檢測食品中乳酸菌的方法及檢測用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測食品中乳酸菌的方法，其包括，(1)提取食品中細菌基因組DNA；(2)進行PCR擴增，其中所使用的引物對是兼并引物對；(3)對PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳檢測，如檢測到唯一PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，否則檢測結(jié)果為陰性；如檢測結(jié)果為陽性則不需要進行步驟(4)，如檢測結(jié)果為陰性則需要進行步驟(4)；(4)任選對PCR擴增的產(chǎn)物進行測序。本發(fā)明還提供了其中所用的引物等。本發(fā)明方法，直接可對各廠家的含一種或多種乳酸菌的制品進行檢測，檢測結(jié)果可以有效排除假陽性，從而便于推廣實施，而對于檢測陰性的制品，再配合測序，可以確保檢測結(jié)果的正確性。
【專利說明】檢測食品中乳酸菌的方法及檢測用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及食用乳酸菌檢測的方法以及其中所使用的引物對等。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸菌是一群形態(tài)、代謝性能和生理學特征不完全相同的革蘭氏陽性菌。由于具有許多有益的代謝特征，被廣泛用于輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥及飼料工業(yè)等許多行業(yè)上。目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌在細菌分類學上劃分為23個屬，常用于微生態(tài)制劑的菌種有雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌、腸球菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌和地衣芽孢桿菌等。
[0003]多數(shù)乳酸菌通常被認為是安全的，因此相應(yīng)的檢測標準不完善，所以對乳酸菌的檢測一致為人所忽視。目前市場上銷售的含乳酸菌制品，僅在標簽中列明菌種名稱，缺乏一些具體的菌種信息，甚至部分菌種名稱是廠家自行命名的，與國際標準數(shù)據(jù)庫的信息無法對應(yīng)，也就無法溯源，更不用提相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。尤其是，近來的一些研究表明，部分乳酸菌也可能致病(參見劉小青，等.乳酸菌的安全性研究.中國微生態(tài)學雜志，21 (10):952-955)。因此，本發(fā)明人認為，在食品安全日益引起重視的今天，確定食品生產(chǎn)廠家所用乳酸菌的菌種、菌株及其所內(nèi)在決定的穩(wěn)定性和安全性是非常有必要的。
[0004]要保證乳酸菌及其制劑的安全性和質(zhì)量，需要對其菌“株”在投產(chǎn)前進行生物學、遺傳學特征的檢測，以便核實其安全性。由于即使菌株進行保藏、培養(yǎng)，通常也難以分辨。而最有效的檢測方法是DNA測序，但是由于含乳酸菌制品成分復(fù)雜，往往是多種乳酸菌的混合物，直接測序的干擾嚴重；分離菌株并培養(yǎng)后再測序，耗費的時間長。更為嚴重的是，DNA測序的成本較高，廠家和食品·監(jiān)督機構(gòu)日常使用的成本太高，不易施行，即使制定相應(yīng)方法也難以大面積實施，使得該方法形同虛設(shè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的檢測食品中乳酸菌的方法，其能夠?qū)环N或多種乳酸菌的制品進行檢測，檢測結(jié)果可以有效排除假陽性。另外，本發(fā)明還提供了該方法中所用的引物或引物對及其應(yīng)用等。
[0006]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了檢測食品中乳酸菌的方法，其包括，
[0007](I)提取食品中乳酸菌基因組DNA ；
[0008](2)對步驟⑴提取的DNA進行PCR擴增，其中所使用的引物對是兼并引物對；
[0009](3)將步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳檢測；如檢測到唯一 PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，否則檢測結(jié)果為陰性；如檢測結(jié)果為陽性則不需要進行步驟(4)，如檢測結(jié)果為陰性則需要進行步驟(4)；
[0010](4)任選對步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物進行測序。
[0011]在本發(fā)明的【具體實施方式】中，食品是酸奶。
[0012]優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，乳酸菌是嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌中的一種或多種。
[0013]在本發(fā)明中，兼并引物對指的是引物對中的正向和/或反向引物中至少有一條是兼并引物。在本發(fā)明中，兼并引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，即引物的至少有一個位置上具有兩種或兩種以上核苷酸。在核酸合成儀順序合成引物的過程中，通過當要合成具有兩種或兩種以上核苷酸的位置時，同時加入該兩種或兩種以上核苷酸即可。這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是完全能夠合成的，并且有商業(yè)化的公司提供合成服務(wù)。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，引物對中的引物選自SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ IDN0.10。
[0014]更優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，引物對中的正向引物選自SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4 ;和/或，引物對中的反向引物選自SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10。 [0015]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述PCR擴增的體系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot StartVersion試劑盒，如下:
[0016]TaKaRa Ex Taq HS(5U / μ 1)0.25 μ I
[0017]IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ I
[0018]dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 μ I
[0019]正向和反向引物(各20μΜ)各0.5μ I
[0020]細菌基因組提取液中的DNA50ng
[0021]加水定容至50μ1;
[0022]所述PCR擴增條件為:95°C 2min 預(yù)變性；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，45 個循環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0023]優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，步驟(3)中，如果PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測是大小為250-300bp的唯一一條PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，不進行步驟(4);如果出現(xiàn)該條帶的同時也出現(xiàn)了其他條帶，則檢測結(jié)果為陰性，進行步驟(4)。
[0024]優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，測序是illumina genome analyzer測序。Illuminagenome analyzer測序是一種基于單分子簇的邊合成邊測序的方法。具體而言,測序時將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面(即Flow cell)，這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計Cluster,每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS (邊合成邊測序)技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。IIllumina Genome Analyzer測序技術(shù)避免了像傳統(tǒng)測序技術(shù)那樣耗費大量人力、物力進行片段克隆、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等工作，測序通量有著若干個數(shù)量級的提高。
[0025]在第二方面，本發(fā)明提供了引物，其選自SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9 和 SEQID N0.10。
[0026]另外，本發(fā)明還提供了引物對，引物對由正向引物和反向引物組成，其中引物對中的正向引物選自SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，而且其中引物對中的反向引物選自 SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10。
[0027]在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的引物或引物對在檢測食品中乳酸菌的方法中的應(yīng)用。優(yōu)選檢測食品中乳酸菌的方法是本發(fā)明的第一方面的方法。
[0028]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明結(jié)合含乳酸菌制品中乳酸菌優(yōu)勢的特點，基于PCR方法建立了一套簡便易行的檢測識別乳酸菌的方法，直接可對各廠家的含一種或多種乳酸菌的制品進行檢測，檢測結(jié)果可以有效排除假陽性，從而便于推廣實施，而對于檢測陰性的制品，再配合測序，可以確保檢測結(jié)果的正確性。應(yīng)用于食品工業(yè)時，能檢測含多種乳酸菌的制品，適應(yīng)性好；檢測速度快，絕大多數(shù)可以在2~3小時內(nèi)完成檢測；操作簡便，成本低，絕大多數(shù)無需動用昂貴的測序工序；檢測準確率高，尤其是假陽性率很低，因而便于推廣應(yīng)用。
[0029]以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明實施例2 中的PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0031]以下通過具體的實施例進行示例，其中所用試劑均可通過市場渠道購買，如有未盡之處，可以參考相應(yīng)的PCR和基因測序的實驗手冊。
[0032]實施例1食品中包括乳酸菌的細菌基因組的提取
[0033]從市場可以購買的進出口酸奶樣本24個，其中進口產(chǎn)品11種，國產(chǎn)或合資品牌13種，采用Tiangen細菌DNA提取試劑盒(商品編號DP302-02)分別提取24種酸奶產(chǎn)品中細菌的全基因組DNA。即取不同樣本酸奶液1ml，以1000Orpm離心I分鐘，棄去上清液體，然后將沉淀參照試劑盒的廠商說明書進行提取，得細菌基因組提取液。通過測定提取液0D260 / 280比值，確定DNA濃度。
[0034]實施例2乳酸菌菌株的PCR檢測
[0035]根據(jù)本發(fā)明人前期對各廠商的菌株安全性和測序研究，設(shè)計了如下表1所示的兼并引物對，委托上海英駿生物科技有限公司合成，分別針對實施例1記載的從各廠商酸奶中提取的細菌基因組提取液進行PCR擴增，另取大腸桿菌、阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)基因組提取液作為對照。
[0036]表1
【權(quán)利要求】
