專利名稱：：用于角膜營養(yǎng)不良診斷的dna芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸。具體地，本發(fā)明涉及用于檢測角膜營養(yǎng)不良診斷的BIGH3基因突變的寡聚核苷酸，所述角膜營養(yǎng)不良包括必須在視力矯正外科手術(shù)之前進行精確診斷的Avelllino角膜營養(yǎng)不良，本發(fā)明還涉及用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其具有固定于其上的寡聚核苷酸。
背景技術(shù)：
：角膜營養(yǎng)不良是常染色體顯性遺傳疾病，其從角膜中心的模糊癥狀開始并逐漸擴散，因此隨著患者變老最終會喪失視力。這種疾病包括Avellino角膜營養(yǎng)不良、顆粒狀(Granular)角膜營養(yǎng)不良，格子狀(Lattice)I型角膜營養(yǎng)不良、雷-布二氏(Reis-bucklers)角膜營養(yǎng)不良等等，并由編碼PIG-H3的基因突變引起。受到Avellino角膜營養(yǎng)不良困擾的雜合體患者隨著變老表現(xiàn)出嚴重的視力喪失，而純合體患者自6歲以后就完全喪失視力。Avellino角膜營養(yǎng)不良是一種在1988年新命名的疾病，其區(qū)別于一般稱為Granular的角膜營養(yǎng)不良，因為發(fā)現(xiàn)其具有無聯(lián)系的癥狀和遺傳基礎(chǔ)。并且已知其為世界上最常見的角膜營養(yǎng)不良，基于遺傳分析在韓國1/3401/1000的流行率(雜合體的情況)表明其為常見的營養(yǎng)不良(Holland,E丄等人，0//^/za/wo/ogy，99:1564，1992;Kennedy,S.M.等人，/0;/zAa/mo/.，80:489，1996;Dolmetsch，A.M.等人，Ca"./.O;9/2Aa/w0/.，31:29，1996;Afshari，N.A.等人，Ac/z.pp/^/w/mo/.，119:16，2001;Stewart,H.S.//謂.M廳.，14:126，1999)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果Avellino角膜營養(yǎng)不良困擾的雜合體患者進行了LASIK外科手術(shù)，2年后，角膜的不透明性開始迅速增加(Jun，R.M.等人，Ophthalmology,111:463，2004)，并逐漸引起視覺喪失。之前，已進行眼睛外科手術(shù)，期望LASIK或者Eecimer激光外科手術(shù)能夠使患者免除因角膜營養(yǎng)不良帶來的視力模糊。而且，甚至在韓國，已經(jīng)進行了大約30萬例LASIK外科手術(shù)，基于最保守估計1/1000的受Avellino角膜營養(yǎng)不良困擾的雜合體患者，可假定即300人會導致喪失它們的視覺。進行了LASIK外科手術(shù)的患者主要在是在它們從事生產(chǎn)活動的20多歲和30多歲的年齡；因此，視覺喪失引起社會和經(jīng)濟兩方面的嚴重問題。另外，在2000年在美國正式批準LASIK外科手術(shù)之后，已經(jīng)進行了LASIK外科手術(shù)的受到Avellino角膜營養(yǎng)不良困擾的美洲黑人(AfricanAmerican)患者已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)喪失視力，這表明大量類似情況可能在全世界發(fā)生。因此，雖然需要精確診斷Avellino角膜營養(yǎng)不良來通過LASIK外科手術(shù)防止Avellino角膜營養(yǎng)不良，但Avellino角膜營養(yǎng)不良的診斷僅僅通過角膜透明度的顯微鏡觀察來進行，因此醫(yī)生常常忽視了患者需要進行LASIK外科手術(shù)的潛在癥狀，導致視覺喪失。因此，非常急迫地需要角膜營養(yǎng)不良的快速精確診斷。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)付出了極大的努力來開發(fā)DNA芯片，以便迅速準確地檢測引起角膜營養(yǎng)不良的BIGH3基因突變，結(jié)果，產(chǎn)生了包括BIGH3基因的特定突變區(qū)的探針，并制造了其上固定有探針的DNA芯片，并確保了可使用DNA芯片有效地診斷角膜營養(yǎng)不良，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于，提供包括引起角膜營養(yǎng)不良的BIGH3基因的特定突變區(qū)的寡聚核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于，提供用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，在該芯片上固定了所述寡聚核苷酸。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于診斷角膜營養(yǎng)不良的寡聚核苷酸，其基本含有選自下組的一個或多個核苷酸序列，包括17，序列號19，序列號21，序列號23，序列號25，序列號27，序列號28，序列號29，序列號30，序列號31，序列號33，序列號35，序列號37，序列號40，序列號42，序列號:44，序列號:46，序列號50，序列號:53和序列號59。在本發(fā)明中，基本包括核苷酸序列序列號50的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號12中闡明，基本包括核苷酸序列序列號53的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號13中闡明。在本發(fā)明中，基本含有核苷酸序列序列號59的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號15中闡明，基本含有核苷酸序列序列號35的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號65中闡明。在本發(fā)明中，寡聚核苷酸的長度為13bp到17bp。本發(fā)明還提供了用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，在該芯片上固定了所述寡聚核苷酸。