一種g6pd缺乏癥基因檢測(cè)膜條以及pcr引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及G6PD缺乏癥用的基因檢測(cè)膜條及相關(guān)引物，具體涉及一種G6PD缺乏癥基因檢測(cè)膜條以及PCR引物，共包括17個(gè)突變位點(diǎn)共20種突變類型進(jìn)行檢測(cè)，所述20種突變類型分別為：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A，所述PCR引物包括7對(duì)共14條引物，分別簡(jiǎn)寫為G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，本發(fā)明將大大降低患者漏檢的頻率，保護(hù)患者生命和健康，并且該檢測(cè)膜條檢測(cè)迅速準(zhǔn)確，極少出現(xiàn)假陽性或假陰性。
【專利說明】—種G6PD缺乏癥基因檢測(cè)膜條以及PCR引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)上葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase, G6PD)缺乏癥用的基因檢測(cè)膜條及相關(guān)引物,具體涉及一種G6H)缺乏癥基因檢測(cè)膜條以及用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖_6_ 憐酸脫氧酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏癥是全球最常見的一種X連鎖不完全顯性遺傳病，估計(jì)全球有4億人受累。該病的高發(fā)區(qū)包括地中海沿岸、非洲、東南亞及我國的南部省區(qū)。Gero缺乏癥臨床上表現(xiàn)為新生兒黃疸、蠶豆病、藥物性溶血、感染性溶血和非球形細(xì)胞溶血性貧血等疾病，在兒童及嬰幼兒期集中表現(xiàn)為蠶豆病和新生兒黃疸，往往病情較重，如不及時(shí)救治將危及患兒生命。
[0003]目前臨床上常用的G6H)缺乏癥檢測(cè)方法包括高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、G6PD活性試驗(yàn)、Gero定量比值法等，這些化學(xué)試驗(yàn)方法過程簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，適宜在基層醫(yī)院開展，但準(zhǔn)確性較差，存在假陽性或假陰性，特別對(duì)隱性攜帶者的孕婦易漏診，從而造成未對(duì)出生的患兒進(jìn)行應(yīng)有的臨床指導(dǎo)，危及患兒的健康或生命。
[0004]在本申請(qǐng)之前，已有用PCR-膜條雜交技術(shù)方法檢測(cè)G6H)基因突變的技術(shù)方法，其中中國授權(quán)專利，專利號(hào)為:201110069362，公開了一種方法能檢測(cè)12種突變類型，分別為:A95G、G392T、G487A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。中國授權(quán)專利，專利號(hào)為:201210363243專利公開了一種方法能檢測(cè)13種突變類型，分別為:A95G、G392A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。這兩個(gè)專利都未包括中國人群中較為重要的突變類型，因此，以上兩個(gè)專利的產(chǎn)品都將造成較為嚴(yán)重的漏檢，可導(dǎo)致影響部分患者的生命和健康的嚴(yán)重后果O
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種Gero缺乏癥基因檢測(cè)膜條，其檢測(cè)范圍為17個(gè)突變位點(diǎn)共20種突變類型(其中三個(gè)突變位點(diǎn)各有兩種突變類型)，不僅包括了現(xiàn)有技術(shù)中的所有突變類型，而且增加了中國人群中較為重要的突變類型。因此，應(yīng)用本申請(qǐng)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，將大大降低患者漏檢的頻率，保護(hù)患者生命和健康，并且該檢測(cè)膜條檢測(cè)迅速準(zhǔn)確，極少出現(xiàn)假陽性或假陰性。
[0006]本發(fā)明的另一發(fā)明目的是，提供用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，該P(yáng)CR引物針對(duì)17個(gè)突變位點(diǎn)共20種突變類型重新設(shè)計(jì)得出，完全根據(jù)中國人群突變頻率較高的的突變基因型T517C、C519T、C519G、A835G、A835T、C1004A設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確率高，與探針的結(jié)合性能好，擴(kuò)增速率快，對(duì)于臨床檢測(cè)具有很強(qiáng)的臨床指導(dǎo)意義。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種G6ro缺乏癥的基因檢測(cè)膜條，包括基底膜條以及在所述基底膜條上固定有特異性的突變探針和正常對(duì)照探針，共包括20條突變探針和13條正常對(duì)照探針，20個(gè)突變探針對(duì)應(yīng)共17個(gè)突變位點(diǎn)，所述20條突變探針分別為:A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、
C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、
G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
