一種仙茅人工種子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種仙茅人工種子的制作方法，包括仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)，仙茅不定芽的誘導(dǎo)，仙茅不定芽的篩選，仙茅不定芽的包埋和人工種子的制備步驟。本發(fā)明制作的人工種子，萌發(fā)率高，成苗率高。相比天然種子，人工種子不受季節(jié)的限制，可應(yīng)用于大規(guī)模的批量生產(chǎn)。
【專利說明】
一種仙茅人工種子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于人工種子制備領(lǐng)域，具體涉及一種仙茅人工種子的制作方法。 技術(shù)背景
[0002] 仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)為仙茅科仙茅屬植物，是一種極其珍貴的 藥用植物。通過文獻(xiàn)查考，認(rèn)為仙茅最早記載于一千多年前的《海藥本草》，古今用藥種類基 本一致。以仙茅的干燥根莖入藥，其功效在中醫(yī)古籍中多為補(bǔ)腎壯陽為主，近年研究發(fā)現(xiàn)其 功效還包括壯筋骨、抗炎癥、抗氧化、耐缺氧、耐高溫等。
[0003] 仙茅自然繁殖率低，加之長期無節(jié)制采挖，其野生資源日益減少;傳統(tǒng)的繁殖方式 如分株、扦插等繁殖率也較低;組織培養(yǎng)技術(shù)能在一定程度上解決快速繁殖的難題，但是依 然存在轉(zhuǎn)接次數(shù)多、生產(chǎn)周期長、成本高、移栽成活率低等問題。人工種子是將離體產(chǎn)生的 體細(xì)胞胚或其它繁殖體包埋在能提供養(yǎng)分的膠囊里，又在膠囊外包上具有保護(hù)功能的外 膜，形成類似于種子的結(jié)構(gòu)。1978年，美國科學(xué)家Murashige在國際園藝植物學(xué)術(shù)會議首次 提出了人工種子的概念。它是在植物離體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展來的一門新興技術(shù)，是細(xì)胞 工程中最年輕的一項技術(shù)。人工種子可以不受季節(jié)、環(huán)境各方面天然條件的限制，來進(jìn)行大 規(guī)模大批量高效制作生產(chǎn)，使得農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的擇時播種成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種萌發(fā)率高、成苗率高的仙茅人工種子的制作方法，通 過本發(fā)明可大規(guī)模批量生產(chǎn)仙茅種子，為解決仙茅資源緊張問題提供技術(shù)支持。
[0005] 本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：一種仙茅人工種子的制作方法，包括仙茅愈傷 組織的誘導(dǎo)、仙茅不定芽的誘導(dǎo)、仙茅不定芽的篩選以及仙茅不定芽的包埋和人工種子的 制備步驟，仙茅不定芽的包埋和人工種子的制備過程中，仙茅不定芽在包埋液中反應(yīng)后再 與質(zhì)量濃度為2 %的CaCl2溶液反應(yīng)，上述反應(yīng)重復(fù)一次；
[0006] 其中，所述的包埋液是以l/2MS+0.8mg/L NAA+0.05mg/L6-BA+3%蔗糖+3mg/L多菌 靈為人工胚乳，在其中加入4 %海藻酸鈉熬制而成。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步包括以下優(yōu)選方案：
[0008] 優(yōu)選的方案中，仙茅不定芽的包埋和人工種子的制備過程為:將不定芽加入滅菌 過的包埋液中，攪拌充分混合，3分鐘后，將含有不定芽的包埋液滴入到質(zhì)量濃度為2%的 CaCl2溶液中，反應(yīng)5分鐘，形成透明有彈性的人工種子，將制作的人工種子再放入人工胚乳 中，攪拌充分混合，3分鐘后，用玻璃棒將含有不定芽的包埋液，撥入到質(zhì)量濃度為2%的 CaCl2溶液中，反應(yīng)10分鐘。
[0009] 優(yōu)選的方案中，含有不定芽的包埋液滴入到質(zhì)量濃度為2%的CaCl2溶液的過程 中，用內(nèi)徑為3mm的吸管吸取包含有不定芽的包埋液。
[0010] 仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，切取長為4-6mm的仙茅幼葉，接種到MS+1.5mg/LKT+ 0.05mg/L2，4-D+3.0 %蔗糖+0.7 %瓊脂+3mg/L多菌靈+8mg/L檸檬酸培養(yǎng)基中進(jìn)行仙茅愈傷 誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0011]優(yōu)選的方案中，仙茅不定芽的誘導(dǎo)過程中，把得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+3.0%蔗 糖+0.7%瓊脂+3mg/L多菌靈分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。
