PCR反應H2O加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer 2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag0.1-0.3微升Mg+1-5微升引物 10.2-0.5微升引物 20.2-0.5微升上述反應的反應條件1X95度 3分鐘28-40X95度 20-30秒45-70度 2-3分鐘72-76度 1-2分鐘1X72度 10分鐘1X4度 ∞。
而且，在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時，采用的步驟是a.卡那霉素的篩選；b.轉基因再生植株的Southern-DNA檢測雜交檢測；c.Nouthern-RNA檢測；d.轉基因F1代和F2代果實發(fā)育和成熟性狀觀察；e.轉基因F1代和F2代植株生長性狀表型觀察；f.轉基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的觀測；g.轉基因F1代和F2代果實抗衰老和耐貯藏生理特性的觀測；
h.轉基因F1代和F2代植株解剖特性觀察。
而且，所述的在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時的轉基因再生植株的Southern-DNA雜交檢測是以35S啟動子的DNA片斷為模板，用隨機引物標記法進行標記；提取1-4共四株再生番茄植株及對照植株(未轉化番茄植株基因組DNA)葉的基因組總DNA，在點樣儀中點樣，然后與含α-32P放射性標記的35S啟動子的DNA進行雜交。
而且，所述的在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時發(fā)Nouthern-RNA檢測是以CK1為陽性對照，CK2為陰性對照，提取番茄轉基因植株及對照植株葉的基因組總RNA，用紫外分光光度計定量，取10μg點在樣儀上點樣，然后與含α-32P放射性標記的NR基因片段進行雜交。
而且，所述的CK1為陽性對照是指NR基因DNA，CK2為陰性對照是指未轉化番茄植株基因組RNA。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是(1)是使衰老基因沉默，減少和抑制衰老基因的表達，是一種相對簡單的、快速和高效率的育種方法，(2)結合高效、可靠的抗衰老基因篩選技術可加速番茄抗衰老、耐貯藏育種，獲得抗衰老、耐貯藏新品種。
(3)是先進的基因工程育種技術。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明實施例做進一步詳述本發(fā)明所述的抗衰老基因—反義乙烯基因或乙烯基因沉默技術，包括反義NR、反義ACS、反義ACC等基因，其育種方法包括以下幾大步驟一、抗衰老乙烯基因的克隆1.RNA的提取(1)將番茄的植株根系取樣、清洗并在液氮下磨成粉末形成基因樣品；(2)將該基因樣品放入預熱的BUFFER中，采用苯酚氯仿提取2次，取上清液，加LiCl，孵化過夜；(3)用乙醇清洗沉淀三次，然后真空干燥；(4)溶解該沉淀于去離子水中，加NaAce和乙醇沉淀過夜；(5)離心去上清液，溶解該沉淀于去離子水中，形成RNA溶液。
這種RNA的提取方式可以保證所提取的RNA的高質(zhì)量的和高濃度，是合成高質(zhì)量的cDNA的前提。
2.cDNA的合成(1)將RNA溶液和引物OLIGODT放入離心管中，在70℃下反應5分鐘，然后冰點冷卻；(2)加DNTP、RT酶、BUFFER和水，在42℃下反應60分鐘，冰點冷卻；(3)在85℃反應5分鐘，合成高質(zhì)量和高濃度的cDNA。
3.進行PCR擴增根據(jù)已知物種的基因保守序列和PRIMER3軟件設計引物，包括基因片段兩端的酶切位點和根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的一對引物。建立下列反應H2O 加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag 0.1-0.3微升Mg+ 1-5微升引物 10.2-0.5微升引物 20.2-0.5微升。
上述反應的反應條件1X95度 3分鐘28-40X95度 20-30秒45-70度 2-3分鐘72-76度 1-2分鐘1X72度 10分鐘1X4度 ∞。