在本發(fā)明中，用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片優(yōu)選為另外在其上固定基本含有選自下組的一種或多種核苷酸序列的寡聚核苷酸，包括序列號16,序列號18,序列號20,序列號22,序列號24,序列號26,序列號32,序列號34,序列號36,序列號38,序列號39,序列號:41,序列號43，序列號45,序列號47,和序列號:56。在本發(fā)明中，基本含有核苷酸序列序列號:47的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號11中闡明，基本含有核苷酸序列序列號56的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號14中闡明，基本含有核苷酸序列序列號34的寡聚核苷酸優(yōu)選在序列號62中闡明。在本發(fā)明中，用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片具有固定于其上的所有寡聚核苷酸，基本含有選自下組的核苷酸序列包括序列號16至序列號:47,序列號50,序列號53,序列號56和序列號59。本發(fā)明還提供了用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其具有固定于其上的由下組構(gòu)成的所有寡聚核苷酸，包括序列號11至序列號:15,序列號62和序列號65。本發(fā)明還提供了一對選自下組的引物，包括序列號l和序列號2;序列號3和序列號4;序列號5和序列號6;序列號7和序列號8;以及序列號9和序列號10。通過下列詳細描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和實施方式將更完全明確。圖1顯示了DNA芯片上的點，以基于點樣溶液來測定DNA芯片的檢測效率。圖2顯示了將來自正常個體的外顯子4PCR產(chǎn)物應(yīng)用到圖1的DNA芯片之后的雜交結(jié)果。圖3顯示了將來自雜合體Avellino角膜營養(yǎng)不良患者的外顯子4PCR產(chǎn)物應(yīng)用到圖1的DNA芯片之后的雜交結(jié)果。圖4顯示了將來自純合體Avellino角膜營養(yǎng)不良患者的外顯子4PCR產(chǎn)物應(yīng)用到圖1的DNA芯片之后的雜交結(jié)果。圖5顯示了將來自雜合體雷-布二氏角膜營養(yǎng)不良(CD1)患者的外顯子4PCR產(chǎn)物應(yīng)用到圖1的DNA芯片之后的雜交結(jié)果。圖6示出了被設(shè)計成基于探針濃度的DNA芯片的點布置。圖7顯示了當使用圖6的DNA芯片時根據(jù)每個患者的預期雜交結(jié)果。圖8顯示了當使用圖6的DNA芯片時基于每個引物組的雜交時間的雜交結(jié)果。圖9顯示了基于探針長度的DNA芯片的雜交結(jié)果的圖表。圖10示出了DNA芯片的點布置，以基于探針長度來評估DNA芯片的雜交效率。圖11顯示了基于探針長度的DNA芯片的雜交結(jié)果。圖12示出了使用3XSSC點樣溶液制成50pM15mer探針的DNA芯片的點布置。圖13顯示了圖12的DNA芯片的雜交結(jié)果。具體實施例方式本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)注意到BIGH3基因突變引起具有角膜不透明癥狀的角膜營養(yǎng)不良的事實，并構(gòu)建了基于在各種角膜營養(yǎng)不良患者中顯示的BIGH3基因中的點突變來診斷每個角膜營養(yǎng)不良的探針，所述角膜營養(yǎng)不良例如為Avellino角膜營養(yǎng)不良，格子狀角膜營養(yǎng)不良，顆粒狀角膜營養(yǎng)不良，雷-布二氏角膜營養(yǎng)不良。在本發(fā)明中構(gòu)建的探針包括核苷酸序列序列號11到序列號67。為了生產(chǎn)能夠使用探針有效檢測角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，檢測了最佳點樣溶液、用于固定的最佳時間和探針的最佳長度。因此，通過使用3XSSC作為點樣溶液，以15mer探針通過6小時的雜交時間來檢測患有角膜營養(yǎng)不良的患者中外顯子4突變或者以17mer探針來檢測外顯子12突變分別產(chǎn)生了最佳結(jié)果。下面的定義用于解釋如下面闡明的本發(fā)明的不同實施方式中使用的術(shù)語和表達。"分離的"核酸分子是從核酸的天然源中存在的其它核酸分子中分離的核酸分子。例如，有關(guān)基因組DNA，術(shù)語"分離的"包括從天然結(jié)合有基因組DNA的染色體分離的核酸分子。術(shù)語"探針"或者"核酸探針"指的是單鏈和序列專一的寡聚核苷酸，其序列充分互補以與待檢測的耙標核苷酸序列雜交。"合成物"指的是與原核和真核基因序列互補的探針可以是純化的核酸或者與其它探針結(jié)合。另外，探針可以以干燥狀態(tài)與鹽或者緩沖液結(jié)合，并且可以是在酒精溶液或者水溶液中的沉淀。術(shù)語"靶標"指的是來自生物樣品的核酸分子，其具有與本發(fā)明的核酸探針中任何一個互補的核苷酸序列。靶標核酸可以是單鏈或者雙鏈DNA(任選地在擴增后得到)或RNA，并包括至少部分地與至少一個寡聚核苷酸探針互補的序列。短語"生物樣品"指的是樣本諸如臨床樣品(例如膿、痰液、血液、尿液等)、環(huán)境樣品、細菌菌落、污染或者純凈的培養(yǎng)物、純化核酸等，感興趣的靶標序列被限制在其中。"寡聚核苷酸"指的是一般大約為IO到大約100個核苷酸長度的核苷酸聚合物，但其長度可大于100或者短于IO個核苷酸。"核苷酸"指的是包括磷酸基團、5-碳糖和含氮堿基的核酸的亞單位。在RNA中，5-碳糖為核糖。在DNA中，其為2-脫氧核糖。對于5-核苷酸來說，糖包括第二碳原子上的羥基(-OH)。該術(shù)語還包括在核糖的第二碳原子處的甲氧基相同的所述亞單位的類似物。術(shù)語"同源性"與一致性同義，指的是多聚核酸例如90%同源是當序列排列時在相同位置具有90%的相同堿基對。"雜交"涉及互補序列與其靶標核酸(待檢測序列)退火。包括互補序列的兩個核酸聚合物通過堿基配對作用彼此識別和退火的能力是公知現(xiàn)象。術(shù)語"引物"指的是提供用于與待復制核酸鏈互補的產(chǎn)品的合成和延長的起始位點的DNA單鏈寡聚核苷酸序列。引物的長度和序列被建議為它們允許引發(fā)產(chǎn)物合成和延長的長度。優(yōu)選地，引物大約長5-50個核苷酸。特定長度和序列將取決于靶標DNAs或者RNAs的組成以及引物使用的環(huán)境條件諸如溫度和離子強度。在本文中使用的術(shù)語"標記"指的是可被用于產(chǎn)生可檢測(優(yōu)選可定量)信號并與核酸連接的任何原子或分子。標記可提供熒光、放射性、比色、重量測定、X-射線衍射或吸收、磁性以及類似的可檢測信號。"