專利名稱：：脂肪酶變體的制作方法脂肪酶變體發(fā)明領(lǐng)區(qū)本發(fā)明涉及脂肪酶變體。
背景技術(shù)：
：脂肪酶是有用的，例如，作為洗滌劑酶用于從衣物和其它紡織品去除脂質(zhì)或脂肪沾污，作為用于面包和其它烘焙產(chǎn)品的生面團的添加劑。因此，源自纟田毛嗜熱霉(77z^7wow;;ces/朋wgi"oms)(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉(7/wm/co/a/朋wg/"osa),EP258068和EP305216)的脂肪酶以商品名Lipolase(NovoNordiskA/S的產(chǎn)品)以洗滌劑用途出售。WO0060063描述了細毛嗜熱霉脂肪酶的變體，其在洗滌劑溶液中具有特別優(yōu)良的初次洗滌性能(first-washperformance),WO9704079、WO9707202和WO0032758也公開了細毛嗜熱霉脂肪酶的變體。在一些應(yīng)用中，感興趣的是將產(chǎn)生氣味的短鏈脂肪酸的形成降至最低。因此，已知的是含有脂肪酶的洗衣洗滌劑有時可能在以牛奶污染的織物上留下殘留的氣味(EP430315)。WO02062973公開了脂肪酶變體，其中通過附接(attaching)C末端延伸減少了氣味的產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在脂肪酶的某些區(qū)/位置引入突變，可改進脂肪酶的性質(zhì)或特征。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于洗滌劑具有改進性能的脂肪酶。例如，本發(fā)明通過在親本脂肪酶中鑒定的一個或多個區(qū)中引入突變而獲得的產(chǎn)生氣味的傾向降低的變體。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供脂肪酶變體，與親本脂肪酶相比，其產(chǎn)生氣味的可能降低而無C末端延伸的附接。在另外的方面中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明脂肪酶變體的DNA序列，攜帶所述DNA序列的表達載體和包含DNA序列或表達載體的轉(zhuǎn)化宿主細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明脂肪酶變體的方法。附圖簡述圖1顯示脂肪酶的比對。序列列表SEQIDNO:1顯示編碼來自細毛嗜熱霉的脂肪酶的DNA序列。SEQIDNO:2顯示來自細毛嗜熱霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:3顯示來自曲柄犁頭霉(^&W。reyfera)的脂肪酶的tt酸序列。SEQIDNO:4顯示來自傘狀犁頭霉(^&誠acwywZ^/era)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:5顯示來自曼赫根毛霉(i/^wwcor/mWzez')的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:6顯示來自米根霉(i/^o;mswyzae)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:7顯示來自黑曲霉(Aperg/〃^m'ger)的脂肪酶的氨基S^f列。SEQIDNO:8顯示來自塔賓曲霉(^/^^7/^m6/gera/"的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:9顯示來自尖鐮孢(Fwan'wmojg^oram)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:10顯示來自異孢鐮孢(FwraWww/2efemy/0rwm)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:11顯示來自米曲霉(A;^g,7^oo^a)的脂肪酶的"i^酸序列。SEQIDNO:12顯示來自沙門柏干酪青霉(尸ew'c/"wwcawem6e^z〕的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:13顯示來自臭曲霉(^pe/^7/^/o幼'^s)的脂肪酶的^JJ^列。SEQIDNO:14顯示來自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:15顯示來自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQIDNO:16顯示來自pe"/sa_pora的脂肪酶的氨基酸序歹寸發(fā)明詳述親本脂肪酶可以使用任何合適的親本脂肪酶。在優(yōu)選實施方案中，親本脂肪酶可以是真菌脂肪酶。在另一個優(yōu)選實施方案中，親本脂肪酶可以與SEQIDNO:2中所示的細毛嗜熱霉的序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90°/o、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的同源性，所述同源性如"同源性和比對"部分所定義。