專利名稱:用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良(Avellino corneal dystrophy)的實時PCR引物對和探針，更特別地涉及這種用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR 引物對和探針，其能夠準(zhǔn)確地診斷BIGH3基因外顯子4中是否存在突變，所述突變是阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的原因。
技術(shù)背景
角膜營養(yǎng)不良是常染色體顯性遺傳疾病，其開始在角膜中間具有模糊癥狀且逐漸蔓延，最終患者到老年時喪失視力。角膜營養(yǎng)不良包括阿維利諾角膜營養(yǎng)不良、顆粒狀角膜營養(yǎng)不良、格子狀I(lǐng)型角膜營養(yǎng)不良、里斯-布克樂斯(Reis-bucklers)角膜營養(yǎng)不良等， 且由編碼0IG-H3蛋白的基因突變引起。
患有阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的雜合子患者隨著年齡增長似乎出現(xiàn)嚴(yán)重的視力喪失，而純合子患者從6歲開始似乎完全喪失視力。阿維利諾角膜營養(yǎng)不良是 1988年新命名的疾病，從通常稱為顆粒狀角膜營養(yǎng)不良中劃分出來，因為發(fā)現(xiàn)它具有分離的癥狀和遺傳基礎(chǔ)。同樣地，已知它是世界范圍內(nèi)最常見的角膜營養(yǎng)不良，基于遺傳分析的韓國1/340至1/1000的患病率(雜合子的情況)表明它是常見的營養(yǎng)不良(Holland, E.J.等，Ophthalmology，1992; Kennedy, S. Μ.等，Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, Α. Μ.等，Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A.等，Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S.Hum. Mutat., 14:126, 1999)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果患有雜合阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的患者進行準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)(LASIK)，兩年后，角膜的渾濁度開始明顯擴大且最終引起視力喪失(Jim，R. Μ.等，Opthalmologyf 111:463, 2004)。以前，進行眼科手術(shù)期望通過準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)或準(zhǔn)分子激光手術(shù)將使患有角膜營養(yǎng)不良的患者擺脫視力模糊。同樣地，即使在韓國，大約已進行30萬例準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)，其中基于1/1000的患有阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的雜合子患者的最低估計，假定有300人喪失視力。經(jīng)歷準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)的患者主要在其20歲及30歲進行生產(chǎn)活動。因此，他們的視力喪失導(dǎo)致嚴(yán)重的社會問題和經(jīng)濟問題。
此外，美國2000年批準(zhǔn)準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)后，已發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)的患有阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的非洲裔美國患者喪失視力，其推斷許多相似的病例可發(fā)生在世界各地。
因此，盡管為了通過準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)預(yù)防阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的進展，需要準(zhǔn)確地診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良，但僅通過角膜渾濁度的顯微觀察進行診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良，因此醫(yī)生經(jīng)常遺漏進行準(zhǔn)分子激光原位角膜磨削術(shù)的患者的潛在癥狀，其導(dǎo)致視力喪失。因此，快速并準(zhǔn)確地診斷角膜營養(yǎng)不良是迫切需要的。
已研發(fā)了用于檢測BIGH3基因突變的DNA芯片，所述突變是阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的原因(韓國專利早期公開號10-2007-0076532)。然而，使用所述DNA芯片診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良不利地需要幾個步驟，包括樣品中擴增DNA的步驟、使擴增的DNA與DNA芯片雜交的步驟、清洗雜交的DNA芯片的步驟和檢測陽性反應(yīng)的步驟。
