專利名稱：小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種農業(yè)育種技術領域的方法，具體是一種小果型番茄花藥的愈
傷組織誘導方法。
背景技術：
小果型番茄屬茄科(Solanaceae)番茄屬(lycopersicon)番茄半栽培亞種，其營 養(yǎng)豐富，風味獨特。近年來，隨著產業(yè)結構的調整和消費需求的增加，其種植面積迅猛發(fā)展， 在市場供應中占有越來越重要的地位?；ㄋ幣囵B(yǎng)是番茄單倍體育種中十分有效的方法，結 合染色體加倍可以省去多代自交，快速建立和育純番茄品系、克服雜種后代性狀分離，加快 番茄育種的進程。 經過對現有技術的檢索發(fā)現，朱麗萍等對番茄花藥培養(yǎng)的取材時期做了一定的研 究工作，論文發(fā)表在《上海交通大學學報(農業(yè)科學版)》2005年第23巻第3期的239頁 至243頁，題目為《番茄不同花藥長短及花粉發(fā)育時期其愈傷組織誘導率的相關性》。結果 發(fā)現，不同果型番茄品種，花粉發(fā)育與花藥長度呈正相關。當番茄花粉發(fā)育處于單核靠邊期 時進行花藥培養(yǎng)，誘導愈傷組織的頻率最高，是最適時期。但是該現有技術并未對番茄花藥 培養(yǎng)最適取材時期的外部形態(tài)做深入的研究。本發(fā)明針對現有技術的不足，對小果型番茄 花藥培養(yǎng)最適取材時期的花蕾長度及其外部形態(tài)進行了研究，為小果型番茄花藥培養(yǎng)的研 究提供了科學的理論依據。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現有技術存在的上述不足，提供一種小果型番茄花藥的愈傷組織誘導
方法，在番茄花藥培養(yǎng)過程中，誘導產生愈傷組織的關鍵是確定花粉的發(fā)育時期。通過研究
小果型番茄花藥培養(yǎng)過程中花蕾長度對愈傷誘導率的影響，并且與花粉的發(fā)育時期進行比
較，確定了小果型番茄花藥培養(yǎng)取材的最適時期。 本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明包括以下步驟 第一步、在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液 中固定保存。 所述的長度分類是指將長度為3 12mm的花蕾，以lmm為間隔進行分類； 所述的小果型番茄是指黃鑾、瑞珍小型番茄、高農交配、維多利1S9、鮮豐X奇斯
曼尼等巳雜種； 所述的標準固定液的組分及其體積比為5%福爾馬林、5%冰醋酸和90%乙醇溶 液； 所述的福爾馬林是指38%體積比濃度的甲醛溶液；
所述的乙醇溶液是指70%體積比濃度的乙醇水溶液； 第二步、將固定保存的小果型番茄中的花粉發(fā)育時期處于單核靠邊期的花蕾取 出，進行消毒殺菌處理。
所述的處于單核靠邊期的花蕾是指花蕾長度為8 9mm，花蕾明顯長大，花冠高于 萼片，呈黃綠色，花萼基本開裂。 所述的消毒殺菌處理是指將花蕾置于fC條件下保存2天，然后用飽和漂白粉上 清液消毒花蕾18分鐘后，再用無菌水沖洗3 5次。 第三步、在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接 種后的花藥進行暗培養(yǎng)處理，獲得小果型番茄花藥的愈傷組織。 所述的暗培養(yǎng)處理是指在25t:環(huán)境下對花藥進行暗培養(yǎng)三周，然后補充光照 12h，光強2000Lux，誘導愈傷組織。 所述的誘導愈傷組織培養(yǎng)基的組分及其含量為基本培養(yǎng)基MS(Murashige &
Skoog)、激動素(KT) 1. Omg/L、萘乙酸(NAA)O. 5mg/L、蔗糖40g/L、瓊脂7g/L。 現有的技術是通過番茄花藥的長度確定番茄花藥培養(yǎng)的最適取材時期，而且取材
時比較繁瑣，要用鑷子將花蕾撥開后才能觀察。本發(fā)明通過觀察研究小果型番茄花粉發(fā)育
時期與花蕾長度及其外部形態(tài)、愈傷誘導率的相關性，揭示了小果型番茄花藥培養(yǎng)最適取
材時期的花蕾長度及其外部形態(tài)。在實際應用中我們就可以直接依據花蕾的長度及其外部
形態(tài)判斷花粉發(fā)育時期，直接取材。這樣不僅省時、省力，而且提高了取材的準確度，從而提