雜交"指的是在兩條單鏈核酸序列之間通過Watson-Crick堿基配對或者互補堿基之間的非經(jīng)典(non-canonical)堿基配對形成的復合。短語"探針特異性"指的是探針的特性，描述了其區(qū)分靶標和非靶標序列的能力。從這個方面講，術(shù)語"專一"的意思是核酸序列將與限定的靶標序列雜交，并且基本不與非靶標序列雜交或者極少與其雜交。探針特異性取決于序列和測定條件。短語"標準菌株"包括從市場購買或者在本領(lǐng)域很容易獲得的微生物。探針識別為了生產(chǎn)可檢測各種原核或者真核基因序列的核酸探針，每個檢測探針都需要對靶標序列專一。為此，進行了對每個靶標基因或者有機體專一的候選探針的篩選。候選探針在包含它們的耙標序列的基因區(qū)域中選擇。候選探針的特異性首先通過同源檢索(BLASTsearch)來檢查，比較每個核苷酸序列的同源性，通過在體外使用"靶標"進行雜交來確定。并且在候選探針中僅僅與靶標基因退火的探針最終被確定用于基因識別。另外，通過上述步驟選擇的探針對于基因識別的靈敏性通過使用各種生物樣品的臨床試驗來進行檢査。本發(fā)明的探針為11-17mer寡聚核苷酸，優(yōu)選與它們的待檢測靶標序列具有70%、80%、90%或者95%以上的同源性并精確互補。本發(fā)明的用于檢測并識別每個"耙標"探針長度可以是50個或者大于50個核苷酸。在本發(fā)明中使用的核苷酸可包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和修飾核苷酸諸如肌苷或者含有類似物基團的核苷酸，但不應(yīng)當改變它們的雜交特性。探針的利用本發(fā)明的探針可被用于處于診斷目的研究生物樣品中耙標核酸存在與否的所有良好認識的雜交技術(shù)，諸如在被稱為"Dot-blot"的濾紙上的點點樣(point-spotting)技術(shù)(Maniatis等人，Mo/ecw/flrC7om'"g,ColdSpringHarbor,1982),Southern雜交(Southern,E.M.,,Mo/.&o/.98,503(1975)),或者Northern雜交。本發(fā)明的探針還可被用于三明治雜交系統(tǒng)，增強基于核酸探針的檢測的特異性。在基于核酸探針檢測中三明治雜交的原理和步驟已經(jīng)被描述(Dunn禾口Hassel,Ce//，12:23-36;1977;Ranki等人，G認,21:77-85;1983)。三明治雜交技術(shù)使用捕獲探針和/或檢測探針。這些探針可與它們的靶標核酸的兩個不同區(qū)域雜交，并且至少一個探針(一般為檢測探針)可與對靶標物種特異的靶標區(qū)域雜交。已經(jīng)證明捕獲探針和檢測探針必須具有至少部分不同的核苷酸序列。雖然直接雜交測定具有有利的動力學，但三明治雜交在高信噪比方面是有利的。此外，三明治雜交可提高以核酸探針為基礎(chǔ)的測定的特異性。構(gòu)成三明治雜交過程的關(guān)鍵步驟的溫育和隨后的洗滌步驟每次都在大約2(TC和65'C之間的恒定溫度下進行。已經(jīng)知道，核酸雜交具有依賴于雜交堿基的數(shù)目(溫度傾向于與雜交的尺寸成比例升高)的解鏈溫度，并且該解鏈溫度還依賴于雜交堿基以及它們相鄰堿基的性質(zhì)的。在三明治雜交技術(shù)中使用的雜交溫度應(yīng)當被選擇成低于與給定探針及其互補耙標序列有關(guān)的半解鏈溫度。并且溫度可通過簡單的常規(guī)試驗來確定。本發(fā)明的探針還可在競爭性雜交方案中被使用。在競爭性雜交中，耙標分子與特異性探針及其互補序列競爭以便雜交形成。存在的靶標越多，探針互補的雜交量變得越少。與沒有靶標的系統(tǒng)相比，表示特異性探針存在的陽性信號在雜交反應(yīng)中趨于降低。在特定實施方式中，通常被標記的特異性寡聚核苷酸探針與其靶標分子雜交。接著，混合物被轉(zhuǎn)移到微孔板的孔中，在其中固定了互補的寡聚核苷酸和特異性探針，并允許保持所有雜交。洗滌后，互補寡聚核苷酸和探針的雜交被測定，優(yōu)選基于使用的標記定量測定。另外，本發(fā)明的探針可在反向雜交中使用(iVoc.iVa仏Jc^/.ScZ.86:6230-6234,1989)。對于該方法，靶標序列可首先使用5，-生物素化的引物通過PCR進行酶擴增。在第二步，擴增的產(chǎn)物基于與固定在載體上的特異性寡聚核苷酸雜交進行檢測。反向雜交還可在沒有擴增步驟下進行。在該特定情況下，在雜交之前，生物樣品中存在的核酸必須通過加入一些燃料或者化學反應(yīng)而特異性或者非特異性地被標記或者修飾。本發(fā)明的核酸探針可包括在試劑盒中，該試劑盒可應(yīng)用于迅速確定感興趣的致病樣本存在與否。試劑盒包括對于確定靶標基因來說所有必須的成分。在通用概念中，試劑盒包括含有標記探針的穩(wěn)定劑，干燥形式或者液體形式的用于雜交耙標和探針多聚核苷酸的雜交液，用于洗滌并除去不需要和未結(jié)合的多聚核苷酸的溶液，用于檢測標記雙鏈的底物以及任選地用于檢測標記的儀器。本發(fā)明的一種特定實施方式包括利用三明治測定概念的試劑盒。該試劑盒包括用于從患者收集樣品的第一成分，包括刮擦裝置或者紙尖、用作容器的小瓶以及用于分散并溶解樣品的緩沖液。第二成分包括干燥或者液體形式的用于將靶標和探針多聚核苷酸雜交的培養(yǎng)基，以及用于洗滌以除去不需要和未結(jié)合多聚核苷酸的培養(yǎng)基。第三成分包括固相載體，未標記并與耙標多聚核苷酸的一部分互補的核酸探針結(jié)合于其上或者于其結(jié)合。在多靶標分析的情況下，一個以上的捕獲探針，每個捕獲探針對其自身的核糖體RNA專一，被應(yīng)用到量桿的不同離散區(qū)域。第四成分包括標記探針，其與來自與第三成分的固定和未標記核酸探針雜交的相同rRNA帶的不同區(qū)域互補。在本文中描述的探針成分包括干燥形式諸如凍干的核苷酸或者沉淀形式諸如酒精沉淀的核酸或者緩沖液中沉淀的探針組合。標記可以是上述任何一種標記。例如，探針可以使用常規(guī)方法生物素化，并且生物素化探針的存在可通過加入抗生物素蛋白結(jié)合的酶諸如辣根過氧化物酶，然后提供可視覺監(jiān)測或者通過比色計或者分光光度計檢測的過氧化物酶的底物來檢測。與放射性標記方法相比，這種標記方法和其它酶結(jié)合的標記具有經(jīng)濟、高度靈敏以及相對安全的優(yōu)點。配全了成分的試劑盒包括各種用于通過標記探針進行檢測的試劑，操作說明，用于將陽性和陰性對照混合并反應(yīng)的容器等。DNA芯片本發(fā)明的探針還在DNA芯片中使用。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了核酸探針固定在其固相載體上的DNA芯片。