[0012]優(yōu)選的方案中，仙茅不定芽的選擇過程中，選出長度為2-3mm的不定芽。
[0013]優(yōu)選的方案中，仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)溫度25土 TC，光照強(qiáng)度1100-12001x，光照時間 10-12h。
[0014]優(yōu)選的方案中，仙茅不定芽的誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)溫度25±1°C，光照強(qiáng)度1100-12001x，光照時間 12-14h。
[0015] 優(yōu)選的方案中，種子發(fā)芽時：培養(yǎng)溫度26±1°C，光照強(qiáng)度1100-12001x，黑暗處理 3-5天，發(fā)芽后光照時間為12-14h。
[0016]本發(fā)明通過人工的方法制備種子可以代替天然種子，可不受季節(jié)限制，大規(guī)模大 批量高效生產(chǎn)人工種子，可實現(xiàn)擇時播種，為仙茅資源開發(fā)提供技術(shù)保證。
[0017]本發(fā)明的萌發(fā)率高、成苗率高。
[0018] 本發(fā)明的仙茅種子發(fā)芽生根率高、染菌率低、失水率低。
[0019] 本發(fā)明得到的種子顆粒均勻，軟硬適中，呈球形，透明有彈性。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明仙茅幼葉誘導(dǎo)出的愈傷組織的照片。
[0021] 圖2為本發(fā)明仙茅愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽的照片。
[0022] 圖3為本發(fā)明仙茅不定芽包裹一層包埋液制作的人工種子的照片。
[0023] 圖4為本發(fā)明仙茅不定芽包裹兩層包埋液制作的人工種子的照片。
[0024] 圖5為仙茅人工種子發(fā)芽初期的照片。
[0025] 圖6為仙茅人工種子發(fā)芽中期的照片。
[0026] 圖7為仙茅人工種子發(fā)芽后的植株種植在土壤中，置于外界環(huán)境中的照片。
[0027] 圖8為仙茅人工種子植株二個月后在外界環(huán)境中生長狀況的照片。
【具體實施方式】
[0028] 以下實施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例。
[0029] 實施例1
[0030] 第一步、誘導(dǎo)愈傷組織選取廣東省中華仙茅健壯植株的幼葉，將葉子用清水洗凈， 用流動水沖洗兩小時。在超凈工作臺中，用75%的酒精消毒10s，無菌水沖洗3次。然后將葉 片放入0.1%升汞溶液中滅菌lOmin，無菌水沖洗5次，用滅菌的濾紙吸干表面水分。在超凈 工作臺上，用消過毒的手術(shù)刀將葉片切成5mm左右大小，用滅菌的鑷子將葉片接種到愈傷組 織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，1 ? 5mg/LKT，0 ? lmg/L2，4-D，8mg/L檸檬酸，3 ? 0 % 鹿糖，0 ? 7 %瓊脂，3mg/L多菌靈，pH值為5 ? 8。
[0031]第二步、誘導(dǎo)不定芽在組培室中培養(yǎng)50天左右出現(xiàn)愈傷組織，將愈傷組織在無菌 條件下轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，3 %蔗糖，0.7 %瓊脂，3mg/L多菌靈， pH值為5.8)上，培育20天后出現(xiàn)大量不定芽，在無菌條件下選出長度為2-3mm的不定芽。 [0032]第三步、制作人工種子將不定芽放在滅菌過的包埋液中，包埋液是以1/2MS+ 0 ? 8mg/L NAA+O ? 05mg/L 6-BA+3mg/L多菌靈為人工胚乳，加入3%的海藻酸鈉熬制而成。攪 拌充分混合;3分鐘后，用內(nèi)徑為3_的吸管吸取包含有不定芽的包埋液，滴入到質(zhì)量濃度為 2%的CaCl2溶液中，反應(yīng)5分鐘，形成透明有彈性的人工種子，取出所述人工種子并在無菌 水中清洗兩遍。
[0033]第四步、二次包膜取出一半的人工種子，再放入人工胚乳中，攪拌充分混合，進(jìn)行 二次包裹。3分鐘后，用玻璃棒將含有不定芽的包埋液，撥入到質(zhì)量濃度為2%的CaCl2溶液 中，反應(yīng)10分鐘，形成透明有彈性的人工種子，取出所述人工種子并在無菌水中清洗兩遍， 用濾紙吸干所述人工種子上的液體。