高了番茄花藥培養(yǎng)的愈傷誘導率。


圖1為本發(fā)明小果型番茄花粉各發(fā)育時期的細胞學特征。
圖2為本發(fā)明實施例3種不同番茄品種花蕾長度對愈傷誘導率的影響。
圖3為本發(fā)明實施例3種不同番茄品種花蕾長度對愈傷誘導率的影響。
圖4為本發(fā)明實施例3種不同番茄品種花蕾長度對愈傷誘導率的影響。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1 本實施例選用三種小果型番茄品種黃鑾、瑞珍小型番茄、高農交配。 第一步、在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液
中固定保存。 第二步、觀察小果型番茄不同花蕾長度(3 12mm，以lmm為間隔)的外部形態(tài)，研 究花粉各發(fā)育時期(小孢子母細胞時期、四分體時期、單核早期、單核中期、單核靠邊期、二 核期、成熟花粉粒期)的細胞學特征。 通過研究小果型番茄花粉各發(fā)育時期的細胞學特征，發(fā)現在小果型番茄中，花蕾 長度與花粉發(fā)育時期成正相關，并且隨著花蕾長度的增大花蕾的外部形態(tài)也發(fā)生顯著的變 化。當花蕾長為3 4mm時，花粉處于小孢子母細胞時期，此時花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈閉合狀態(tài)，萼片上著生濃密的絨毛；當花蕾長為4 5mm時，花粉處于四分體時期，此時 花蕾稍大一點；當花蕾長為5 7mm時，花粉處于單核早期，此時花蕾開始明顯長大，花冠被萼片包被稍低于萼片，萼片上著生的絨毛開始變稀疏；當花蕾長為7 8rnrn時，花粉處于單核 中期，此時花蕾明顯長大，花冠微露于萼片外，萼片頂端開始分離；當花蕾長為8 9mm時，花 粉處于單核靠邊期，此時花冠略高于萼片且開始露于萼片外，露出的花冠呈黃綠色，萼片基 本分離；當花蕾長為9 12mm時，花粉處于二核期，此時花蕾充分膨大，當花冠伸長到一定程 度，隨著萼片進一步開展，花冠也逐漸向外展開，花瓣也隨之長大，顏色逐漸變黃；當花蕾長 度大于12mm時，為成熟花粉粒時期，此時花冠、萼片完全分離并向外反巻，花藥、柱頭外露， 花冠呈深黃色。 由此可見，小果型番茄花粉發(fā)育時期與花蕾長度、外部形態(tài)的變化密切相關，可以 根據其之間的關系確定花粉的發(fā)育時期。 第三步、將固定保存后的花蕾置于fC條件下保存2天，然后用飽和漂白粉上清液 消毒花蕾18分鐘后，再用無菌水沖洗3 5次。 第四步、在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接 種后的花藥置于25t:環(huán)境下暗培養(yǎng)三周，然后補充光照12h，光強2000Lux，誘導愈傷組織。 四周后統計出愈率(出愈率=產生愈傷組織的花藥數/接種花藥數X100% )。
此實施例中三個品種不同長度的花蕾均可通過花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織。出愈率隨 番茄品種不同，花蕾長度不同而有所差異。黃鑾和瑞珍小型番茄的出愈率明顯高于高農交 配。三種番茄當花蕾長為8 9mm時均獲得最高的出愈率。根據前面的石蠟切片結果，知道 當花蕾長為8 9mm時，花粉處于單核靠邊期。因此，初步確定當花蕾長為8 9mm，花粉處于單 核靠邊期，是黃鑾、瑞珍小型番茄和高農交配三種番茄花藥培養(yǎng)的最適時期。
實施例2 本實施例選用三種小果型番茄品種維多利189、高農交配、黃鑾。 第一步、在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液