安裝有高密度各種核苷酸片段的狹窄載體的DNA芯片被應(yīng)用，通過將從未知樣品中提取的未知DNA與固定在其上的DNA來識別DNA信息。用于保持探針寡聚核苷酸的固相載體的例子包括無機材料諸如玻璃和硅、以及聚合材料諸如丙烯、聚乙烯對苯二酸鹽(PET)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。固相載體的表面可以是平坦或高度多孔的。探針通過與基板上的3'-端或者5'-端共價結(jié)合而固定。固定可通過常規(guī)技術(shù)來實現(xiàn)，例如使用靜電力、固定與醛包被的載玻片上的低聚體連接的胺、或者在胺包被的載玻片、賴氨酸包被的載玻片或者硝酸纖維包被的載玻片上點樣。在本發(fā)明的一個實施例中，具有氨基的堿基在其合成過程中結(jié)合到探針的3'位置上，使其很容易共價結(jié)合到醛包被的載玻片上。各種探針固定和設(shè)置到載玻片基板上通過針微陣列(pinmicroarray)、噴墨、光刻、電陣列等來進行。在本發(fā)明的實施方式中，探針獨立地溶解在緩沖液中，得到的溶液通過使用由已知方法制備的微陣列儀(Yoon等人，/M/c油'o/為^c/mo/"10(1),21-26,2000)在基板上點樣。微陣列的原理在于精密構(gòu)建的針選取來自容器的探針DNA并輸送到由計算機指定的一個位點。為了通過微陣列固定被輸送的探針，在45%到65%優(yōu)選50%到55%的潮濕條件下固定反應(yīng)至少進行1小時，并將其靜置至少6小時以誘導探針3，端氨基與包被在載玻片上的醛基之間的反應(yīng)。為了檢測來自活的有機體的細胞或者活的有機體本身，細胞有時候需要部分或者全部通過化學和/或機械方法裂解，以便容易獲得它們的RNA和/或DNA，然后將它們與本發(fā)明的一個或多個探針接觸。接觸可在合適的載體諸如溶液中的硝酸纖維、纖維或者尼龍濾紙上進行或者在液體培養(yǎng)基上進行，這可在亞最佳、最佳或者限制條件下進行。所述條件包括溫度、反應(yīng)物的濃度，降低核酸配對的最佳溫度的物質(zhì)的存在(例如甲酰氨、二甲基亞砜和尿素)，以及明顯降低反應(yīng)體積和/或加速雜交形成的物質(zhì)的存在(例如硫酸葡聚糖、聚乙二醇或者苯酚)。探針制備傳統(tǒng)的菌落方法可通過所需序列的基因操作產(chǎn)生大量的核酸探針，如Maniatis,r.等人在.MolecularCloning中的描述.'J丄a6orafo/^J/l/awwa/，ColdSpringHarbor,NewYork,1982，或者使用可從市場上購買的DNA合成儀化學合成。本發(fā)明的探針可通過常規(guī)方法制成單鏈或者雙鏈。制備單鏈探針的代表性例子是在二對甲氧基三苯甲基(DMT)方法之后通過自動DNA合成儀和脫模保護合成包括在的所需核苷酸數(shù)的探針。在合成時，探針的一個末端用熒光染料(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC)標記以確信感興趣的核酸是否存在。作為替代，與單鏈DNA模板互補的DNA探針通過將引物與其模板DNA退火并使用已知的Klenow酶和熒光標記的dNTP聚合來制備。由于熒光染料，探針因而顯示了高度的靈敏性和特異性。為了制備雙鏈探針，基因組DNA或者質(zhì)粒DNA用特異性限制酶消化以得到包括所需基因區(qū)域或者核苷酸片斷的探針。隨機引物延伸方法是一種通過六個隨機六聚物聚合具有各種長度的熒光標記探針的方式。作為替代，探針可通過使用T4核苷酸聚合酶將32P與DNA的5'-端連接來合成，并且還可通過在雙鏈DNA分子中以DNaseI產(chǎn)生缺刻，以DNA聚合酶I和熒光標記的dNTP聚合DNA來生產(chǎn)。合成的雙鏈探針變形使其變成單鏈，然后用于雜交。本發(fā)明的探針可有利地被標記。任何常用標記都可被利用。探針可通過放射性示蹤劑諸如32P、35S、125I、3H和"C標記。放射性標記可根據(jù)任何常規(guī)方法進行，諸如在3'或者5'端使用放射性標記的核苷酸、核苷酸聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶或者連接酶進行末端標記。用于放射性標記的另一種方法是在探針上連接有數(shù)個1251的本發(fā)明的探針的化學碘化作用。如果本發(fā)明的探針之一是放射性的，電離輻射的檢測一般通過自動射線照相術(shù)、液體閃爍、Y計數(shù)或者任何其它常規(guī)方法進行。本發(fā)明的探針可通過非放射性殘基特征來標記免疫學性質(zhì)(例如抗原或者半抗原)；對于一些試劑的特異性親和(例如配體)；通過酶反應(yīng)的可檢測性質(zhì)(例如酶、輔酶、酶底物或者參與酶反應(yīng)的中間物)；以及物理性質(zhì)包括熒光、某些波長的光發(fā)射或吸收?？贵w可被用于特異性檢測探針和靶標的雜交。當本發(fā)明的探針是化學合成的時，非放射性標記可被提供。腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷和尿苷很容易與其它化學殘基連接，使得可對探針或者探針的雜交以及它們的互補DNA或者RNA片段進行檢測。靶標核酸從樣品中提取以提供用于診斷生物學樣品的疾病的核酸底物。核酸可使用標準技術(shù)或者從市場上購買的試劑盒從各種臨床樣品中提取。例如，用于從組織樣品中分離RNA或者DNA的試劑盒可購自Qiagen,公司(Chatsworth,CA,USA)和Stratagene(LaJolla,CA,USA)。例如，QIAamp血液提取試劑盒可從血液、骨膜、體液或者細胞懸液中分離DNA。QIAamp組織提取試劑盒可從組織諸如肌肉和器官中提純DNA。如果是雙鏈，推薦將耙標DNA在進行檢測之前變性。雙鏈DNA的變性可通過化學、機械或者酶法加熱到8(TC以上的合適溫度來進行。與探針雜交的靶標DNA通常使用兩種方法制備。第一種方法為Southern雜交法，其中基因組DNA或者質(zhì)粒DNA以合適的限制酶消化，被消化的DNA片段使用瓊脂糖凝膠電泳分離并純化。第二種方法是通過PCR擴增所需DNA區(qū)域。