[0008]其中，所述突變探針的3’端或5’端帶有氨基標(biāo)記，所述突變探針的具體序列為:
【權(quán)利要求】
1.一種G6ro缺乏癥的基因檢測(cè)膜條，包括基底膜條以及在所述基底膜條上固定有特異性的突變探針和正常對(duì)照探針，其特征在于:共包括20條突變探針型和13條正常對(duì)照探針，所述 20 種突變探針分別為:A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種G6H)缺乏癥的基因檢測(cè)膜條，其特征在于:所述突變探針和正常對(duì)照探針的3’端或5’端帶有氨基標(biāo)記，所述突變探針的具體序列為:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Gero缺乏癥的基因檢測(cè)膜條，其特征在于:所述基因檢測(cè)膜條由以下方法制備而成: a.用打印機(jī)在基底膜條上打印位點(diǎn)陣列； b.用EDAC溶液浸泡打印后的膜條:將浸泡后的膜條置于水平搖床上輕搖浸泡30min，以活化膜條表面的羧基基團(tuán)； c.分別用探針稀釋液將33條探針稀釋至5μ mol/L ； d.將探針點(diǎn)加在膜條相應(yīng)位點(diǎn)上，探針上的氨基與膜條表面的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)； e.待膜條干燥后，用0.lmol/L的NaOH溶液浸泡膜條5分鐘，以封閉膜條表面未反應(yīng)的竣基; f.純水洗滌膜條，干燥后即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Gero缺乏癥的基因檢測(cè)膜條，其特征在于:所述檢測(cè)膜條上的探針陣列具體從左至右包括4行8列依次排列，共30個(gè)探針位點(diǎn)，第一行的探針排列為:517N、1376N、1388N、487N、95N、392N、871N、92N ;第二行的探針排列為:835N、1376M、1388M、487M、95M、392M、871M、1004N ;第三行的探針排列為:1311N、1381M、1387M、493M、592M、1004M、1024M、1024N ;第四行的探針排列為:1360N、517M、519M、835M、1311M、360M。
5.用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，其特征在于:所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有權(quán)利要求1所述的17個(gè)突變位點(diǎn)共20種突變類型，所述PCR引物包括7對(duì)共14條引物，分別簡(jiǎn)寫為 GIF、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R,相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別包括如下位點(diǎn):引物GlF和GlR擴(kuò)增位點(diǎn)為cDNA392，G2F和G2R擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA487、cDNA493、cDNA517、cDNA519、cDNA592, G3F 和 G3R 擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA95，G4F 和G4R 擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA871、cDNA1004、cDNA1024，G5F 和 G5R 擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA1376、cDNA1381、cDNA1387、cDNA1388, G6F 和 G6R 擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA835, G7F 和 G7R 擴(kuò)增位點(diǎn)為 cDNA1311、CDNA1360。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的PCR引物，其特征在于:所述引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PCR引物，其特征在于:所述14條引物序列為:
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PCR引物，其特征在于:所述PCR引物由以下方法擴(kuò)增而成:步驟1:合成14條引物，配制成25 μ L的PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液含有各成份及濃度分別為:14 條引物濃度為 0.2ymol/L、Taq 酶為 0.1U/μ LUXPCR Buffer^MgCl2 % 1.5mmol/L、UNG 酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)為 0.01U/ μ L、dN (U)TP 為 0.2mmol/L、模板 DNA 約為 2ng/μ L ； 步驟2:將步驟I配制好的反應(yīng)液經(jīng)過以下程序反應(yīng):50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C45秒，53°C 45秒，72°C 30秒，循環(huán)`35次；最后72°C 5分鐘即可。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103695554SQ201310730702
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】陸小梅, 黎四平, 李文瑞, 彭琪 申請(qǐng)人:東莞市石龍博愛醫(yī)院