[0034]第五步、測定失水率和發(fā)芽率將人工種子放在培養(yǎng)皿上，15天后測量失水率、發(fā)芽 率。包裹一層膜的人工種子失水率為53.03%，發(fā)芽率為79%。包裹兩層膜的人工種子失水 率為23.58 %，發(fā)芽率達(dá)到93 %。
[0035]表1不同激素配比對仙茅幼葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響
[0037]表2不同激素配比對人工種子發(fā)芽生根率及多菌靈對染菌率的影響

[0039] 表3不同濃度包埋劑及反應(yīng)時間對種人工種子形態(tài)的影響
[0042] 用3%的海藻酸鈉與2%的CaCl2制作的人工種子測試失水率
[0043] 將制作好的人工種子置于鋪有無菌水浸潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)溫度(25±1)°C， 每天光照12h，光照強(qiáng)度1 200~15001x。觀察人工種子形態(tài)并每5d測量1次失水率，實驗重 復(fù)二次。
[0044] 失水率=貯藏前的質(zhì)量-1C藏后的質(zhì)量/貯藏前的質(zhì)量X 100%
[0045] 表4包埋次數(shù)對人工種子失水率的影響
【主權(quán)項】
1. 一種仙茅人工種子的制作方法，其特征在于，包括仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)、仙茅不定芽 的誘導(dǎo)、仙茅不定芽的篩選以及仙茅不定芽的包埋和人工種子的制備步驟，仙茅不定芽的 包埋和人工種子的制備過程中，仙茅不定芽在包埋液中反應(yīng)后再與質(zhì)量濃度為2%的CaCl 2 溶液反應(yīng)，上述反應(yīng)重復(fù)一次； 其中，所述的包埋液是以l/2MS+0.8mg/L NAA+0.05mg/L 6-BA+3%蔗糖+3mg/L多菌靈 為人工胚乳，在其中加入3 %海藻酸鈉熬制而成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，仙茅不定芽的包埋和人工種子的制備 過程為:將不定芽加入滅菌過的包埋液中，攪拌充分混合，3分鐘后，將含有不定芽的包埋液 滴入到質(zhì)量濃度為2%的CaCl 2溶液中，反應(yīng)5分鐘，形成透明有彈性的人工種子，將制作的 人工種子再放入人工胚乳中，攪拌充分混合，3分鐘后，用玻璃棒將含有不定芽的包埋液，撥 入到質(zhì)量濃度為2%的CaCl 2溶液中，反應(yīng)10分鐘。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，切取 長為4_6mm的仙茅幼葉，接種到MS+1 · 5mg/LKT+0 · lmg/L2，4-D+3 · 0% 鹿糖+0 · 7 %瓊脂+3mg/L 多菌靈+8mg/L檸檬酸培養(yǎng)基中進(jìn)行仙茅愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，仙茅不定芽的誘導(dǎo)過程中，把得到 的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂+3mg/L多菌靈分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的誘 導(dǎo)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，仙茅不定芽的選擇過程中，選出長 度為2-3mm的不定芽。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制作方法，其特征在于，仙茅愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)溫 度25 ± 1°C，光照強(qiáng)度1100-1200lx，光照時間10-12h。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制作方法，其特征在于，仙茅不定芽的誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)溫度 25 ± 1°C，光照強(qiáng)度 1100-1200lx，光照時間 12-14h。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于，含有不定芽的包埋液滴入到質(zhì)量濃度 為2 %的CaCl2溶液的過程中，用內(nèi)徑為3mm的吸管吸取包含有不定芽的包埋液。
【文檔編號】A01H4/00GK105850736SQ201610217475
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月11日
【發(fā)明人】何鋼, 張虹, 劉賢桂, 榮廣天, 劉杰, 朱麗芳, 葉生寶
【申請人】中南林業(yè)科技大學(xué)