PCR的例子包括使用等量的正向和反向引物的典型PCR;使用不同量的引物并產(chǎn)生雙鏈帶和單鏈帶的非對稱PCR;使用各種引物對并同時擴增不同區(qū)域的多重PCR;使用特定的4引物和連接酶通過ELISA(酶聯(lián)免疫測定，EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)并測定熒光的連接酶鏈反應(yīng)(LCR);此外，熱啟動PCR，巢式PCR，DOP-PCR(變性寡聚核苷酸引物PCR，DenaturatedoligonucleotideprimerPCR),RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR，ReverseTranscriptionPCR),半定量RT-PCR,實時PCR,RACE(cDNA末端的快速擴增，RapidAmplificationofcDNAEnds),競爭性PCR,STR(短串聯(lián)重復序列，ShortTandemR印eats)，SSCP(單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性，SingleStrandConformationPolymorphism,)，DDRT-PCR(差顯逆轉(zhuǎn)錄酶，DifferentialDisplayReverseTranscriptase)等等。在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，進行不對稱PCR以使用從樣品中提取的DNA作為模板聚合基因片段?；蚱瓮ㄟ^使用1:5比例的不同量正向和反向引物進行一次PCR反應(yīng)來聚合。在PCR的優(yōu)選實施例中，將5pi10XPCR緩沖液(IOOmMTris-HCl,pH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2),4pidNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP，dTTP,每種2.5mM),0.5jil10pmole正向引物，2.5pi10pmole反向引物，1^1/10稀釋的模板DNA(100ng)和0.5piTaq聚合酶(5單位/^d,TakaraShuzoCo.,Shiga,Japan)混合并將蒸餾水加入到混合物中直至50til。PCR通過下列步驟進行:首先在94'C下7min變性一次,在第二變性溫度94'C下1min并循環(huán)10次，52。C下退火1min并在72。C下延伸1min;在第三變性溫度94。C下1分鐘并循環(huán)30次，52。C下退火1min并在72"C下延伸1min;然后在72匸下僅進行5min最后的延伸.PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳來確認。雜交和洗滌特定雜交技術(shù)對本發(fā)明來說不是必須的。雜交技術(shù)一般在A^cWc外Z〃VfeaZ/o":爿尸rac"ca/^/roac/z,Ed.Hames,B.D.禾口Higgins，S.J.,IRLPress,1987;Gall和Pardue(1969),/Voc.iVa".」ca《Sc/.,t/U,63:378-383,以及John,Burasteil和Jones(1969)A^we,223:582-587中描述。雜交條件通過"嚴格"也就是說操作條件的嚴格來確定。條件越嚴格,探針和靶標的雜交越特異。嚴格尤其表明探針/靶標雙螺旋的堿基組成以及核酸之間的錯配程度。嚴格可同樣反映雜交反應(yīng)的功能參數(shù)，諸如在雜交液中存在的離子濃度和類型，變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。雜交條件的嚴格尤其依賴于使用的探針。有關(guān)條件的所有數(shù)據(jù)都是公知的，單個雜交的合適條件可通過常規(guī)實驗來建立。關(guān)于探針長度，雜交反應(yīng)溫度一般大約在以下范圍中，在大約2(TC和65°C，特別是在大約0.8M到1M的鹽溶液中在35X:和65。C之間。標記寡聚核苷酸探針和核酸靶標的核酸雜交可通過使用在美國專利US5,030,557中公開的"未標記輔助探針"來增強。輔助探針為與核酸的另一區(qū)域結(jié)合的寡聚核苷酸，該另一區(qū)域不是測定探針靶向的區(qū)域。添加的探針的幫助反應(yīng)加速了測定探針的結(jié)合，在單鏈核酸的耙向區(qū)域上形成新的第二和第三結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，影響探針/耙標雜交的熱穩(wěn)定性的因素也影響探針的特異性。因此，探針/靶標雜交的熔解方案包括熔解溫度(Tm)需要被確定。優(yōu)選的方法在美國專利US5,283,174中描述。探針/靶標雜交的Tm可通過如下雜交保護測定來確定。使用過量的靶標，探針/靶標雜交在含有十二垸基硫酸鋰的琥珀酸鋰緩沖液中形成。所"進行"的雜交的每等分在雜交緩沖液中被稀釋并在不同溫度下溫育5分鐘，一般從低于預期Tm(通常為55。C)之下增加2-5。C。溶液然后用弱堿性硼酸鹽緩沖液緩沖并在更低溫度下(例如50°C)溫育10分鐘。在這種條件下，在與單鏈探針連接的吖啶酯被水解的同時，與單鏈探針連接的吖啶酯被相對保護。這被稱為雜交保護測定(HPA)。化學發(fā)光殘余雜交量成比例，并在依次加入過氧化氫和堿之后在光度計中被測定。數(shù)據(jù)以最大信號(通常來自最低溫度)的百分比對溫度點樣。Tm由到達最大信號的50%的點來確定。作為替代，探針/靶標雜交的Tm也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的同位素法來確定。應(yīng)當注意，給定雜交的Tm可基于鹽、去垢劑和雜交液中存在的其它溶質(zhì)的濃度而變化，這些物質(zhì)影響熱變性過程中雜交的相對穩(wěn)定性(Mo/ecM/arC/oW打g:^丄a6omf。7Mmwfl/Sambrook等人編著，ColdSpringHarborLabPubl"9.51(第二版，1989))。雜交條件可通過多個參數(shù)來監(jiān)測，例如雜交溫度、介質(zhì)中成分的性質(zhì)和濃度以及對雜交進行洗滌的溫度。雜交和洗滌溫度通過與探針的核酸組成相應(yīng)的最大溫度、組成和長度來限定，用于在本文中描述的探針雜交或洗滌的最大溫度大約為3(TC到6(TC。在更高的溫度處，雙螺旋完成探針/靶標雜交的解偶聯(lián)和變性。優(yōu)選的雜交介質(zhì)包括大約3XSSC(IXSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0),大約25mMpH7.1的磷酸緩沖液，禾B20%去離子甲酰氨，0.02%Ficoll,0.02%牛血清蛋白，0.02%聚乙烯吡咯垸酮和大約0.1mg/ml剪切的變性沙門氏菌DNA。優(yōu)選的洗滌緩沖液包括大約3XSSC,25mMpH7.1的磷酸緩沖液和20%的去離子甲酰氨。但是，當修飾被引入探針或者介質(zhì)中時，適于進行雜交進行所要求的特異性的溫度應(yīng)當基于在下列參照文獻中的已知關(guān)系而變化B.D.HAMES禾BS.J.HIGGINS,(編著).A^c/e/c/zj^〃Vfea〃o".Jprac"ca/opproflfcA,IRLPress,Oxford,U.K.,1985。