因此，本發(fā)明人已進行大量努力以研發(fā)能夠更有效地診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的方法，結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)，如果使用具有序列號1-2核苷酸序列的引物及具有序列號13-14核苷酸序列的探針通過實時PCR方法診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良，可以比傳統(tǒng)方法更快速并準(zhǔn)確的方式診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于使用實時PCR方法提供用于更有效并準(zhǔn)確地診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的引物對和探針。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR引物對，其由選自由下列核苷酸序列組成的組的核苷酸序列表示序列號1-2、序列號3-4、序列號5-6、序列號7-8、序列號9-10、序列號11-12、序列號13-14、序列號15-16、序列號17-18、 序列號19-20、序列號21-22及序列號23-24。
本發(fā)明還提供了用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR探針，其由選自由序列號25-42組成的核苷酸序列表示。


圖1示出了設(shè)計實時PCR引物和探針獲得的結(jié)果。在圖1中，“A”示出了使用最佳引物和探針進行的實時PCR的結(jié)果，“B”和“C”示出了使用不同于“A”中的引物進行的實時PCR的結(jié)果。
圖2示出了為了檢測引起阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的基因突變，使用根據(jù)本發(fā)明的實時PCR引物進行的實時PCR的結(jié)果。
具體實施方式
一方面，本發(fā)明針對用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR引物對，其由選自由下列核苷酸序列組成的組的核苷酸序列表示序列號1-2、序列號3-4、序列號5-6、序列號7-8、序列號9-10、序列號11-12、序列號13-14、序列號15-16、序列號17-18、序列號 19-20、序列號21-22及序列號23-24。
阿維利諾角膜營養(yǎng)不良是由遺傳異常引起的疾病，其中BIGH3基因外顯子4中的序列CGC突變?yōu)镃AC從而使位于BIGH3蛋白殘基的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(RlMH)。
當(dāng)使用本發(fā)明的引物實施實時PCR方法時，可以比使用DNA芯片的傳統(tǒng)方法更快速并準(zhǔn)確的方式診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良。
在實時PCR方法中，很難確定溫度條件，因為應(yīng)在相同的溫度條件下進行使用引物和探針的實驗。特別是，如果只檢測一個似阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的突變位置，應(yīng)該在能夠使引物和探針結(jié)合的溫度條件下使用它們。同樣地，探針在一定狀態(tài)下在非常有限的溫度范圍1°C至3°C的溫度下能夠結(jié)合，在所述狀態(tài)下檢測正?；虻奶结樅蜋z測突變基因的探針只有一個核苷酸不同。[0018]由于這些條件，重要的是找到探針和引物能與目的基因結(jié)合的相同溫度。特別地， 重要的是設(shè)計突變探針和正常探針以使其溫度在有限范圍內(nèi)可盡量不同。換言之，引物和探針的溫度應(yīng)該相互一致，正向引物和反向引物的溫度條件應(yīng)該相互一致，且突變探針和正常探針之間的溫度差異應(yīng)能夠最大化。圖IA示出了使用精心設(shè)計的引物和探針的結(jié)果， 圖IB和ID示出了使用不同于圖IA的引物而使用與圖IA相同的探針的結(jié)果?？梢钥闯?， 引物和探針的設(shè)計對于讀數(shù)有顯著影響。
在本發(fā)明中，為了構(gòu)建使用實時PCR方法診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的最佳引物，設(shè)計了序列號1-2、序列號3-4、序列號5-6、序列號7-8、序列號9_10、序列號11-12、序列號13-14、序列號15-16、序列號17-18、序列號19-20、序列號21-22及序列號23-24引物對，且使用每組設(shè)計的引物對進行實時PCR。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用序列號1-2引物對示出了最佳結(jié)果。
另一方面，本發(fā)明針對用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR探針，其由選自序列號25-42組成的核苷酸序列表示。
