一種用于檢測赤羽病病毒的引物對及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測赤羽病病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2；還公開了一種包含上述引物對的赤羽病病毒的檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明一種用于赤羽病病毒的引物對，在特異引物對的基礎上，優(yōu)化了PCR條件，擴增出了赤羽病病毒的核苷酸序列，并優(yōu)化了檢測條件和檢測體系制備了檢測該病毒的試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩(wěn)定性，靈敏度達8pg，可以快速準確檢測赤羽病病毒。
【專利說明】—種用于檢測赤羽病病毒的引物對及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒檢測領域，具體涉及一種用于檢測赤羽病病毒的引物對及其應用。【背景技術】
[0002]赤羽病是由赤羽病病毒(Akabane virus, AKV)引起的牛、羊等動物流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、以及先天性關節(jié)彎曲一積水性無腦綜合征的一種動物蟲媒傳染病。1990年時證實該病在我國存在。赤羽病病毒屬于布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒屬辛布(simbu)病毒血清群的一個亞群，為單股負鏈RNA病毒。目前，赤羽病的診斷主要通過病毒分離、瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、中和試驗和ELISA試驗等方法。AKA給畜牧業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，是我國動物疾病防制和國際動物貿(mào)易中的重點檢疫對象。因此有必要加強對該病的研究與檢測監(jiān)控，防止該病在我國的發(fā)生、傳播和大規(guī)模流行。赤羽病在全球范圍內(nèi)大范圍流行和傳播，嚴重威脅著動物健康和畜牧業(yè)發(fā)展，對人類健康、社會穩(wěn)定和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展也帶來不良影響。常規(guī)診斷方法是病原分離鑒定和血清學方法，但這些方法存在敏感性低、特異性差，操作費時費力等局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的技術問題是一種用于赤羽病病毒的引物對。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供一種赤羽病病毒的檢測試劑盒。
[0004]技術方案:為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種用于檢測赤羽病病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0005]一種赤羽病病毒的檢測試劑盒，它包含所述的引物對。
[0006]上述的赤羽病病毒的檢測試劑盒，包括:
[0007]1)預混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P125 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 的下游引物 Ρ225μ L，2XPCR pre_mix250 μ L，ddH20150 μ L 組成；
[0008]2)陰性對照:非赤羽病病毒的DNA片段500 μ L ;
[0009]3)陽性對照:赤羽病病毒的DNA片段500 μ L。
[0010]上述的赤羽病病毒的檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
[0011]1)抽提赤羽病病毒的質粒；
[0012]2) PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，H2036 μ L，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s, 58°C退火 lmin30s, 72°C延伸 lmin, 15 個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin0
[0013]3) PCR擴增產(chǎn)物分析。
[0014]有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下:本發(fā)明一種用于赤羽病病毒的引物對，在特異引物對的基礎上，優(yōu)化了 PCR條件，擴增出了赤羽病病毒的核苷酸序列，并優(yōu)化了檢測條件和檢測體系制備了檢測該病毒的試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩(wěn)定性，靈敏度達6pg,可以快速準確檢測赤羽病病毒。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:PCR方法特異性實驗的電泳圖；其中，泳道I為DNAmaker，泳道2、3、4為本發(fā)明的赤羽病病毒的DNA擴增產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0016]實施例1:試劑盒的制備。
[0017]1、病毒及病料的來源和處理
[0018]赤羽病臨床病料于2012年10月采自河南牛的內(nèi)臟器官。取0.5g內(nèi)臟組織于無菌研缽，加生理鹽水研磨，反復凍溶3次后5500rmp離心3min，取上清于_20°C保存。
[0019]2、試劑
[0020]PCR pre-mix、蛋白酶 K 購自大連 Takara 公司；DNA Marker、GoldView 購自南京上高生物公司；引物由Sigma公司合成。其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。
[0021]1、引物的設計與合成
[0022]根據(jù)GenBank中EHD的全基因序列，使用引物設計軟件Primer5.0設計一對檢測引物。AKV 上游引物 Pl 為:5’-TAAGTATGGGCAGCAGCTCAAC-3’ ；
[0023]下游引物P2 (5，-TCAGCAATCCAGCGAGCTAA-3’)，預期擴增片段大小約為 250bp。
[0024]2、陽性對照:即含有赤羽病病毒的DNA片段
[0025]3、陰性對照:非赤羽病病毒的DNA片段
[0026]實施例2:檢測方法
[0027]按照以下步驟進行檢測:
[0028](I)樣品處理:取赤羽病臨床病料于2012年10月采自河南牛內(nèi)臟器官。取0.6g內(nèi)臟組織于無菌研缽，加生理鹽水研磨，反復凍溶3次后6000rmp離心4min，取上清于_20°C保存。
[0029](2)病毒DNA的提取:將可疑病料組織懸浮液凍融3次，離心取上清450 μ L，加入蛋白酶K至終濃度500μ g/mL，加入SDS至終濃度10g/L，55°C水浴30min，用苯酚、苯酚-氯仿(體積比1:1)混合液及氯仿各抽提I次，吸取水相，加入1/10體積的3mol/LNaAc (pH5.2)及2.5倍體積的無水乙醇沉淀，12000r/min4°C離心15min,沉淀懸浮于超純水中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030](3)PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，H2036 μ L，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，58。。退火 lmin30s，72°C延伸 lmin, 15 個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin,
4°C保存。
[0031](4)PCR擴增產(chǎn)物分析:結束后取8 μ L PCR擴增產(chǎn)物加于1%瓊脂糖凝膠孔中放于電壓為180V的電泳槽里電泳lOmin，于紫外投射儀中觀察結果。
[0032]從圖1可以看出:赤羽病病毒擴增出了一條約250bp的片段。
[0033]以上所述僅是本發(fā)明 的優(yōu)選實施方式，應當指出:對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種用于檢測赤羽病病毒的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2。
2.—種赤羽病病毒的檢測試劑盒，它包含權利要求1所述的引物對。
3.根據(jù)權利要求2所述的赤羽病病毒的檢測試劑盒，其特征在于包括: 1)預混劑A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P125 μ L，核苷酸序列如SEQ IDNO:2 的下游引物 Ρ225μ L，2XPCR pre-mix250 μ L, ddH20150 y L 組成； 2)陰性對照:非赤羽病病毒的DNA片段500μ L ; 3)陽性對照:赤羽病病毒的DNA片段500μ L0
4.權利要求3所述的赤羽病病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)抽提赤羽病病毒的DNA； 2)PCR擴增:PCR反應體系為50 μ L體系，反應體系中含PCR pre-mixlO μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，Η2036 μ L，瞬時離心混勻；PCR工作程序為:94°C預變性3min ;94°C變性 30s，58。。退火 lmin30s，72°C延伸 lmin，15 個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin0 3)PCR擴增產(chǎn)物分析 。
【文檔編號】C12N15/11GK103820579SQ201410075749
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權日:2014年3月3日
【發(fā)明者】詹愛軍 申請人:江蘇博愛生物科技有限公司