在該方面，還應(yīng)當注意，一般因為DNA:DNA雜交比RNA:DNA或者RNA:RNA雜交的穩(wěn)定性差，它們的雜交條件需要仔細調(diào)節(jié)以實現(xiàn)給予雜交性質(zhì)的專一檢測。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，擴增的基因靶標片段被加入到雜交緩沖液(6XSSPE(0.15MNaCl,5mMC6H5Na307,pH7.0),20%(v/v)甲酰氨)中，施加到保持探針的載玻片上，然后在3(TC下溫育6小時，使所述探針可與所述靶標互補雜交。載玻片用3XSSPE，2XSSPE和IXSSPE順序洗滌5分鐘。雜交可根據(jù)常規(guī)方法通過熒光化學或者放射性同位素標記靶標來定量。標記結(jié)合可通過在聚合和擴增過程中使用被標記引物或者被標記核苷酸來進行。實施例此后將通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明。但是，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，這些例子僅僅用于說明的目的而被給出，本發(fā)明的范圍并不被限制成這些例子或者由這些例子限定。實施例中的所有下列實驗由韓國Severance醫(yī)院的IRB(InstitutionalReviewBoard)許可并根據(jù)知情同意(Helsinki)聲明經(jīng)每個參與者事先同意而進行。實施例1:確定BIGH3蛋白的突變類型為了構(gòu)建用于測定BIGH3的基因突變的診斷探針，引起眼科疾病包括Avellino角膜營養(yǎng)不良的原因之一、其突變位點被確定以產(chǎn)生探針。BIGH3蛋白的突變位點被識別，通過基因庫和OMIM(OnlineMedelianInheritanceinMan)、NCBI核苷酸序歹!j數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformation)來保證它們的氨基酸和核苷酸序列，并且每種疾病的等位基因信息被理解。待檢查的突變類型被確定以測試DNA芯片的效力。尤其是在用于BIGH3基因突變的熱點中，引起Avellino營養(yǎng)不良、格子狀I(lǐng)型營養(yǎng)不良和雷-布二氏I的突變區(qū)域被選擇(表l)。表l.由BIGH3基因突變引起的眼科疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例2:通過PCR獲得檢索區(qū)為了檢索表1中顯示的所有突變，設(shè)計了包括外顯子4、外顯子11、外顯子12和外顯子14的5對引物。在這些引物中，兩對引物被用于擴增外顯子4的突變區(qū)。這兩對引物中的一對(引物1和引物2)被認為適于診斷DNA芯片的實驗，另一對被設(shè)計成用于直接DNA序列分析(引物3和引物4)。另外，DNA探針和它們待檢索的互補引物(反向引物)在它們的5'羥基上標記上熒光化學物質(zhì)。通過分別與引物2和引物4結(jié)合的Cy5和Cy3，那些引物對因此而有效地被區(qū)分。表2:用于擴增包括突變位點的基因區(qū)域的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例4:生產(chǎn)用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片實施例3中的每個選擇的探針被合成以應(yīng)用于DNA芯片。將單核苷酸(ProligoBiochemieGmbHHambmgCo.GE)以核苷酸順序和輸入模式注射到自動合成儀(ExpediteTM8卯0,PEBiosystemsCo.USA)中，并聚合成0.05pM的純核酸探針。得到的探針的合成通過電泳來確認。為了將DNA探針固定在固相載體上，氨基-醛基共價結(jié)合被使用。合成的寡聚核苷酸探針的3'-端使用氨基連接臂(Cruachem,Glasgow,Scotland)修飾成插入氨基殘基用于固定，并溶解在點樣緩沖液(3XSSC;0.45MNaCh15mMC6H5Na307，pH7.0)中。使用微陣列儀將得到的溶液在醛基包被的載玻片(CELAssociates,Inc.Huston,USA)上點樣，然后將玻片保持在超過55%的濕度條件下，允許氨基和醛基結(jié)合1小時以上，接著將DNA探針固定6小時。位置標記和每個探針分別以2-5and10-100^M的濃度被固定。為了評估固定的效率，將載玻片用SYBRO綠II(MolecularProbes,Inc.,Leiden,Netherlands)干燥。實施例5:使用用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片對其進行診斷為了確認探針的特異性和靈敏性，通過將實施例2中制備的PCR產(chǎn)物應(yīng)用到捕獲在實施例4中產(chǎn)生的探針的DNA芯片進行雜交。在與從患者或者正常個體的血液中提取的基因組DNA雜交之后，檢驗是否產(chǎn)生陽性雜交信號和與其它探針的交叉反應(yīng)性(特異性)。DNA芯片與水蒸氣水合然后浸泡在70。/。的乙醇中以除去沒有固定在DNA芯片的載玻片上的任何探針。將DNA芯片轉(zhuǎn)移到封閉液(1.3gNaBH4,375mlPBS,125ml100%乙醇)中并震蕩5分鐘以便防止熒光化合物與玻璃表面上的醛基連接，這種連接可能導致總熒光的增加并引起專一的陽性信號減弱。DNA芯片然后用0.2%SDS洗滌5分鐘，并用于無菌水接著洗滌2到3次，每次1分鐘。通過離心除去保留在DNA芯片的玻璃表面上的液體(l,OOOrpm，2分鐘)。將10-20u1非對稱PCR產(chǎn)物加入到雜交緩沖液[6XSSPE(0.9MNaCl,10mMNaH2P04-H20，1mMEDTA,pH7.4)或者20XSSPE(3MNaCl,0.2MNaH2P04-H20,0.02MEDTA,pH7.4)〗，20%(v/v)甲酰氨(SigmaCo.,St.LouisUSA)中至總量為200u1。將得到的混合物施加到探針固定于其上的載玻片上，并用探針夾壓封(probe-clippress-seal)的溫育室(SigmaCo.，St.Louis,MO)覆蓋。在3(TC搖動培養(yǎng)箱中持續(xù)進行4-6小時的雜交反應(yīng)，在雜交過程中通過在小室中設(shè)置濕的棉織物來防止玻璃周圍的環(huán)境空氣脫水以誘導互補結(jié)合。