在本發(fā)明中，為了構(gòu)建使用實時PCR方法診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的最佳探針，設(shè)計了序列號25-42的引物，且使用每組設(shè)計的引物進行實時PCR。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用探針序列號13-14示出了最佳結(jié)果。
實施例
在下文中，將參考實施例進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見是，這些實施例只是說明性目的，而不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。即，以下步驟只描述為說明性步驟且不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 構(gòu)建實時PCR引物和MGB探針
為了構(gòu)建能夠擴增包含BIGH3基因外顯子4突變區(qū)的引物，使用I^rimer Express 3.0 軟件(Applied Biosystems U. S. Α)設(shè)計了序列號1-2、序列號3-4、序列號5-6、序列號7-8、 序列號9-10、序列號11-12、序列號13-14、序列號15-16、序列號17-18、序列號19-20、序列號21-22及序列號23-24引物對。
ACD Fw 引物5，-TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA (序列號 1) ACD Re 引物5，-CCA TCT CAG GCC TCA GCT T (序列號 2) (60bp) AV Fw 引物5，-TGC AGC CCT ACC ACT CTC AA (序列號 3)
AV Re 引物5' -AGG CCT CGT TGC TAG G (序列號 4) (150bp) 實時 Fw 引物(Real Fw primer) 5' -TAG TCT CTT ATT CTA ATA GA (序列號 5) 實時 Re 引物(Real Re primer) 5' -GCT GCA GAC TCT GTG TTT AA (序列號 6) (860bp)
ACD Fw2 引物5' -CCA TCC CTC CTT CTG TCT TCT G (序列號 7) ACD Re2 引物5' -CGG GCC CCT CCA TCT C (序列號 8) (140bp) ACD Fw3 引物5' -CAG AGA AGG GAG GGT GTG GTT (序列號 9) ACD Re3 引物5' -GGG CGA AGA TGG TGA AGC T (序列號 10) (190bp) ACD Fw4 引物5’-TCC TCG TCC TCT CCA CCT GTA (序列號 11) ACD Re4 引物5' -AGC TGG CAA GGA GGC CC (序列號 12)ACD Fw5 引物5，-TTT GGG CTT TCC CAC ATG C (序列號 13)
ACD Re5 引物5' -GGC AGA CGG AGG TCA TCT CA (序列號 14)
ACD Fw6 引物5' -GTA GTA CCG TGC TCT CTG (序列號 15)
ACD Re6 引物5' -AGT TCC CCA TAA GAA TCC CCC (序列號 16)
ACD Fw7 引物5' -GGC TGG ACC CCC AGA GG (序列號 17)
ACD Re7 引物5' -ACC CCT CGG GGA AGT AAG G (序列號 18)
ACD Fw8 引物5’-AAC CTT TAC GAG ACC CTG GGA (序列號 19)
ACD Re8 引物5' -GAC TCC CAT CCA TCA TGC CC (序列號 20)
ACD Fw9 引物5'-AGT CGT TGG ATC CAC CAC CA (序列號 21)
ACD Re9 引物5' -GAC GTC ATT TCC TAC TGT TTC AGG (序列號 22)
ACD FwlO 引物5' -CCC CCC AGA AAC AGC CTG (序列號 23)
ACD RelO 引物5，-TTC TAA GGG GTT AAG GAG AAA GCT T (序列號 24)
為了檢測BIGH3基因外顯子4中的鳥嘌呤至腺嘌呤的突變，構(gòu)建了序列號25-42的探針。
用VIC標(biāo)記與無突變的正?；蚱谓Y(jié)合的探針，并用FAM標(biāo)記與具有突變的基因片段結(jié)合的探針，且小溝結(jié)合子(MGB)與探針結(jié)合以促進與互補基因片段的結(jié)合。
正常探針1 :VIC-CAC GGA CCGCAC GGA-NFQ (序列號 25) (15bp) 突變探針 1 :FAM-CAC GGA CCACAC GGA-NFQ (序列號 26)