親本脂肪酶可以是酵母多肽，例如念珠菌屬(Ow力Vfe)、克魯維酵母屬(《/w;/veram_yc&s)、畢赤酵母屬(尸/c/zz'a)、酵母屬(Sacc/zaramyce力、裂殖酵母屬(5"c/2z'zo^cc/wraw7C^y)或西洋蓍霉屬(K37row/a)多肽；或更優(yōu)選是絲狀真菌多肽，例如枝頂孢霉屬G4crewo"/wm)、曲霉屬(J^e/^7/us)、短梗霉屬(y4weoZos/Wwm)、隱J求菌屬(O3^toc0ccw》、F//o6oszWw、鐮孑包屬(Fws"n.ww)、腐質(zhì)霉屬(7/ww/co/a)、梨孢菌屬(Ma^2o;x^/2e)、毛霉屬(Mwcw)、毀絲霉屬(My"http://op/^/2ora)、新考瑪脂霉屬C/Veoca〃/ma"/x)、脈孢菌屬(A^"raspora)、擬青霉屬CPaecz7om_ycay)、青霉屬(尸em.c/〃/wm)、瘤胃壺菌屬(Pz'rawyces)、裂#習菌屬CSW^op/^/ww)、踝節(jié)菌屬(ra/araw;;c&s)、嗜熱子嚢菌屬(77^rwoaycM力、梭孢殼屬(77zz'e/av/a)、彎頸霉屬(ro/j^oc/a(i/Mm)或木霉屬(7Hc/20(iew2a)多肽。在優(yōu)選的方面,親本月旨肪酶是卡爾酵母OSaccAflram7cascar/s6e/^e""》、酉良酒酵母(Sacc/zaram7c"cerev&fae)、沖唐4b酵母(5bcc/zarcw7;/c&5(i/asto/icws)、道格拉氏酵母(Sacc/zaramycaycfowg7as")、克魯弗酵母(5^cc/wramycay&/M_yven')、諾地酵母(Sacc/zara，ceswo^)e"^)或卵形酵母(iSacc/wramyce頻ybrw/力多肽。在另一個優(yōu)選的方面，親本脂肪酶是棘孢曲霉0^pw^7/wacw/ea^s)、泡盛曲霉(^s/erg77/wsmvamon')、煙曲霉(^sperg/〃ws/wwz'ga^y)、臭曲霉、日本曲霉0^perg7'〃ws乂apoWcws)、斗勾巢曲霉(^^perg77/wsw/c/w/a""、黑曲霉、米曲霉、;荅賓曲霉、才干孑包狀鐮孑包(Fwsan'wm6flc/nW/o/(ie力、禾谷鐮孑包(Fwsar/wwcereafe)、庫威鐮孑包(Fz^ar/wwc尸o。;bi^〃em^)、大刀鐮孑包(Fz^an'w附cw/worww)、禾本牙牛鐮孑包(FwsaWwmgnam/"earam)、禾赤鐮孑包(Fwsan'wwg/"ww'wwm)、異孑包鐮孑包、合7欠木鐮孢(F"5w/w附"egM"c//)、尖鐮孢、多枝鐮孑包(Fws(3n.w附re"cw/afww)、4分紅鐮孑包(Fwan'i/mraseww)、才妄骨木鐮孑包(尸us"n'wmsam6wc/"ww)、月夫色鐮孑包(Fwsan'wwsarcoc/zroww)、4以分4支孑包鐮孑包(FwsaWw附5/oro^"/c/2/o/cfes)、石危色鐮孑包(i^wsar/ww^///mrewm)、圓鐮孑包(Fwsar/wmtor"/ost/m)、4以絲孑包鐮孑包(Fws"WwwWc/zof/zecz'oz.fifes)、鑲片鐮孑包(Fwran'wwve"ew^ww)、特異腐質(zhì)霉(7i/wmz,co/a/rao/era)、細毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)、米赫毛霉(Mwcww/e/^')、p耆熱l^絲霉(腳ce/fo//zf/7oraAermcp/n7a)、斗24造月永孑包菌(A^wras/oracrawsa)、產(chǎn)紫青霉(Pem'"'〃/畫j9W7wragew騰)、哈茨木霉(7Hc/20cferma/zarzz'a"ww)、康于木霉(7Hc/zofifenwaAomVg")、長枝木霉(7Hc/w(ier附a/o"g/Zrac/z/aw附)、里氏木在另一個優(yōu)選方面，親本脂肪酶是嗜熱霉屬脂肪酶。在更優(yōu)選的方面，親本脂肪酶是細毛嗜熱霉脂肪酶。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，親本脂肪酶是SEQIDNO:2的脂肪酶。變體脂肪酶與親本脂肪酶相比，本發(fā)明的脂肪酶變體包含選自下組的至少三個取代a)I區(qū)中的至少兩個取代，和b)II區(qū)中的至少一個取代，和c)III區(qū)中的至少一個取代，和d)IV區(qū)中的至少一個取代；且其中，變體具有脂肪酶活性。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶是嗜熱霉屬脂肪酶的變體，更優(yōu)選地，細毛嗜熱霉脂肪酶的變體，甚至更優(yōu)選地，SEQIDNO:2中所示的細毛嗜熱霉脂肪酶的變體。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與SEQIDNO:2具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。變體脂肪酶可以是由從下述親本生物之一衍生/獲得的基因編碼的親本脂肪酶的變體念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬，枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球菌屬、FZ/oZ^w'^mw,鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、^c孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、瘤胃壺菌屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與親本脂肪酶具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96。/。、97%、98%或99%的同一性，所述親本脂肪酶由從下述親本生物之一衍生/獲得的基因編碼念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬，枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球菌屬、F//okwWww、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、瘤胃壺菌屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬。在優(yōu)選的方面，變體脂肪酶是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母的變體。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與親本脂肪酶具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，所述親本脂肪酶由從下述親本生物之一衍生/獲得的基因編碼卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母。變體脂肪酶可以是由從下述親本生物之一衍生/獲得的基因編碼的親本脂肪酶的變體棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、塔賓曲霉、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、^琉色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、細毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與親本脂肪酶具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，所述親本脂肪酶由從下述親本生物之一衍生/獲得的基因編碼棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、塔賓曲霉、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮"包、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、細毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉。在另一個優(yōu)選方面，變體是嗜熱霉屬脂肪酶的變體。在更優(yōu)選的方面，親本脂肪酶是細毛嗜熱霉脂肪酶。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，親本脂肪酶是SEQIDNO:2的脂肪酶。區(qū)和取代的鑒定下面I區(qū)至IV區(qū)中所提及的位置是SEQIDNO:2中氨基酸殘基的位置。為了在不同的脂肪酶中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的(或同源的)位置，使用"同源性與比對，，中所述的過程。I區(qū)中的取代I區(qū)由N末端殘基E1附近的氨基酸殘基組成。在這個區(qū)中，優(yōu)選用帶更多正電的(morepositive)氨基酸取代親本脂肪酶的氨基酸。脂肪酶變體可以在I區(qū)中包含至少兩個取代，比如在I區(qū)中的三個、四個、五個或六個取^。I區(qū)中包含對應(yīng)于下述位置的氨基酸殘基1,2至11和223-239。下述位置是特別感興趣的1、4、8、11、223、227、229、231、233、234、236。具體而言，已經(jīng)鑒定了以下取代X1N"X4V、X227G、X231R和X233R。在優(yōu)選的實施方案中，變體脂肪酶與SEQIDNO.'2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97°/o、98%、99%同一性。在最優(yōu)選的實施方案中，變體脂肪酶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的脂肪酶的變體。II區(qū)中的取代II區(qū)由在?；湹囊粋?cè)和醇部分的一側(cè)與底物4妄觸的氨基酸殘基組成。在這個區(qū)中，優(yōu)選用帶更多正電的氨基酸或用疏水性較小的氨基酸來取代親本脂肪酶的氨基酸。脂肪酶變體可以在II區(qū)中包含至少一個取代，比如在II區(qū)中的兩個、三個、四個、五個或六個取代。II區(qū)中包含對應(yīng)于下述位置的氨基酸殘基202至211和249至269。下述位置是特別感興趣的202、210、211、253、254、255、256。具體而言，已經(jīng)鑒定了以下取代X202G、X210K/W/A、X255Y/V/A和X256K/R和X259G層Q/V。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與SEQIDNO:2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在最優(yōu)選的實施方案中，變體脂肪酶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的脂肪酶的變體。