在雜交完成之后，相繼用3XSPE(0.45MNaCl,15mMC6HsNa307,pH7.0),2XSSPE(0.3MNaCl,10mMC6HsNa307,pH7.0)，然后用IXSSPE(0.15MNaCl,10mMC6HsNa307,pH7.0)洗滌玻片，每次5min。殘留在DNA芯片的玻璃表面上的液體通過離心除去(1000rpm2min)。通過DNA芯片掃描儀(基于CCD照相機的掃描儀，ArrayWoRx,AppliedPrecisionLLC,USA)對雜交進行檢測，暴光時間為0.2-0.5秒。在595nm處測定Cy3的熒光強度，在685nm處測定Cy5的熒光強度，并在530nm處測定FITC的熒光強度，測得的信號由ImaGene6.0軟件(BiodiscoveryInc.,USA)角牟釋。實施例6:基于點樣緩沖液的DNA芯片的檢測效率基于點樣緩沖液對DNA芯片的檢測效率進行評估，以便生產(chǎn)可選擇性檢測一個或兩個核苷酸點突變的高效DNA芯片，用于診斷角膜營養(yǎng)不良。以不同點樣溶液制造DNA芯片，但這些點樣溶液中都包含實施例4中產(chǎn)生的探針0.1M。在圖1中所示的4個區(qū)域中左側(cè)的2個區(qū)域上的探針用市售緩沖液(Telechem，USA)點樣，上左側(cè)的一個區(qū)域以3XSSC點樣，上右側(cè)的另一個區(qū)域用50MDMSO溶液點樣。黃色區(qū)域代表檢測正常個體的探針，粉紅色和淺青色區(qū)域分別表示檢測Aellino營養(yǎng)不良和雷-布二氏CD1的探針。圖2-圖5顯示了使用上述設(shè)計的DNA芯片和外顯子4PCR產(chǎn)物的雜交結(jié)果。Cy5(紅色)熒光代表通過施加以引物1和引物2擴增的PCR產(chǎn)物的結(jié)果，Cy3(綠色)代表引物3和引物4得到的結(jié)果。定位在右側(cè)的盒代表比較結(jié)果，諸如圖2中用于正常個體，圖3中用于雜合體Avdlino營養(yǎng)不良，圖4中用于純合體Avdlino營養(yǎng)不良和圖5中用于雜合體雷-布二氏CD1。如圖2-圖5所示，以3XSSC點樣產(chǎn)生最精確和清晰的信號，因此，在下列實施例中，所有雜交均以3XSSC進行。實施例7:基于探針濃度和雜交時間的DNA芯片效率檢測DNA芯片的檢測效率基于探針濃度和雜交時間被評估以便生產(chǎn)可選擇性檢測一個或兩個核苷酸點突變的高效DNA芯片，用于診斷角膜營養(yǎng)不良。DNA芯片通過將實施例4中以3XSSC生產(chǎn)的lO-lOOpM探針點樣來制造。如圖6所示，一個DNA芯片被制造成包括兩個區(qū)域。圖7顯示了基于患者的預期雜交結(jié)果。圖8顯示了使用上述DNA芯片和引物組基于雜交時間的雜交結(jié)果。紅點是以引物1和引物2擴增并以Cy5標記的PCR產(chǎn)物的雜交結(jié)果。雜交時間和施加的患者在每幅圖中列出。作為以引物1和引物2擴增的外顯子4區(qū)域的PCR產(chǎn)物的結(jié)果，用于雜交的最佳條件證明探針濃度為30-50pM的探針，雜交時間建議為2-6小時，更優(yōu)選4-6小時，最優(yōu)選6小時。實施例8:基于探針長度的DNA芯片檢測效率DNA芯片的檢測效率基于探針長度被評估，以便生產(chǎn)可選擇性檢測一個或兩個核苷酸點突變的高效DNA芯片，用于診斷Avellino角膜營養(yǎng)不良、雷-布二氏I角膜營養(yǎng)不良、格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良和顆粒狀角膜營養(yǎng)不良?；诒?中列舉的突變位點，基于引物11到引物15以及引物34和引物35的探針序列合成了不同探針長度諸如llmer、12mer、15mer和17mer。表4:用于確定最佳探針長度的探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>突變信號(M)與正常信號(W)的比值(M/W)由檢測正常序列的探針點信號(W)與檢測營養(yǎng)不良的探針的點信號(M)的比值來定義。并且該比值被優(yōu)化并解釋。如圖9所示，Avellino角膜營養(yǎng)不良通過13mer探針非常成功地被檢測，并且15mer探針也是非常有效的。雷-布二氏I角膜營養(yǎng)不良和格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良通過15mer探針最有效地被檢測。因此，用于Avdlino角膜營養(yǎng)不良、雷-布二氏I角膜營養(yǎng)不良和格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良的外顯子4的突變區(qū)域的檢測以15mer探針進行。在表4中，用于角膜營養(yǎng)不良的診斷DNA芯片的探針最佳長度通過粗體字強調(diào)。含有外顯子12中的點突變的顆粒狀角膜營養(yǎng)不良的檢測使用圖10中的DNA芯片(圖11)以17mer探針進行最有效。實施例9:用于診斷應(yīng)用的DNA芯片的雜交基于實施例6、實施例7和實施例8的結(jié)果，DNA芯片的檢測效率基于探針濃度和雜交時間被評估，以便生產(chǎn)可選擇性檢測一個或兩個核苷酸點突變的高效DNA芯片，用于診斷角膜營養(yǎng)不良。逐步地，以3XSSC點樣溶液和5015mer探針生產(chǎn)DNA芯片(圖12)。圖13顯示了基于患者的預期雜交結(jié)果。圖13顯示了使用上述生產(chǎn)的DNA芯片和以引物1和引物2擴增的患者的PCR產(chǎn)物的雜交結(jié)果。主題在每幅圖中列出。本發(fā)明的DNA芯片在診斷中應(yīng)用到患者確定了對于所有患者的精確診斷的可能性，并證明具有非常高的特異性以及靈敏性。通過雜交的結(jié)果，生產(chǎn)了DNA芯片，其被應(yīng)用于診斷眼科疾病，以15mer探針檢測Avdlino角膜營養(yǎng)不良、雷-布二氏I角膜營養(yǎng)不良和格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良，以17mer探針檢測顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。發(fā)現(xiàn)3XSSC中30-50pM探針被點樣并在3(TC下雜交6小時的過程產(chǎn)生了最佳診斷結(jié)果。并且該結(jié)果顯示雜交可以比與探針長度對應(yīng)的Tm高15-2(TC的溫度下進行的事實。因此，本發(fā)明的DNA芯片可通過控制由固定在芯片上的探針長度確定的雜交溫度來處理，并用于角膜營養(yǎng)不良的診斷包括由BIGH3突變引起的Avdlino角膜營養(yǎng)不良。