中固定保存。 第二步、觀察小果型番茄不同花蕾長度(3 12mm，以lmm為間隔)的外部形態(tài)，研 究花粉各發(fā)育時期(小孢子母細胞時期、四分體時期、單核早期、單核中期、單核靠邊期、二 核期、成熟花粉粒期)的細胞學特征。 通過研究小果型番茄花粉各發(fā)育時期的細胞學特征，發(fā)現在小果型番茄中，花蕾 長度與花粉發(fā)育時期成正相關，并且隨著花蕾長度的增大花蕾的外部形態(tài)也發(fā)生顯著的變 化。當花蕾長為3 4mm時，花粉處于小孢子母細胞時期，此時花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈閉合狀態(tài)，萼片上著生濃密的絨毛；當花蕾長為4 5mm時，花粉處于四分體時期，此時 花蕾稍大一點；當花蕾長為5 7mm時，花粉處于單核早期，此時花蕾開始明顯長大，花冠被 萼片包被稍低于萼片，萼片上著生的絨毛開始變稀疏；當花蕾長為7 8mm時，花粉處于單核 中期，此時花蕾明顯長大，花冠微露于萼片外，萼片頂端開始分離；當花蕾長為8 9mm時，花 粉處于單核靠邊期，此時花冠略高于萼片且開始露于萼片外，露出的花冠呈黃綠色，萼片基 本分離；當花蕾長為9 12mm時，花粉處于二核期，此時花蕾充分膨大，當花冠伸長到一定程 度，隨著萼片進一步開展，花冠也逐漸向外展開，花瓣也隨之長大，顏色逐漸變黃；當花蕾長 度大于12mm時，為成熟花粉粒時期，此時花冠、萼片完全分離并向外反巻，花藥、柱頭外露， 花冠呈深黃色。 由此可見，小果型番茄花粉發(fā)育時期與花蕾長度、外部形態(tài)的變化密切相關，可以根據其之間的關系確定花粉的發(fā)育時期。 第三步、將固定保存后的花蕾置于fC條件下保存2天，然后用飽和漂白粉上清液 消毒花蕾18分鐘后，再用無菌水沖洗3 5次。 第四步、在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接 種后的花藥置于25t:環(huán)境下暗培養(yǎng)三周，然后補充光照12h，光強2000Lux，誘導愈傷組織。 四周后統計出愈率(出愈率=產生愈傷組織的花藥數/接種花藥數X100% )。
此實施例中三個品種不同長度的花蕾均可通過花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織。出愈率隨 番茄品種不同，花蕾長度不同而有所差異。黃鑾的出愈率明顯高于高農交配和維多利189 兩種番茄。三種番茄當花蕾長為8 9mm時均獲得最高的出愈率。因此，初步確定當花蕾長 為8 9mm，花粉處于單核靠邊期，是黃鑾、高農交配和維多利189三種番茄花藥培養(yǎng)的最適 時期。 實施例3 本實施例選用三種小果型番茄品種維多利189、高農交配、鮮豐X奇斯曼尼。
第一步、在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液 中固定保存。 第二步、觀察小果型番茄不同花蕾長度(3 12mm，以lmm為間隔)的外部形態(tài)，研 究花粉各發(fā)育時期(小孢子母細胞時期、四分體時期、單核早期、單核中期、單核靠邊期、二 核期、成熟花粉粒期)的細胞學特征。 通過研究小果型番茄花粉各發(fā)育時期的細胞學特征，發(fā)現在小果型番茄中，花蕾 長度與花粉發(fā)育時期成正相關，并且隨著花蕾長度的增大花蕾的外部形態(tài)也發(fā)生顯著的變 化。當花蕾長為3 4mm時，花粉處于小孢子母細胞時期，此時花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈閉合狀態(tài)，萼片上著生濃密的絨毛；當花蕾長為4 5mm時，花粉處于四分體時期，此時 花蕾稍大一點；當花蕾長為5 7mm時，花粉處于單核早期，此時花蕾開始明顯長大，花冠被 萼片包被稍低于萼片，萼片上著生的絨毛開始變稀疏；當花蕾長為7 8mm時，花粉處于單核 中期，此時花蕾明顯長大，花冠微露于萼片外，萼片頂端開始分離；當花蕾長為8 9mm時，花 粉處于單核靠邊期，此時花冠略高于萼片且開始露于萼片外，露出的花冠呈黃綠色，萼片基 本分離；當花蕾長為9 12mm時，花粉處于二核期，此時花蕾充分膨大，當花冠伸長到一定程 度，隨著萼片進一步開展，花冠也逐漸向外展開，花瓣也隨之長大，顏色逐漸變黃；當花蕾長 度大于12mm時，為成熟花粉粒時期，此時花冠、萼片完全分離并向外反巻，花藥、柱頭外露， 花冠呈深黃色。 由此可見，小果型番茄花粉發(fā)育時期與花蕾長度、外部形態(tài)的變化密切相關，可以 根據其之間的關系確定花粉的發(fā)育時期。 第三步、將固定保存后的花蕾置于fC條件下保存2天，然后用飽和漂白粉上清液 消毒花蕾18分鐘后，再用無菌水沖洗3 5次。 第四步、在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接 種后的花藥置于25t:環(huán)境下暗培養(yǎng)三周，然后補充光照12h，光強2000Lux，誘導愈傷組織。 四周后統計出愈率(出愈率=產生愈傷組織的花藥數/接種花藥數X100% )。