III區(qū)中的取代III區(qū)由形成柔性結(jié)構(gòu)(flexiblestructure)的氨基酸組成，因此允許底物進入活性部位。在這個區(qū)中，優(yōu)選用帶更多正電的氨基酸或疏水性較小的氨基酸取代親本脂肪酶的氨基酸。脂肪酶變體可以在III區(qū)中包含至少一個取代，比如在III區(qū)中的兩個、三個、四個、五個或六個取代。III區(qū)中包含對應(yīng)于下述位置的氨基酸殘基82至102。下述位置是特別感興趣的83、86、87、90、91、95、96、99。具體而言，已經(jīng)鑒定了以下取代X83T、X86V和X90A/R。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與SEQIDNO:2具有至少80°/。、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在最優(yōu)選的實施方案中，變體脂肪酶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的脂肪酶的變體。IV區(qū)中的取代IV區(qū)由與表面以靜電結(jié)合的氨基酸殘基組成。在這個區(qū)中，優(yōu)選用帶更多正電的氨基酸取代親本脂肪酶的氨基酸。脂肪酶變體可以在IV區(qū)中包含至少一個取^K，比如在IV區(qū)中的兩個、三個、四個、五個或六個取K。IV區(qū)中包含對應(yīng)于下述位置的氨基酸殘基27和54至62。下述^f立置是特別感興趣的27、56、57、58、60。具體而言，已經(jīng)鑒定了以下取代X27R、X58N/AG/T/P和X60V/S/G/N/R/K/A/L。在優(yōu)選實施方案中，變體脂肪酶與SEQIDNO:2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在最優(yōu)選的實施方案中，變體脂肪酶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的脂肪酶的變體。其它位置的氨基酸親本脂肪酶可以任選地包含其它變化，例如，其它氨基酸的取代，特別是與親本脂肪酶相比，小于10個，小于9個，小于8個，小于7個，小于6個，小于5個變化。實例是對應(yīng)于親本脂肪酶下述位置中一個或多個位置的取代24、37、38、46、74、81、83、115、127、131、137、143、147、150、199、200、203、206、211、263、264、265、267和269。在特定實施方案中，在對應(yīng)于位置81、147、150、227和249的至少一個位置有取代。在優(yōu)選實施方案中，至少一個取代選自下組X38R、X81Q/E、X143S/C/N/D/A、X147M/Y、X150G/K、X227G和X249R/I/L。變體可包含在定義的I至IV區(qū)之外取代；定義的I至IV區(qū)之外的取代數(shù)目優(yōu)選小于六個，比如五個、四個、三個、兩個或一個取代。其它取代可以，例如，根據(jù)本領(lǐng)域已知的原則產(chǎn)生，例如WO92/05249、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所述取。親本脂肪酶變體親本脂肪酶包括具有下面的表1列出的取代的親本脂肪酶(使用SEQIDNO:2編號)。____<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1:在更特定的實施方案中，親本脂肪酶與SEQIDNO:2相同，而表1的變體因此是<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2:SEQIDNO:2的一些特定變體氨基酸修飾的命名法為了易于參考，在描述本發(fā)明的脂肪酶變體時，采用以下命名法原始氨基酸位置取代氨基酸根據(jù)這種命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示為G195E。在相同的位置缺失甘氨酸表示為G195*，而插入額外的氨基酸殘基例如賴氨酸表示為G195GK。與其它脂肪酶相比，當特定脂肪酶含有"缺失"并且在該位置進行插入的情況，就在位置36插入天冬氨酸而言，將這種情況表示為436D。用加號分隔多個突變，即R170Y+G195E，分別表示在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。當應(yīng)用所述排列方法時，X231表示在親本多肽中對應(yīng)于位置231的氨基酸。X231R表示用R置換所述氨基酸。就SEQIDNO:2而言，X是T，因此T231R表示用R取代位置231的T。當某個位置(例如231)中的氨基酸可以由選自一組氨基酸的另一個氨基酸取代的情況，例如由R和P和Y組成的組，將這種情況表示為X231R/P/Y。在所有的情況下，采用公認的IUPAC單字母或三字母的氨基酸縮寫。氨基酸分組在本說明中，根據(jù)氨基酸在pH10的電荷，將它們分成帶負電的、帶正電的或電中性的。因此，帶負電的(negative)氨基酸是E、D、C(半胱氨酸)和Y，特別是E和D。帶正電的(positive)氨基酸是R、K和H，特別是R和K。電中性(neutral)氨基酸是G、A、V、L、I、P、F、W、S、T、M、N、Q和形成二硫橋的部分時的C。用同一組(帶負電、帶正電或電中性)中的另一個氨基酸取代稱為保守取代?？梢詫㈦娭行园被岱殖墒杷蚍菢O性(G、A、V、L、I、P、F、W和作為二硫橋的部分的C)和親水或極性(S、T、M、N、Q)。氨基酸同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，通過使用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來測定兩個氨基酸序列之間的比對。Needle程序執(zhí)行總體比對算法，其在Needleman，S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述。使用的取代矩陣是BLOSUM62，缺口開啟罰分(gapopeningpenalty)是10,并且缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列"；例如SEQIDNO:2的氨基酸1至269)和不同氨基酸序列("外源序列，，)之間的同一性程度如下計算用兩個序列比對中完全匹配的數(shù)目除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列，，的長度中最短的一個。將結(jié)果表示為百分比同一性。當"發(fā)明序列，，和"外源序列"在重疊的相同位置中具有同一氨基酸殘基時，發(fā)生完全匹配。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO:2的長度是269)?？梢允褂蒙鲜龇椒ㄓ嬎阃恍院屯葱裕⒂糜诒葘ΑＴ诒景l(fā)明的上下文中，同源性和比對如下所述計算。同源性和比對就本發(fā)明而言，可以通過本領(lǐng)域已知的計算^/L程序的方法適當?shù)販y定同源性的程度，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1994，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.andWunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology,48，443-45),按照用于多肽序列比較的以下設(shè)定來使用GAP:GAP產(chǎn)生罰分(GAPcreationpenalty)為3.0,和GAP延伸罰分(GAPextensionpenalty)為0.1。在本發(fā)明中，通過圖1所示的比對確定曲柄犁頭霉、傘狀犁頭霉(^mWacoow6e/era)、曼赫根毛霉、德氏根霉、黑曲霉、塔賓曲霉、尖鐮孢、異孢鐮孢、米曲霉、沙門柏干酪青霉、臭曲霉、黑曲霉、細毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)和丄朋cfeW^pemia/jora的脂肪酶序列中相應(yīng)(或同源)的位置。為了發(fā)現(xiàn)所述比對中未顯示的脂肪酶序列中的同源位置，將感興趣的序列與圖1中顯示的序列進行比對。通過使用GAP將新序列與GAP程序發(fā)現(xiàn)的最同源的序列進行比對，來將新序列排入圖1中的現(xiàn)有比對。GAP在GCG程序包(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1994，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.and^Vunsch,C.D.,(1970),JournalofMolecularBiology,48,443-45)中提供。使用以下設(shè)置用于多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分為3.0,GAP延伸罰分為0.1。雜交本發(fā)明還涉及具有脂肪酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴緊性條件下，優(yōu)選低嚴緊性條件下，更優(yōu)選中嚴緊性條件下，更優(yōu)選中-高嚴緊性條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊性條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊性條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸178至660，(ii)SEQIDNO:1的核苷酸178至660中包含的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈(J.Sambrook，E.RFritsch，andT.Maniatus,1989，Mo/ecw/a廣C7o"/"g,X丄aZ)orato^yMa/wa/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核芬酸。此外，所述亞序列可編碼具有脂肪酶活性的多肽片段。對于長度至少IOO個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在5xSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml剪切和變性的鮭精DNA中于42°C預(yù)雜交和雜交，對于非常低和低嚴緊性，使用25°/。曱酰胺，對于中和中-高嚴緊性，使用35%曱酰胺，或者對于高和非常高嚴緊性，使用50%曱酰胺，根據(jù)標準Southern印跡方法最佳進行12至24小時。對于長度至少為100個核苷酸的長探針，使用2xSSC、0.2%SDS,優(yōu)選至少在15。C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少50。C(低嚴緊性)，更優(yōu)選至少55。C(中等嚴緊性)，更優(yōu)選至少60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少65。C(高嚴緊性)，和最優(yōu)選至少70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終清洗三次，每次15分鐘。DNA序列、表達載體、宿主細胞、脂肪酶的產(chǎn)生本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的脂肪酶的DNA序列，攜帶該DNA序列的表達載體，和包含DNA序列或表達載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。這些可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。本發(fā)明還提供通過如下產(chǎn)生脂肪酶的方法在利于產(chǎn)生脂肪酵的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，并從所得的培養(yǎng)液中回收脂肪酶?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的原理實施所述方法。脂肪酶活性在中性pH對三丁精的脂肪酶活性(LU)通過使用阿拉伯樹膠作為乳化劑將三丁酸甘油酯(tributyrin)(甘油三丁酸酯)乳化來制備用于脂肪酶的底物。在pH7或9在30。C水解三丁酸甘油酯，之后進行pH恒定的滴定實驗。1單位的脂肪酶活性(lLU)等于在pH7能夠釋放1微摩爾丁S交/分鐘的酶量。效益風險(BenefitRisk)效益風險因子描述的是與減少的氣味風險相比的性能，將其定義為BR=RPav2/R,如下所述。用途本發(fā)明的酶可以具有工業(yè)用途，例如，包括在用于去除脂肪物質(zhì)的洗滌劑組合物中。實施例用作緩沖劑和底物的化學品是至少試劑等級的商業(yè)產(chǎn)品。培養(yǎng)基與溶液嚴品商品名LAS:SurfacPS'沐石AWessalithP使用的其它組分是標準實驗室試劑。材料產(chǎn)品供應(yīng)商EMPA221EMPASt.Gallen,Lerchfeldstrasse5,CH-9014St.Gallen，Switzerland實施例1酶的產(chǎn)生使用本領(lǐng)域的標準方法構(gòu)建含有編碼脂肪酶的基因的質(zhì)粒，并且轉(zhuǎn)化至合適的宿主細胞中。使用溫度為34。C的恒定培養(yǎng)基和1.2升的起始體積，按照補料分批發(fā)酵來進行發(fā)酵。將培養(yǎng)基的初始pH設(shè)為6.5。一旦pH增加至7.0，通過添加10%H3P04來保持該值。通過改變攪拌速率和使用l.O升空氣每升培養(yǎng)基每分鐘的固定通氣速率來控制培養(yǎng)基中的溶解氧水平。在整個補料分批階段過程中，將補料添加速率保持在恒定水平。分批培養(yǎng)基含有麥芽糖糖漿作為碳源，尿素和酵母提取物作為氮源，以及痕量金屬和鹽的混合物。在補料分批階段期間連續(xù)添力口的補料含有麥芽糖糖漿作為碳源，而添加酵母提取物和尿素以確保氮的充足供應(yīng)?？梢酝ㄟ^使用用本領(lǐng)域已知的標準方法來進行脂肪酶的純化，例如通過過濾發(fā)酵上清，繼之以疏水層析和離子交換層析，例如如EP0851913EP,實施例3中所述。AMSA-自動化機械應(yīng)力試驗-用于計算相對性能(RP)4吏用自動才幾才扭力i式馬全(AutomaticMechanicalStressAssay;AMSA)測i式本申請的酶變體。使用AMSA測試，能夠檢查大量小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。AMSA平板具有用于測試溶液的多個槽(slot)，和將待洗滌的紡織品樣品相對于所有槽的開口(slotopening)壓緊的蓋。在洗滌時間中，劇烈搖動平寺反、測試溶液、紡織品和蓋以使測試溶液與紡織品接觸并且施以機械應(yīng)力。進一步的描述參見WO02/42740,特別是第23-24頁的段落"特殊方法實施方式"。含有洗滌劑測試溶液的容器由金屬平板中的圓柱形孔洞(直徑6mm,深10mm)組成。沾污的織物(測試材料)放置在金屬平板頂部，并將沾污的織物用作蓋子密封在所述容器上。另一個金屬平板放置在沾污織物的頂部以避免從各個容器中的任何溢出。以2mm振幅和30Hz的頻率將兩塊金屬平板連同沾污織物上下振動。在下文指定的實驗條件下進行所述試驗:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過將5g姜黃(SantaMaria，Denmark)與100g奶油(38°/。脂肪，Arla，Denmark)在50。C混合來制備奶油-姜黃樣品，將所述混合物在該溫度保持大約20分鐘，并且過濾(50。C)以去除任何未溶解的顆粒。將混合物冷卻至20。C,并且將編織的棉布樣品EMPA221浸入所述奶油-姜黃混合物，之后允許其在室溫干燥過夜，并且冷凍直到使用。奶油-姜黃樣品的制備在專利申請WO2006/125437中7A開。將酶變體的性能作為用特定酶變體洗滌的紡織品樣品的顏色亮度來測量。也可以將亮度表示為當用白光照射時，從紡織品樣品反射的光的強度。當紡織品被沾污時，反射光的強度與清潔紡織品的反射光強度相比較低。