正常探針 2 VIC-ACA CGG ACCGCA CG-NFQ (序列號 27) 突變探針 2 FAM-ACA CGG ACCACA CG-NFQ (序列號 28) (14bp) 正常探針 3 VIC-TAC ACG GAC CGC A-NFQ (序列號 29) 突變探針 3 FAM-TAC ACG GAC CAC A-NFQ (序列號 30) (13bp) 正常探針 4 VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG-NFQ (序列號 31) 突變探針 4 =FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG-NFQ (序列號 32) (18bp) 正常探針 5 VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG GAG-NFQ (序列號 33) 突變探針 5 =FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG GAG-NFQ (序列號 34) (21bp) 正常探針 6 VIC-GCT GTA CAC GGA CCGCAC GGA GAA-NFQ (序列號 35) 突變探針 6 =FAM-GCT GTA CAC GGA CCACAC GGA GAA-NFQ (序列號 36) 正常探針 7 VIC-ACC GCA CGG AGA AGC-NFQ (序列號 37) 突變探針 7 =FAM-ACC ACA CGG AGA AGC-NFQ (序列號 38) 正常探針 8 VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ (序列號 39) 突變探針 8 =FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ (序列號 40) 正常探針 8 =VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ (序列號 41) 突變探針 8 =FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ (序列號 42) ^MM 2 用實時PCRi會》^啦佳禾Ui若角fl莫營養(yǎng)不良
樣品取自試驗者的血液、毛根和口腔上皮細(xì)胞，并從樣品中分離DNA。使用部分修正的酚/氯仿抽提方法進行DNA的分離與純化(Miller, Sk等，Nucl. Acids Res. 16:1215， 1988)，并將分離的DNA溶解于適量的TE緩沖液中(IOmM Tris-Cl, ImM EDTA, pH7. 4)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定并用作PCR中的模板DNA。[0027]使用用于擴增含有突變區(qū)的片段的引物(序列號1-12)和實施例1中構(gòu)建的探針 (序列號13-24)進行PCR反應(yīng)。
制備含有10 pmol每種引物和5 pmol每種探針的25 μ 1樣品混合物并用于PCR
反應(yīng)中。
在以下條件下進行實時PCR反應(yīng)36個循環(huán)，每個循環(huán)包含95 °C下反應(yīng)10分鐘、92 °C下反應(yīng)15秒及60°C下反應(yīng)1分鐘，之后在60°C下反應(yīng)5分鐘。
每個循環(huán)后，測定熒光。將對VIC染料陽性的樣品診斷為具有正?；?，將對FAM 基因陽性的樣品診斷為具有突變基因。
結(jié)果，可以看出，使用引物對序列號1-2與探針序列號2546示出了最準(zhǔn)確及有效的結(jié)果(圖2)。
雖然已參考具體特征詳細(xì)描述本發(fā)明，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些描述只是優(yōu)選實施方案并不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的主要范圍將通過附屬權(quán)利要求
及其等價物確定。
工業(yè)應(yīng)用性
使用根據(jù)本發(fā)明的引物對和探針可以比使用DNA芯片或PCR的傳統(tǒng)方法更快速并準(zhǔn)確的模式診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良。
序列目錄自由正文附加電子文件。
7
權(quán)利要求
1.一種用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR引物對，其由選自由下列核苷酸序列組成的組的核苷酸序列表示序列號1-2、序列號3-4、序列號5-6、序列號7-8、序列號9-10、序列號11-12、序列號13-14、序列號15-16、序列號17-18、序列號19-20、序列號 21-22及序列號23-24。
2.一種用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR探針，其由選自由序列號25-42組成的組中的核苷酸序列表示。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR探針，其中所述實時PCR探針用VIC或FAM標(biāo)記。
專利摘要
本發(fā)明涉及用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR引物對和探針，更別地涉及這種用于診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的實時PCR引物對和探針，其能夠準(zhǔn)確地診斷BIGH3基因外顯子4中突變的存在或不存在，所述突變是阿維利諾角膜營養(yǎng)不良的原因。使用根據(jù)本發(fā)明的引物對和探針可以比使用DNA芯片或PCR的傳統(tǒng)方法更快速并準(zhǔn)確的模式診斷阿維利諾角膜營養(yǎng)不良。
文檔編號C12Q1/68GKCN102459593SQ200980159748
公開日2012年5月16日 申請日期2009年12月1日
發(fā)明者尹正國, 李津 申請人:阿維利諾株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan