一種從d-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法。所述方法用超濾膜與生物酶法聯(lián)用處理D-核糖發(fā)酵液中的雜蛋白并生產(chǎn)活性多肽。其方法步驟如下：發(fā)酵液微濾除菌，超濾收集蛋白，板框過(guò)濾得到濾餅。通過(guò)向板框過(guò)濾后的濾餅中加入溶解液的方法溶解鹽蛋白和多肽類，混合物再用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶處理，雙水相體系萃取酶解液，萃取液用截留分子量5000-10000Da的超濾膜除去處理不到位的雜蛋白。濾液經(jīng)脫鹽，濃縮，噴霧干燥得到成品。本發(fā)明利用雙水相萃取與酶解技術(shù)相結(jié)合處理發(fā)酵液中蛋白廢渣，在獲得主產(chǎn)物核糖的同時(shí)，可以獲得有抗菌性的活性多肽。
【專利說(shuō)明】一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究表明利用芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物防治或生產(chǎn)微生物殺菌劑以替代劇毒化學(xué)藥品是一種可行的策略，枯草芽孢桿菌可以分泌高分子量的抗菌蛋白、低分子量的抗菌素和揮發(fā)性活性物質(zhì)等三大類抗菌物質(zhì)。其中非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素在多數(shù)菌株中被合成，是拮抗活性作用的主要成分。抗菌素是在芽孢桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期尚未形成芽孢時(shí)產(chǎn)生的，在穩(wěn)定前期活性最高，分子量通常比一般的蛋白小，大都含有一些稀有氨基酸，分子結(jié)構(gòu)一般為環(huán)肽?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)大多為低分子抗菌肽，分子量在1000-5000Da。
[0003]由于D-核糖發(fā)酵采用枯草芽孢桿菌，在獲得產(chǎn)物D-核糖的同時(shí)，很多副產(chǎn)物在預(yù)處理階段被當(dāng)作廢物除去，其中包括大分子蛋白、多肽類物質(zhì)和細(xì)菌素等。不僅造成環(huán)境污染，還是一種資源浪費(fèi)。迄今為止工業(yè)上還沒(méi)有一種工藝簡(jiǎn)單合理、適宜于大規(guī)模生產(chǎn)的從D-核糖發(fā)酵液中提取多肽物質(zhì)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種易于生產(chǎn)操作，操作過(guò)程有害添加物少，附加值高的發(fā)酵廢料利用方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法包括以下步驟:將廢料經(jīng)微濾除菌得到的發(fā)酵液，通過(guò)超濾得到蛋白和多肽物質(zhì)的濃縮液，向濃縮液中按750-800mg/L加入聚氯化鋁對(duì)蛋白和多肽絮凝，板框過(guò)濾得到蛋白濾渣；向蛋白廢渣中加入8-10倍體積的溶解液溶解鹽蛋白和多肽類得到蛋白混合液；調(diào)節(jié)蛋白混合液PH為中性，用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶對(duì)蛋白混合物酶解2h ;酶解液通過(guò)聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(Reppal PEG)雙水相體系進(jìn)行萃?。惠腿∫和ㄟ^(guò)超濾除去處理不到位的雜蛋白，得到超濾液；超濾液用Sephadex G_25柱凝膠過(guò)濾層析或1%的離子交換樹(shù)脂在60°C下攪拌30min脫鹽，料液溫度控制在30-40°C，采用反滲透進(jìn)行濃縮；通過(guò)噴霧干燥得到成品多肽。
[0006]所述的溶解液為2-5%的氯化鈉或12.6 - 13.0%的硫酸銨的水溶液。
[0007]所述的木瓜蛋白酶用量為2-4%，反應(yīng)溫度50_70°C。
[0008]所述的聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(Iteppal PEG)雙水相體系中PEG濃度為
8.0-9.8%, Reppal PEG 濃度為 39.0-41.5%,萃取溫度為 25-35°C。
[0009]所述萃取液超濾所用的超濾膜為中空纖維超濾膜，截留分子量為5000_10000Da，操作壓力0.3-0.4MPa，操作溫度為25_35°C。 [0010]所述的噴霧干燥，入口溫度100-105°c，出口溫度50-55°C。[0011]本發(fā)明利用雙水相萃取與酶解技術(shù)相結(jié)合處理發(fā)酵液中蛋白廢渣，在獲得主產(chǎn)物D-核糖的同時(shí)，可以獲得抗菌性的活性多肽，多肽的收率達(dá)到80%以上?；钚远嚯目蓮V泛應(yīng)用于食品防腐劑、新型醫(yī)藥飼料抗生素、植物病害防治等。因此，此工藝可以有效減少發(fā)酵廢物，創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0013]實(shí)施例1