因此，能夠使用反射光的強度來測量酶變體的洗滌性能。使用專業(yè)平板掃描儀(PFUDL2400pro)進行顏色測量，使用該掃描儀來捕捉經(jīng)洗滌紡織品樣品的圖像。使用200dpi的分辨率和24比特(bit)的輸出色深度來進行掃描。為了獲得精確的結(jié)果，經(jīng)常性地使用Kodak反射IT8指標(target)校準掃描儀。為了從掃描的圖像提取光強度的值，使用特殊設(shè)計的軟件應(yīng)用程序(NovozymesColorVectorAnalyzer)。該程序從所述圖像恢復(fù)24比特像素值，并且將它們轉(zhuǎn)化為紅、綠和藍的值(RGB)。通過將RGB值加在一起作為矢量，再取所得矢量的長度來計算強度值(Int):m=7,+62根據(jù)下式計算變體的洗滌性能(P):P=Int(v)-Int(r)其中Int(v)是用酶洗滌的紡織品表面的光強度值，和Int(r)是不用酶洗滌的紡織品表面的光強度值。根據(jù)以下定義，給出相對性能評分作為AMSA洗滌的結(jié)果相對性能評分(RP)概括了測試酶變體相對于參照酶的性能(P)-.RP=P(測試酶)/P(參照酶)RPavg表示在全部四種酶濃度(0.125、0.25、0.5、1.0mgep/l)時，與參照酶相比的平均相對性能。RPavg=avg(RP(0.125),RP(0.25)RP(0.5),RP(l.O))如果變體表現(xiàn)優(yōu)于參照，則認為變體呈現(xiàn)出改進的洗滌性能。在本發(fā)明的上下文中，參照酶是具有取代T231R+N233R的SEQIDNO:2的脂肪酶。實施例3GC-氣相色譜一用于計算風險因子使用以下方法通過SolidPhaseMicroExtractionGasChromatography(SPME-GC)測量來自經(jīng)脂肪酶洗滌的樣品的丁酸釋放。將在含有l(wèi)mg/L脂肪酶的表3中指定溶液中洗滌的四個紡織品片(直徑5mm)轉(zhuǎn)移至氣相層析(GC)瓶。在裝備有Stabilwax畫DAw/Integra-Guard柱(30m,0.32mmID和0.25微米df)和CarboxenPDMSSPME纖維(75微米)的Varian3800GC上分析樣品。將各個樣品在40。C預(yù)溫育10分鐘，4妄著用SPME纖維在紡織品片之上的頂部空間(headspace)進行20分鐘采樣。繼而將樣品注射到柱上(注射器溫度=250。C)。柱流速2ml氦/分鐘。柱加熱爐溫度梯度0分鐘=40°C，2分鐘=40°C,22分鐘-240。C，32分鐘=240°0。由FID檢測法檢測出丁酸，并且基于丁酸標準曲線來計算丁酸的量。脂肪酶變體的風險性能氣味(RiskPerformanceOdour)R是經(jīng)脂肪酶變體洗滌的樣品所釋放的丁酸量和使用具有取代T231R+N233R的SEQIDNO:2的脂肪酶洗滌的樣品所釋放的丁酸量之間的比例，在計算比例之前將這兩個值根據(jù)無脂肪酶洗滌的樣品所釋放的丁酸量進行修正。根據(jù)下式計算變體的風險CR):氣味=以相對于空白校正的在1mg酶蛋白/升產(chǎn)生的微克丁酸測量Alpha測試酵—^p;^測試酶-S自Alpha參照絳=^p木參照酵陽玄白R_=Alpha測試醉/Alpha參照酵如果R因子小于1，則認為變體與參照相比表現(xiàn)出減少的氣味。實施例4相對于280nm吸光度的活性(LU)通過以下試驗來測定相對于280nm吸光度的脂肪酶活性LU/A280:如上面脂肪酶活性部分所述，確定脂肪酶的活性。測量脂肪酶在280nm的吸光度(A280)，并且計算比例LU/A280。用變體的LU/A280除以參照酶的LU/A280來計算相對LU/A280。在本發(fā)明的上下文中，參照酶是具有取代T231R+N233R的SEQIDNO:2的脂肪酶。實施例5BR-效益風險效益風險因子描述的是與減少的氣味風險相比的性能，因此將其定義為:BR二RPavg,R如果BR因子高于1，則認為變體顯示出改進的洗滌性能和減少的氣味。應(yīng)用以上方法獲得了以下結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例6BR-效益風險測定列于表5中所列變體的效益風險。用與實施例5中所述相同的方法測定效益風險因子，并發(fā)現(xiàn)所有列出的變體，效益風險因子都大于l。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例6BR-效益風險測定列于表5中所列變體的效益風險。用與實施例5中所述相同的方法測定效益風險因子，并發(fā)現(xiàn)所有列出的變體，效益風險因子都大于l。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權(quán)利要求1.親本脂肪酶的變體，其中變體包含至少三個選自下組的取代(使用SEQIDNO2編號)a)I區(qū)中的至少兩個取代，和b)II區(qū)中的至少一個取代，和c)III區(qū)中的至少一個取代，和d)IV區(qū)中的至少一個取代；和其中所述變體具有脂肪酶活性。2.權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的I區(qū)中至少兩個取^包含在對應(yīng)于位置231和233的位置的氨基酸的取代(使用SEQIDNO:2編號)。3.權(quán)利要求2的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的I區(qū)中至少兩個取4戈包含在對應(yīng)于位置231和233的位置的用氨基酸R的取代(使用SEQIDNO:2編號)。