說明根據(jù)反應產(chǎn)物片段的長短改進反應條件。其中最主要的是模板濃度，即要求CDNA的濃度和質(zhì)量要高。然后調(diào)整鎂離子濃度和退火溫度和時間。通常退火溫度較引物設計的TM值高5度。產(chǎn)物較短時主要延長退火時間和增加鎂離子濃度。無產(chǎn)物時，主要增加模板濃度。高背景產(chǎn)物較多，而無特異性帶時，主要提高退火溫度和時間，降低模板濃度。
4.乙烯基因-PCR擴增基因的分離和純化用0.7％瓊脂糖進行凝膠電泳，以分離擴增出的特異性PCR產(chǎn)物(反義乙烯基因-PCR擴增基因)。用解剖刀切下基因的特異性片段，用純化柱回收和純化特異性條帶。
5.乙烯基因-PCR擴增基因的克隆采用PGEM-T試劑盒進行克隆。
將下列試劑加入離心管中試劑名稱標準反應陽性對照背景對照2XBUFFER5微升 5微升 5微升載體1微升 1微升 1微升PCR產(chǎn)物 1-3微升 / /對照DNA / 2微升 /T4連接酶1微升 1微升 1微升H2O加至10微升 加至10微升 加至10微升將上述試劑充分混合，反應過夜，得乙烯基因。
6.基因轉化大腸桿菌用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞分別加感受態(tài)細胞于乙烯基因/PGEM-T質(zhì)粒和水及PBLUE質(zhì)粒中，冰點反應42度熱擊45秒，冰點冷卻；轉入SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37度下培養(yǎng)1小時；放培養(yǎng)物于抗性平板中培養(yǎng)和篩選，37度過夜培養(yǎng)。
7.克隆基因的篩選挑取白色單克隆，分別進行抗性平板的培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
8.克隆基因的酶切鑒定電泳分析質(zhì)粒的大小選擇大的質(zhì)粒進行酶切鑒定，選擇特異性酶酶切該質(zhì)粒，跑電泳，檢查帶的長度。對符合條件的基因進行下一步驟。
9.基因序列的確認。
通過酶切分析篩選出4個克隆基因進行測序分析。并將該基因序列與基因銀行的已知物種一番茄抗衰老基因的序列進行比較，分析其保守區(qū)，對選擇保守區(qū)一致的一個克隆基因用于構建。
以上是對番茄抗衰老基因進行了克隆，并選擇出了進行下一步構建的一個基因克隆。
二、進行所克隆的乙烯基因的反向構建。
構建包括如下步驟
1.帶特異性粘性末端的乙烯基因的大量富積(1)將乙烯基因/TEM-T克隆基因在培養(yǎng)液內(nèi)大量繁殖。
(2)大量提取法提取乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒。
(3)用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒，反應體積需要擴大到100微升，切1-5微升的質(zhì)粒。
反應用雙酶切方式如下10X BUFFER 10微升SstI酶 1微升BamHI酶 1微升乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒 5微升10X BSA 10微升H2O 加至100微升該反應于37℃下培養(yǎng)過夜，得到PCB302質(zhì)粒。
說明帶有不同酶切位點的粘端克隆是效率最高的克隆，PCB302質(zhì)粒的由于設計了2對保護堿基，才保證了粘端連接和克隆、構建的正常進行。
(4).乙烯基因的分離和純化。
采用0.7％瓊脂糖進行凝膠電泳，分離出帶有粘性末端的乙烯基因產(chǎn)物。用解剖刀切下該特異性片段的基因，用純化柱回收和純化該特異性條帶基因。
(5)乙烯基因的濃縮。
將所分離和純化的乙烯基因用NaAC和乙醇沉淀過夜，離心、去上清液，真空干燥沉淀、加水備用，得到高濃度的粘端乙烯基因。
2.帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒PCB302-3的大量富積(1)大量培養(yǎng)PCB302-3質(zhì)粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(2)大量提取PCB302-3質(zhì)粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(3)用SstI和BamHI酶切PCB302-3質(zhì)粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(4)電泳分離和純化帶有特異性粘性末端的PCB302-3質(zhì)粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(5)濃縮，方法同乙烯基因/TEM-T。