將酸化后D-核糖發(fā)酵液2m3，通過(guò)膜過(guò)濾收集含有蛋白的濃縮液，按750-800mg/L加入聚氯化鋁對(duì)濃縮液中蛋白和多肽絮凝，板框過(guò)濾得到蛋白與多肽的混合濾渣。用4%的氯化鈉水溶液作為溶解液溶解濾渣中的部分多肽和蛋白，將蛋白混合物用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至中性，加入木瓜蛋白酶在60-70°C范圍內(nèi)保溫，所用的生物酶為1000-1500u/g的木瓜蛋白酶，用量為2.0%。保溫后得到酶解的多肽水溶液。在酶解液中加入8.0-9.8%的PEG4000與39.0-41.5%的R印pal PES所組成的雙水相體系萃取，萃取溫度25-35 °C。
[0014]將上述萃取液通過(guò)截留分子量為1000ODa的中空纖維超濾膜過(guò)濾，平均膜通量為230-240L/H。操作溫度30_35°C，操作壓力為0.3MPa，超濾的目的是除去處理不到位的雜蛋白，以及建立萃取體系過(guò)程中引入的雜質(zhì)。
[0015]采用1%的離子交換樹(shù)脂在60°C下攪拌30min脫鹽，料液溫度控制在30_40°C，反滲透進(jìn)行濃縮，通過(guò)噴霧干燥得到成品多肽，入口溫度100-105°C，出口溫度50-55°C，得到多肽 1.56Kg，收率 81.70%ο
[0016]實(shí)施例2
將酸化后D-核糖發(fā)酵液2m3，通過(guò)膜過(guò)濾收集含有蛋白的濃縮液，按750-800mg/L加入聚氯化鋁對(duì)濃縮液中蛋白和多肽絮凝，板框過(guò)濾。用12.6 - 13.0%的硫酸銨水溶液作為溶解液溶解濾渣中的部分多肽和蛋白。將蛋白混合物用氨水調(diào)節(jié)PH至中性，加入堿性蛋白酶在30-50°C范圍內(nèi)保溫，所用的生物酶為2000- 2500u/g的堿性蛋白酶，用量為0.2%。保溫后得到酶解的多肽溶液。萃取按照實(shí)施例1中后續(xù)提取方法進(jìn)行，得到多肽1.53Kg，收率80.13%。
[0017]實(shí)施例3
將酸化后D-核糖發(fā)酵液2m3，通過(guò)膜過(guò)濾收集含有蛋白的濃縮液，按750-800mg/L加入聚氯化鋁對(duì)濃縮液中蛋白和多肽絮凝，板框過(guò)濾。用3%的氯化鈉水溶液作為溶解液溶解濾渣中的部分多肽和蛋白，將蛋白混合物用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至中性，加入木瓜蛋白酶在55-60°C范圍內(nèi)保溫，所用的生物酶為1000-1500u/g的木瓜蛋白酶，用量為4.0%。保溫后得到酶解的多肽水溶液。萃取體系同實(shí)施例1。
[0018]將上述萃取液通過(guò)截留分子量為5000Da的中空纖維超濾膜過(guò)濾，操作溫度30-400C，平均膜通量為180-200L/H。操作溫度30_35°C，操作壓力為0.3MPa，脫鹽按照實(shí)施例I中后續(xù)提取方法進(jìn)行，得到多肽1.58Kg，收率82.75%。
【權(quán)利要求】
1.一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于它包括以下步驟:將廢料進(jìn)行微濾除菌得到的發(fā)酵液，通過(guò)超濾得到蛋白和多肽物質(zhì)的濃縮液，向濃縮液中按750-800mg/L加入聚氯化鋁對(duì)蛋白和多肽絮凝，板框過(guò)濾得到蛋白濾渣；向蛋白廢渣中加入8-10倍體積的溶解液溶解鹽蛋白和多肽類得到蛋白混合液；調(diào)節(jié)蛋白混合液PH為中性，用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶對(duì)蛋白混合物酶解2h ;酶解液通過(guò)聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(Reppal PEG)雙水相體系進(jìn)行萃取；萃取液通過(guò)超濾除去處理不到位的雜蛋白，得到超濾液；超濾液用Sephadex G-25柱凝膠過(guò)濾層析或1%的離子交換樹(shù)脂在60°C下攪拌30min脫鹽，料液溫度控制在30-40°C，采用反滲透進(jìn)行濃縮；通過(guò)噴霧干燥得到成品多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于:所述的溶解液為2-5%的氯化鈉或12.6 - 13.0%的硫酸銨的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于:所述的木瓜蛋白酶用量為2-4%，反應(yīng)溫度50-70°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于:所述的聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(Iteppal PEG)雙水相體系中PEG濃度為8.0-9.8%, Reppal PEG 濃度為 39.0-41.5%,萃取溫度為 25-35°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于:萃取液超濾所用的超濾膜為中空纖維超濾膜，截留分子量為5000-10000Da，操作壓力0.3-0.4MPa，操作溫度為 25_35°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從D-核糖發(fā)酵廢料中提取多肽類物質(zhì)的方法，其特征在于:所述的噴霧干燥，入口溫度100-105°C，出口溫度50-55°C。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103710417SQ201310735493
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月28日
【發(fā)明者】盧偉, 徐勤華 申請(qǐng)人:山東德普化工科技有限公司