此實施例中三個品種不同長度的花蕾均可通過花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織。出愈率隨 番茄品種不同，花蕾長度不同而有所差異。鮮豐X奇斯曼尼的出愈率明顯高于高農交配和維多利189兩種番茄。三種番茄當花蕾長為8 9mm時均獲得最高的出愈率。根據前面的石蠟切片結果，知道當花蕾長為8 9mm時，花粉處于單核靠邊期。因此，初步確定當花蕾長為8 9mm，花粉處于單核靠邊期，是鮮豐X奇斯曼尼、高農交配和維多利189三種番茄花藥培養(yǎng)的最適時期。
權利要求
一種小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液中固定保存；第二步、將固定保存的小果型番茄中的花粉發(fā)育時期處于單核靠邊期的花蕾取出，進行消毒殺菌處理；第三步、在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接種后的花藥進行暗培養(yǎng)處理，獲得小果型番茄花藥的愈傷組織。
2. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的長 度分類是指將長度為3 12mm的花蕾，以lmm為間隔進行分類。
3. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的小 果型番茄是指黃鑾、瑞珍小型番茄、高農交配、維多利1S9、鮮豐x奇斯曼尼的Fl雜種。
4. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的標 準固定液的組分及其體積比為5%福爾馬林、5%冰醋酸和90%乙醇溶液，其中福爾馬林是指38%體積比濃度的甲醛溶液；乙醇溶液是指70%體積比濃度的乙醇水溶液。
5. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的處 于單核靠邊期的花蕾是指花蕾長度為8 9mm。
6. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的消 毒殺菌處理是指將花蕾置于4t:條件下保存2天，然后用飽和漂白粉上清液消毒花蕾18 分鐘后，再用無菌水沖洗3 5次。
7. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的暗 培養(yǎng)處理是指在25t:環(huán)境下對花藥進行暗培養(yǎng)三周，然后補充光照12h，光強2000Lux，誘 導愈傷組織。
8. 根據權利要求1所述的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，其特征是，所述的誘 導愈傷組織培養(yǎng)基的組分及其含量為基本培養(yǎng)基MS、激動素1. Omg/L、萘乙酸0. 5mg/L、蔗 糖40g/L和瓊脂7g/L。
全文摘要
一種農業(yè)育種技術領域的小果型番茄花藥的愈傷組織誘導方法，包括在同一時間采摘若干小果型番茄的花蕾，經長度分類后放入標準固定液中固定保存；將固定保存的小果型番茄中的花粉發(fā)育時期處于單核靠邊期的花蕾取出，進行消毒殺菌處理；在無菌條件下將花藥從花蕾中取出并接種在誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，接種后的花藥進行暗培養(yǎng)處理，獲得小果型番茄花藥的愈傷組織。本發(fā)明在番茄花藥培養(yǎng)過程中，誘導產生愈傷組織的關鍵是確定花粉的發(fā)育時期。通過利用小果型番茄花藥培養(yǎng)過程中花蕾長度對愈傷誘導率的影響，并且與花粉的發(fā)育時期進行比較，確定了小果型番茄花藥培養(yǎng)取材的最適時期。
文檔編號A01H4/00GK101773074SQ201010300869
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權日2010年1月28日
發(fā)明者劉楊, 王芹芹, 陳火英, 韓洪強 申請人:上海交通大學