1.檢測食品中乳酸菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提取食品中細菌基因組DNA； (2)對步驟(1)提取的DNA進行PCR擴增，其中所使用的引物對是兼并引物對；其中所述引物對是 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.2 和SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.2 和SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3和 SEQ IDN0.7、SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.1和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.4和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.9、以及 SEQ IDN0.4 和 SEQ ID N0.10 ； (3)將步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳檢測；如檢測到唯一PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，否則檢測結(jié)果為陰性；如檢測結(jié)果為陽性則不需要進行步驟(4)，如檢測結(jié)果為陰性則需要進行步驟(4)； (4)任選對步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物進行測序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品是酸奶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌是嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌中的一種或多種。`
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR擴增的體系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot Start Version 試劑盒，如下:
5U / μ I 的 TaKaRaExTaqHS0.25 μ I
加 Mg2+的 IOXEx Taq Buffer5 μ I
各 2.5mM 的 dNTPMixture4 μ I 各20 μ M的正向和反向引物各0.5μ I 細菌基因組提取液中的DNA50ng 加水定容至50μ I ； 所述 PCR擴增條件為:95°C 2min 預(yù)變性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，45 個循環(huán)；72°C延伸5min。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，如果PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測是大小為250-300bp的唯一一條PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，不進行步驟(4);如果出現(xiàn)該條帶的同時也出現(xiàn)了其他條帶，則檢測結(jié)果為陰性，進行步驟(4)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑷中，所述測序是illiminagenomeanalyzer 測序。
7.用于檢測食品中乳酸菌的引物對，其特征在于，所述引物對是SEQID N0.2和SEQID N0.5、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.2 和 SEQ IDN0.7、SEQ IDN0.2 和 SEQIDN0.8、SEQ IDN0.2 和 SEQ IDN0.9、SEQ IDN0.2 和 SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.3 和 SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.3 和 SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.9,SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.4 和 SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.4 和 SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.9、以及 SEQ IDN0.4 和 SEQ IDN0.10。
8.如權(quán)利要求7所述的引物對在檢測食品中乳酸菌的方法中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述檢測食品中乳酸菌的方法是權(quán)利要求1~7之任一所述的方法。
10.檢測酸奶中嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱乳鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提取酸奶中細菌基因組DNA； (2)對步驟(1)提取的DNA進行PCR擴增，其中所使用的引物對是兼并引物對；其中所述引物對是 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.2 和SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.2 和SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.3 和SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.1 和SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4和 SEQ IDN0.7、SEQ ID N0.4 和 SEQ IDN0.8, SEQ IDN0.4 和 SEQ IDN0.9、以及 SEQ IDN0.4和 SEQ ID N0.10 ； (3)將步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物`進行電泳檢測；如檢測到唯一PCR擴增條帶，則檢測結(jié)果為陽性，否則檢測結(jié)果為陰性；如檢測結(jié)果為陽性則不需要進行步驟(4)，如檢測結(jié)果為陰性則需要進行步驟(4)； (4)任選對步驟(2)的PCR擴增的產(chǎn)物進行測序。
【文檔編號】C12Q1/04GK103667509SQ201310739069
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】楊捷琳, 倪勝, 王敏, 呂蓉, 楊柳, 潘良文 申請人:上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海欣景生物科技有限公司