3.反義乙烯基因/PCB302-3質(zhì)粒的構建。
(1)用帶有粘性末段的DNA產(chǎn)物克隆方法反向連接帶有特異性粘性末端的乙烯基因和PCB304-3質(zhì)粒。
(2)轉化感受態(tài)細胞EcolI.大腸桿菌，方法同上。
(3)在含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)和篩選。
(4)對抗性單克隆在含有30-100微升卡那霉素/毫升液體培養(yǎng)上進行分別的培養(yǎng)。
(5)分別提取質(zhì)粒和酶切鑒定。用少量提取法提取質(zhì)粒，用特異性酶進行酶切鑒定。
(6)測序。對酶切正確的克隆質(zhì)粒進行測序鑒定。
(7)轉化農(nóng)桿菌和在抗性培養(yǎng)基上篩選。制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，用電轉化法將鑒定正確的克隆質(zhì)粒轉化入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。
(8)在抗性培養(yǎng)基上篩選，得到構建好的反義乙烯基因/PCB302質(zhì)粒。
三、反義乙烯基因轉化番茄。
該反義乙烯基因的轉化方式是普通的基因轉化技術，在此不再贅述；四、轉反義乙烯基因番茄植株的篩選1.卡那霉素的篩選2.轉基因再生植株的Southern-DNA檢測雜交檢測以35S啟動子的DNA片斷為模板，用隨機引物標記法進行標記。提取1-4共四株再生番茄植株及對照植株(未轉化番茄植株基因組DNA)葉的基因組總DNA，在點樣儀中點樣，然后與含α-32P放射性標記的35S啟動子的DNA進行雜交。
3.Nouthern-RNA檢測CK1為陽性對照(NR基因DNA)，CK2為陰性對照(未轉化番茄植株基因組RNA)，提取番茄轉基因植株及對照植株葉的基因組總RNA，用紫外分光光度計定量，取10μg點在樣儀上點樣，然后與含α-32P放射性標記的NR基因片段進行雜交。
4.轉基因F1代和F2代果實發(fā)育和成熟性狀觀察將通過Kan的抗性培養(yǎng)基上篩選的芽及根的篩選的番茄再生植株進行幼苗鍛煉后，定植于花盆中，進行園藝及轉基因性狀表型觀察。包括開花期、結果期(座果期、果實綠熟期、粉紅期、全紅期、過熟期)。
5.轉基因F1代和F2代植株生長性狀表型觀察植株生長量、株高、莖粗、分枝數(shù)、莖節(jié)數(shù)、節(jié)間長。乙烯脅迫下的幼苗葉片黃化指數(shù)、6.轉基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的觀測觀測電解質(zhì)外滲率％(番茄葉片細胞膜透性)、蒸騰作用mM/m2s、氣孔導度mM/m2s、呼吸作用μM/m2/s、細胞間二氧化碳濃度mg/L。
7.轉基因F1代和F2代果實抗衰老和耐貯藏生理特性的觀測觀測果實乙烯的含量變化、果實硬度變化、果柄拉力變化、果實電解質(zhì)外滲率％、果實耐貯藏特性(不同時期的、不同條件下的腐爛率)、果實品質(zhì)變化(總糖含量變化、維生素C含量變化、果實總酸含量變化)。
8.轉基因F1代和F2代植株解剖特性觀察觀測花粉粒形態(tài)、萌芽率、花器官的發(fā)育等。
通過以上步驟，即可以培育出抗衰老、耐貯藏的番茄新品種。
權利要求
1.一種抗衰老番茄育種方法，其育種方法為(一)該基因克隆的步驟為(1)番茄的乙烯基因的RNA的提??；(2)通過該RNA的反轉錄基因cDNA的合成；(3)對合成的cDNA的PCR擴增；(4)乙烯基因-PCR擴增基因的分離和純化；(5)乙烯基因-PCR擴增基因的克??；(6)基因轉化大腸桿菌；(7)克隆基因的篩選；(8)克隆基因的酶切鑒定；(9)基因序列的分析技術；(二)該基因反向構建的步驟為(1)帶特異性粘性末端的乙烯基因的大量富積A乙烯基因/TEM-T克隆的大量培養(yǎng)；B大量提取乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒；C用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T質(zhì)粒；D電泳分離該酶切產(chǎn)物；E從膠上純化帶特異性粘端的乙烯基因；F濃縮該基因；(2)帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒PCB302-3的大量富積A大量培養(yǎng)帶有PCB302-3質(zhì)粒的菌株；B大量提取PCB302-3質(zhì)粒；C用SstI和BamHI酶切PCB302-3質(zhì)粒；D電泳分離帶有特異性粘性末端的質(zhì)粒PCB302-3；E純化；F濃縮；(3)構建A反向連接帶有特異性粘性末端的乙烯基因和PCB304-3質(zhì)粒；B轉化感受態(tài)細胞EcolI.