使用上述生產(chǎn)的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的優(yōu)化DNA芯片，來自98位患者的血樣被檢測以診斷角膜營養(yǎng)不良。結(jié)果，如表5所示，27位患者被證明是正常的，10位患者為純合體Avellino角膜營養(yǎng)不良，57位患者為雜合體Avellino角膜營養(yǎng)不良，1位患者為雜合體格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良，l位患者為雜合體雷-布二氏I型角膜營養(yǎng)不良，以及2位患者為顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。表5:臨床樣品診斷結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>所述診斷結(jié)果通過臨床樣品的DNA序列分析來確認，證明其準確率為100%。工業(yè)實用性如上面詳細描述的那樣，本發(fā)明具有提供寡聚核苷酸的效果，該寡聚核苷酸包括引起角膜營養(yǎng)不良的BIGH3基因的突變區(qū)域，本發(fā)明具有提供診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片的效果，該DNA芯片具有固定在其上的寡聚核苷酸。根據(jù)本發(fā)明角膜營養(yǎng)不良的常規(guī)顯微診斷可被精確地遺傳學方法代替，通過視力矯正外科手術(shù)防止了在錯誤診斷之后患有角膜營養(yǎng)不良的患者喪失視力。雖然已經(jīng)參照特定特征對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，本說明書僅僅用于優(yōu)選實施方式而不是用于限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實際范圍由權(quán)利要求書及其等同物來限定。權(quán)利要求1.一種用于診斷角膜營養(yǎng)不良的寡聚核苷酸，其基本含有選自下組的一個或多個核苷酸序列，包括序列號:17，序列號:19，序列號:21，序列號:23，序列號:25，序列號:27，序列號:28，序列號:29，序列號:30，序列號:31，序列號:33，序列號:35，序列號:37，序列號:40，序列號:42，序列號:44，序列號:46，序列號:50，序列號:53和序列號:59。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號50的所述寡聚核苷酸在序列號12中闡明。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號53的所述寡聚核苷酸在序列號13中闡明。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號59的所述寡聚核苷酸在序列號15中闡明。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號35的所述寡聚核苷酸在序列號65中闡明。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸，其特征在于，寡聚核苷酸長度為13bp到17bp。7、一種用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，在DNA芯片的基板上固定有權(quán)利要求1到6中任一項所述的寡聚核苷酸。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，另外在其上固定基本含有選自下組的一種或多種核苷酸序列的寡聚核苷酸，包括序列號16，序列號18,序列號20,序列號22,序列號24,序列號26,序列號32,序列號34,序列號36,序列號38,序列號39,序列號41,序列號43,序列號45,序列號47和序列號:56。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號:47的所述寡聚核苷酸在序列號:11中闡明。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列號56的所述寡聚核苷酸在序列號:14中闡明。11、根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，所述寡聚核苷酸基本含有核苷酸序列序列號34的所述寡聚核苷酸在序列號62中闡明。12、根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，DNA芯片固定有所有寡聚核苷酸，寡聚核苷酸基本含有由下組構(gòu)成的核苷酸序列序列號16至序列號:47，序列號50，序列號53,序列號56和序列號59。13、一種用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其特征在于，其上固定有所有寡聚核苷酸，寡聚核苷酸包括由下組構(gòu)成的核苷酸序列序列號ll至序列號:15,序列號62和序列號65。14、一對選自下組的引物，包括序列號l和序列號2;序列號3和序列號4;序列號5和序列號6;序列號7和序列號8;以及序列號9和序列號10。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于角膜營養(yǎng)不良診斷的寡聚核苷酸。具體地，本發(fā)明涉及一種檢測用于角膜營養(yǎng)不良診斷的BIGH3基因突變的寡聚核苷酸，所述角膜營養(yǎng)不良包括必須在視力矯正外科手術(shù)之前進行精確診斷的Avelllino角膜營養(yǎng)不良，本發(fā)明還涉及一種用于診斷角膜營養(yǎng)不良的DNA芯片，其具有固定于其上的寡聚核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，角膜營養(yǎng)不良的常規(guī)顯微診斷可被精確的遺傳學方法代替，通過視力矯正外科手術(shù)防止了在錯誤診斷之后患有角膜營養(yǎng)不良的患者喪失視力。文檔編號C12Q1/68GK101374850SQ200780003274公開日2009年2月25日申請日期2007年1月18日優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日發(fā)明者劉昭永,李相燁,柳元敏,柳來春,琴基昌,金應(yīng)權(quán)申請人:株式會社美迪基尼斯