4.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其變體脂肪酶與SEQIDNO:2至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同。5.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的脂肪酶。6.根據(jù)權(quán)利要求2的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶在對應(yīng)于SEQIDNO:2的位置4和/或位置227的位置包含其它取代。7.根據(jù)權(quán)利要求6的脂肪酶變體，其中脂肪酶具有對應(yīng)于X4V和X227G的取代(使用SEQIDNO:2編號)。8.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的II區(qū)中至少一個取代包含如下取代，其選自由在對應(yīng)于位置202、210、211、255和256的位置的取代組成的組C使用SEQIDNO:2編號)。9.根據(jù)權(quán)利要求8的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶中至少一個取代選自下組X202G、X210K、X211L、X255Y/V和X256KCf吏用SEQIDNO:2編號)。10.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的III區(qū)中至少一個取代包含如下取代，其選自由在對應(yīng)于位置83、86和90的位置的取^Ri且成的組(使用SEQIDNO:2編號)。11.根據(jù)權(quán)利要求10的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶中至少一個取代選自下組X83T、X86V和X90A/R(使用SEQIDNO:2編號)。12.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的IV區(qū)中至少一個取代包含如下取代，其選自由在對應(yīng)于位置27、58和60的位置的取代i且成的組(使用SEQIDNO:2編號)。13.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中親本脂肪酶的IV區(qū)中至少一個取代包含選自下組的取代X27R、X58N/A/G/P/T和X60S/V/G/N/R/K/A/L(使用SEQIDNO:2編號)。14.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中脂肪酶變體還包含親本脂肪酶中的至少一個取代，其選自由在對應(yīng)于如下位置的位置的取代組成的組位置81、147、150、227和249(使用SEQIDNO:2編號)。15.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶變體還包含選自下組的至少一個取代X81Q/E、X147M/Y、X150G和X249R/I/L(使用SEQIDNO:2編號)。16.權(quán)利要求l的脂肪酶變體，其中所述脂肪酶包含選自下組取代的取代a)T231R+N233R+I255Yb)I202G+T231R+N233Rc)I86V+L227G+T231R+N233R+P256Kd)Q4V+S58N+V60S+T231R+N233Re)S58N+V60S+I進+T231R+N233Rf)I90A+T231R+N233R+I255Vg)S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256Kh)S58N+V60S+L147M+F211L+T231R+N233Ri)Q4V+S58A+V60S+S83T+I86V+A150G+E2匿+L227G+T231R+N233R+P256Kj)S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K17.編碼權(quán)利要求1-16的脂肪酶變體的DNA序列。18.攜帶權(quán)利要求17的DNA序列的表達載體。19.包含權(quán)利要求17的DNA序列的轉(zhuǎn)化宿主細胞。20.產(chǎn)生脂肪酶變體的方法，所述方法包含在利于產(chǎn)生脂肪酶變體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)化宿主細胞，和從得到的培養(yǎng)液中回收脂肪酶變體。21.SEQIDNO:2的變體，其包含Q4V、S58N/A/G/P/T、I卯R或Q249I/L中的至少一個突變。全文摘要本發(fā)明提供變體脂肪酶，優(yōu)選地，通過在親本脂肪酶中鑒定的一個或多個區(qū)域中引入突變而獲得的產(chǎn)生氣味的趨勢降低的變體。文檔編號C12N9/20GK101370933SQ200780002901公開日2009年2月18日申請日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日發(fā)明者于爾根·C·F·諾策爾,彼得·K·漢森,德比·亞弗,戈海燕,托馬斯·H·卡利森,杰斯珀·文德,邁克爾·拉姆薩,金·博爾奇,阿蘭·斯文德森,馬茲·E·比約恩瓦德申請人:諾維信公司;諾維信股份有限公司