大腸桿菌；C在抗性培養(yǎng)基上篩選；D對抗性單克隆進行分別培養(yǎng)；E分別提取質(zhì)粒和酶切鑒定；F測序；G轉化農(nóng)桿菌和在抗性培養(yǎng)基上篩選；(三)反義乙烯基因轉化番茄(四)轉反義乙烯基因番茄植株的篩選其特征在于在對合成的cDNA的PCR擴增步驟時，根據(jù)番茄的抗衰老基因的基因序列以及PRIMER3軟件設計引物，該引物包括全長的基因片段兩端帶有酶切位點和根據(jù)基因內(nèi)部保守序列設計的一對引物，這一對引物建立如下PCR反應H2O加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer 2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag0.1-0.3微升Mg+1-5微升引物1 0.2-0.5微升引物2 0.2-0.5微升上述反應的反應條件1X95度3分鐘28-40X95度20-30秒45-70度 2-3分鐘72-76度 1-2分鐘1X72度10分鐘1X4度 ∞。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗衰老番茄育種方法，其特征在于在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時，采用的步驟是a.卡那霉素的篩選；b.轉基因再生植株的Southern-DNA檢測雜交檢測；c.Nouthern-RNA檢測；d.轉基因F1代和F2代果實發(fā)育和成熟性狀觀察；e.轉基因F1代和F2代植株生長性狀表型觀察；f.轉基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的觀測；g.轉基因F1代和F2代果實抗衰老和耐貯藏生理特性的觀測；h.轉基因F1代和F2代植株解剖特性觀察。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗衰老番茄育種方法，其特征在于所述的在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時的轉基因再生植株的Southern-DNA雜交檢測是以35S啟動子的DNA片斷為模板，用隨機引物標記法進行標記；提取1-4共四株再生番茄植株及對照植株(未轉化番茄植株基因組DNA)葉的基因組總DNA，在點樣儀中點樣，然后與含α-32P放射性標記的35S啟動子的DNA進行雜交。
4.根據(jù)權利要求3所述的抗衰老番茄育種方法，其特征在于所述的在對轉反義乙烯基因番茄植株篩選時Nouthern-RNA檢測是以CK1為陽性對照，CK2為陰性對照，提取番茄轉基因植株及對照植株葉的基因組總RNA，用紫外分光光度計定量，取10μg點在樣儀上點樣，然后與含α-32P放射性標記的NR基因片段進行雜交。
5.根據(jù)權利要求3所述的抗衰老番茄育種方法，其特征在于所述的CK1為陽性對照是指NR基因DNA，CK2為陰性對照是指未轉化番茄植株基因組RNA。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域或植物基因工程領域的一種抗衰老番茄育種方法。該方法采用番茄衰老基因沉默育種技術即反義構建乙烯基因技術，通過調(diào)控乙烯信號轉導中基因產(chǎn)物的表達，使衰老基因沉默，減少和抑制衰老基因的表達，結合高效、可靠的抗衰老基因篩選技術可加速番茄抗衰老、耐貯藏育種，從而獲得抗衰老、耐貯藏新品種，是一種先進的基因工程育種技術。
文檔編號A01H1/00GK1871895SQ20051001357
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權日2005年6月1日
發(fā)明者楊靜慧, 劉艷軍, 羅云波, 張偉玉, 楊恩芹, 劉玉冬, 柳樹梧, 李建科 申請人:天津農(nóng)學院