產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的微生物和利用所述微生物產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生L-蛋氨酸前體O-乙酰高絲氨酸的微生物株和利用所述微生物株產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。所述微生物株是埃希氏菌屬的菌株，其中，向所述菌株中引入并表達(dá)了乙酰-CoA合酶基因(acs)和/或編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。
【專利說明】產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的微生物和利用所述微生物產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸(L-蛋氨酸前體)的微生物株。另外，本發(fā)明還涉及利用所述微生物株高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]可以通過化學(xué)或生物學(xué)方式合成在動(dòng)物飼料、食品和醫(yī)藥中使用的蛋氨酸。
[0003]在化學(xué)合成中，蛋氨酸基本上是通過水解5-(β_甲基巰基乙基)乙內(nèi)酰脲產(chǎn)生的。然而，合成的蛋氨酸的不利之處在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，這需要困難的額外方法將它們彼此分開。為了解決該問題，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于選擇性地合成L-蛋氨酸的生物學(xué)方法，L-蛋氨酸是已有專利申請(qǐng)(W02008/103432)要求保護(hù)的化學(xué)物質(zhì)。該方法(簡稱為“兩步法”)包括發(fā)酵產(chǎn)生L-蛋氨酸前體和由L-蛋氨酸前體向L-蛋氨酸的酶促轉(zhuǎn)化。所述蛋氨酸前體優(yōu)選包括O-乙酰高絲氨酸和O-琥珀酰高絲氨酸。就對(duì)常規(guī)方法存在的問題的克服對(duì)所述兩步法進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述常規(guī)方法存在的問題例如硫化物的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反饋調(diào)控，以及胱硫醚Y -合酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶對(duì)中間產(chǎn)物的降解。另外，與產(chǎn)生DL-蛋氨酸的常規(guī)化學(xué)合成法相比，所述兩步法具有以下優(yōu)點(diǎn):僅對(duì)L-蛋氨酸具有選擇性，并且伴隨產(chǎn)生作為有用副產(chǎn)物的有機(jī)酸，例如琥珀酸和乙酸。
[0004]作為蛋氨酸生物合成途徑中的中間產(chǎn)物，O-乙酰-高絲氨酸被用作產(chǎn)生蛋氨酸前體(W02008/013432)。如下式所示，在O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的協(xié)助下由L-高絲氨酸和乙酰-CoA合成O-乙酰-高絲氨酸:`
[0005]L-高絲氨酸+乙酰-CoA — O-乙酰-高絲氨酸。
[0006]在本申請(qǐng)的受讓人的美國專利公開第US2009-0253186A1號(hào)中公開了其中引入了thrA和metX基因以分別提高L-高絲氨酸和O-乙酰高絲氨酸的生物合成的微生物株，以及利用所述微生物株高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為增加乙酰-CoA(O-乙酰高絲氨酸的生物合成中使用的兩種底物之一)可提高O-乙酰高
絲氨酸的產(chǎn)量。
[0007]在大腸桿菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在過量的葡萄糖，可以由培養(yǎng)基中累積的乙酸產(chǎn)生乙酰-CoA。從乙酸合成乙酰-CoA可以利用兩種不同的生物合成途徑。在一種乙酰-CoA生物合成途徑中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中間產(chǎn)物，而乙酰-CoA合酶(acetyl-CoA synthase,ACS)通過該中間產(chǎn)物將乙酸活化成乙酰_CoA。在另一種途徑中，作為由乙酸激酶(ACK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)催化的連續(xù)反應(yīng)的結(jié)果，通過乙酰磷酸將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Mayl995, p.2878-2886)。在由乙酰-CoA合酶介導(dǎo)的生物合成途徑中發(fā)揮重要作用的乙酰-CoA合酶對(duì)乙酸具有高親和力，其甚至可以將細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的低水平乙酸活化成為乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介導(dǎo)的乙酰-CoA生物合成途徑僅在可能由混合酸的發(fā)酵形成的高乙酸水平下進(jìn)行，因?yàn)锳CK和PTA酶對(duì)乙酸具有低的親和力(J.Gen.Microbiol.102:327-336)。
[0008]對(duì)于乙酰-CoA合酶，由于位于啟動(dòng)子上游的CRP-結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)在指數(shù)生長前在轉(zhuǎn)錄水平上受到代謝物阻遏控制的抑制，而此后當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入靜止期時(shí)，其表達(dá)增高(MolMicrobiol.2004Jan;51(I):241-54.)。
[0009]因此，可以通過ACK-PTA途徑將在發(fā)酵中期累積的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由于ACK-PTA途徑是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被轉(zhuǎn)化為乙酸。也就是說，在ACK-PTA途徑中可能發(fā)生乙酰-Cok的消耗，顯示出對(duì)O-乙酰高絲氨酸合成的負(fù)作用。
[0010]在乙酰-CoA的合成中與乙酸一起作為底物使用的輔酶A(CoA)是細(xì)胞內(nèi)的代表性?；鶊F(tuán)載體。輔酶A由泛酸經(jīng)過一系列的步驟合成，每個(gè)步驟的酶促催化如下所示。首先，泛酸激酶(CoaA)將泛酸(維生素B5)活化成4’-磷酸泛酸，然后向4’-磷酸泛酸上加入半胱氨酸形成4’ -磷酸泛酰-L-半胱氨酸(4’ -phosphopantothenoyl-L-cysteine),然后利用P-PanCys合酶/P-PanCys脫羧酶(coaBC)的組合通過脫羧作用形成4’ -磷酸泛酰巰基乙胺。然后，通過磷酸泛酰巰基乙胺(P-PanSH)腺苷?；D(zhuǎn)移酶(coaD)將4’-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷?；?，從而形成脫磷酸-CoA。最后，利用ATP通過脫磷酸輔酶A(deP-CoA)激酶(coaE)將脫磷酸-CoA磷酸化為輔酶A。
[0011]通常，CoA是細(xì)胞內(nèi)多數(shù)代謝反應(yīng)以及很多合成反應(yīng)的輔助因子。為此，通過調(diào)節(jié)機(jī)制將CoA庫保持在恒定水平。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CoA庫的首要關(guān)鍵因子是泛酸激酶，其催化第一關(guān)鍵步驟并且是CoA生物合成中的限速酶。通過反饋抑制調(diào)節(jié)泛酸激酶是控制細(xì)胞內(nèi)CoA濃度的主要因素(J Biol Chem.19940ct28; 269 (43): 27051-8)。然而，細(xì)胞內(nèi)保持的恒定CoA水平可能是通過乙酰-CoA有效產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的障礙。據(jù)報(bào)道，用丙氨酸A取代第106位的精氨酸R 使泛酸激酶由對(duì)CoA的反饋抑制敏感轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)反饋抑制具有抗性(Journal Of Bacteriology, 185, June2003, p.3410-3415) ? 發(fā)現(xiàn)在存在 40mM CoA 時(shí)，野生型蛋白僅保留約20%的催化活性，而在相同濃度的CoA下卻沒有檢測到R106A突變蛋白的催化活性降低。另外，發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，表達(dá)突變蛋白的突變株具有顯著高的細(xì)胞內(nèi)CoA水平。
[0012]為完成本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)引入并增強(qiáng)(a)對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因，和(b)0-乙酰CoA合酶基因中的任一個(gè)或兩個(gè)都導(dǎo)致O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量顯著提高，如圖1所示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]因此，本發(fā)明的目的是提供能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的微生物株，所述微生物株經(jīng)過設(shè)計(jì)通過過表達(dá)acs基因和對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的coaA基因而增強(qiáng)乙酰-CoA的生物合成途徑。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述微生物株以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供能夠產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其中，向所述菌株中引入并增強(qiáng)了:
[0016](a)乙酰-CoA 合酶基因(acs)；
[0017](b)編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA);或[0018](c) (a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在培養(yǎng)基中產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中發(fā)酵所述株。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括:(a)發(fā)酵埃希氏菌屬的菌株從而產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸；(b)分離O-乙酰高絲氨酸；和(C)在選自由胱硫醚Y -合酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶組成的組的酶存在下，將O-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。
[0021]因此，根據(jù)本發(fā)明可以通過生物學(xué)方式高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸，這種方法的環(huán)境友好度高于化學(xué)方法。此外，可以酶促地，例如通過O-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶將本發(fā)明的微生物株產(chǎn)生的O-乙酰-L-高絲氨酸酶促地轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸。L-蛋氨酸可以用作食品或動(dòng)物飼料的添加劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]參考以下詳細(xì)說明并結(jié)合附圖，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中:
[0023]圖1為顯示能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的O-乙酰高絲氨酸生物合成途徑的不意圖；
[0024]圖2為顯示攜帶乙酰-CoA合酶基因(acs)的表達(dá)載體pCL_P (pro)-acs的遺傳圖和構(gòu)建的不意圖；和
[0025]圖3為顯示均攜帶編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶(coaA (R106A))的基因的表達(dá)載體pCL-P(pro)-`coaA(R106A)和pACYC-coaA(R106A)的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，其中，向所述菌株中引入并增強(qiáng)了:(a)乙酰-CoA合酶基因(acs) ； (b)編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA);或(c) (a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)兩者。
[0027]本文使用的術(shù)語“L-蛋氨酸前體”旨在指在蛋氨酸生物合成途徑中存在的代謝物或其衍生物，并且尤其指O-乙酰高絲氨酸。
[0028]本文使用的術(shù)語“產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株”旨在表示能夠在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的原核或真核微生物，并且尤其表示經(jīng)遺傳修飾能夠在其中累積O-乙酰高絲氨酸的微生物?？捎糜诒景l(fā)明的菌株的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providenciasp.)、棒桿菌屬(Corynebacteria sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鉤端螺旋體屬(Leptospira sp.)、沙門氏菌屬(Salmonellar sp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp.)、Hypomononas sp.、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、諾卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌和酵母，優(yōu)選埃希氏菌屬、棒桿菌屬和鉤端螺旋體屬以及酵母。更優(yōu)選埃希氏菌屬。更優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia col1.)。更優(yōu)選能夠產(chǎn)生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。最優(yōu)選大腸桿菌菌株(保藏號(hào)KCCM10921P)，其源自US12/062835(g卩，美國專利公開第2009-0253186A1號(hào))中所述的產(chǎn)生蘇氨酸的菌株，并向其中引入了 thrA和metX基因從而改善O-乙酰-L-高絲氨酸的生物合成途徑。
[0029]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提高O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了乙酰-CoA生物合成途徑中涉及的乙酰-CoA合酶基因。
[0030]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提高O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了對(duì)累積CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。
[0031]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供通過增強(qiáng)乙酰-CoA生物合成途徑而提高O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量的產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株，其中所述株中引入并增強(qiáng)了乙酰-CoA生物合成途徑中涉及的乙酰-CoA合酶和對(duì)累積CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶基因。
[0032]本文使用的術(shù)語“引入并增強(qiáng)”旨在表示提高由相應(yīng)基因編碼的酶的細(xì)胞內(nèi)活性，這通常能夠通過所述基因的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。過表達(dá)目標(biāo)基因的方法有很多。例如，可以通過修飾目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)和/或5’-UTR內(nèi)的堿基；通過在染色體上引入目標(biāo)基因的額外拷貝；或者通過將目標(biāo)基因與自體同源啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子相組合引入到載體上，然后將所述載體轉(zhuǎn)化到微生物株中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。另外，目標(biāo)基因ORF(開放閱讀框)內(nèi)的突變可以引起其過表達(dá)。用數(shù)字表示，當(dāng)發(fā)生過表達(dá)時(shí)，與天然狀態(tài)的表達(dá)相比，相應(yīng)蛋白的活性或濃度提高了 10%、25%、50%、75%、100%、150%,200%,300%,400% 或 500%、1000% 或者高達(dá) 2000%。 [0033]為了引入并增強(qiáng)基因，可以對(duì)相應(yīng)的啟動(dòng)子進(jìn)行突變或者增加基因的拷貝數(shù)。優(yōu)選使用強(qiáng)啟動(dòng)子。只要其是組成型的啟動(dòng)子，任何啟動(dòng)子均可在本發(fā)明中使用而不受限制?？梢允褂胮Tac、pTrc、pPro、pR和pL,其中最優(yōu)選SEQ ID N0.9的pPro。目標(biāo)基因可以全部或部分地包含SEQ ID N0.9的pPro啟動(dòng)子。
[0034]所述乙酰-CoA合酶和泛酸激酶可以來自多種不同的微生物，且可以分別由本發(fā)明中稱為“acs”和“coaA”的基因編碼。
[0035]在本發(fā)明中，提供了通過修飾而增強(qiáng)乙酰-Cok合酶活性、具有高的產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的能力的菌株，和利用所述菌株產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。
[0036]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株的制備如下所示。
[0037]為了提高O-乙酰-L-高絲氨酸的產(chǎn)生，用SEQ ID N0.9的組成型啟動(dòng)子P (pro)取代菌株中編碼乙酰-CoA合酶基因的啟動(dòng)子，然后構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì)粒從而誘導(dǎo)不受代謝物阻遏的目標(biāo)基因過表達(dá)。編碼乙酰-CoA合酶的基因通常表示為acs。它可以從之前公開的大腸桿菌基因組序列(g1:89110790)獲得(Mol Syst Biol.2006; 2:2006.0007.Epub2006Feb21)。另外，也可以從公用數(shù)據(jù)庫，例如美國國立生物技術(shù)信息中心(theNational Center for Biotechnology Information, NCBI)和日本 DNA 數(shù)據(jù)庫(DNA DataBank of Japan, DDBJ)構(gòu)建的公用數(shù)據(jù)庫中獲得所述基因序列。
[0038]乙酰-CoA合酶具有催化以下反應(yīng)的活性。如果編碼所述酶的基因的表達(dá)被增強(qiáng)，則會(huì)誘導(dǎo)乙酰-CoA在細(xì)胞內(nèi)累積。
[0039]乙酸+CoA〈=> 乙酰-CoA
[0040]接著，對(duì)具有組成型表達(dá)質(zhì)粒的微生物株進(jìn)行操作，從而進(jìn)一步提高乙酰-CoA的合成。本發(fā)明中采取的方法是使針對(duì)CoA合成的反饋抑制失效。關(guān)于這一點(diǎn)，催化第一關(guān)鍵步驟并作為CoA生物合成中的限速酶的泛酸激酶被突變，從而對(duì)CoA的反饋抑制產(chǎn)生抗性。為此，向編碼泛酸激酶的基因中引入突變，即coaA(R106A)。該基因可以從之前公開的大腸桿菌基因組序列(g1:89110060)獲得(Mol Syst Biol.2006; 2:2006.0007.Epub2006Feb21.)。另外，也可以從公用數(shù)據(jù)庫，例如美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)和日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)構(gòu)建的公用數(shù)據(jù)庫中獲得所述基因序列。
[0041]除了具有催化如下反應(yīng)所示的從泛酸至4’ -磷酸泛酸的磷酸化的活性外，所述突變的泛酸激酶對(duì)CoA反饋抑制不敏感。因此，增強(qiáng)編碼突變的泛酸激酶的基因提高細(xì)胞內(nèi)CoA庫的水平。
[0042]泛酸+ATP〈=>4’ -磷酸泛酸 +ADP
[0043]由此獲得的突變株在其中累積了大量作為底物的CoA和乙酰-CoA以及高絲氨酸，用于通過metX編碼的酶產(chǎn)生O-乙酰-L-高絲氨酸。因此，所述突變株能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰-L-高絲氨酸。
[0044]由此，將三株產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株CJM-X/(pCL-P (pro)-Acs)、CJM-X/(pCL-P (pro) -coaA (R106A))和 CJM-X/ (pCL-P (pro) -acs, pACYC-coaA (R106A))分別命名為“大腸桿菌CA05-0565”、“大腸桿菌CA05-0564”和“大腸桿菌CA05-0566”，制備并于2009年 8 月 11 日保藏在 KCCM(Korean Culture of Microorganism, Eulim build, Hongje-1-Dong, Seodaemun-ku, Seoul, 361-221，Korea)，保藏號(hào)分別為 KCCMl 1023P、KCCMl 1022P 和KCCMl1024P。
[0045]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株，在該株中，在組成型啟動(dòng)子Pro的控制下過表達(dá)參與乙酰-CoA生物合成的基因acs。更具體地，pPro啟動(dòng)子由SEQ ID N0.9的全長序列或其`部分構(gòu)成。
[0046]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株，在所述株中負(fù)責(zé)CoA生物合成的關(guān)鍵步驟的泛酸激酶對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性。另外，本發(fā)明還提供高產(chǎn)量地產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。優(yōu)選地，對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶在第106位氨基酸發(fā)生突變。更優(yōu)選地，通過用丙氨酸取代精氨酸使泛酸激酶在第106位氨基酸發(fā)生突變，由此對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性。最優(yōu)選地，對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶具有SEQ ID N0.8的氨基酸序列。
[0047]在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株，其中在所述菌株中同時(shí)采取兩種方法以增強(qiáng)乙酰-CoA合酶的活性和泛酸激酶的活性。
[0048]優(yōu)選地，用于制備產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株的大腸桿菌菌株是能夠產(chǎn)生賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或蛋氨酸的大腸桿菌菌株。更優(yōu)選地，所述大腸桿菌菌株的特征在于引入并增強(qiáng)了(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；(b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性；或(c) (a)和(b)兩者。最優(yōu)選的是源自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏號(hào)KCCM10921P)的大腸桿菌。
[0049]在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，克隆acs基因并用于構(gòu)建在SEQ ID N0.9的組成型啟動(dòng)子pPro控制下的acs表達(dá)載體pCL_P (pro) -acs (圖2)。將coaA基因的第106位氨基酸從精氨酸突變?yōu)楸彼幔瑥亩a(chǎn)生SEQ ID N0.8的突變coaA基因，其編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的所述酶。將該突變基因克隆至攜帶SEQ ID N0.9的組成型啟動(dòng)子ρΡι.ο的質(zhì)粒中，從而產(chǎn)生在組成型啟動(dòng)子pPro控制下的重組表達(dá)質(zhì)粒pCL-P (pro)-coaA (R106A)和pACYC-coaA(R106A)(圖3)。向CJM-X中單獨(dú)或組合轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pCL_P (pro)-acs和pCL-P (pro)-coaA (R106A)或pACYC_coaA(R106A)，從而制備特征在于引入并增強(qiáng)了(a)編碼乙酰-CoA合酶(acs)的基因，(b)編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的基因(coaA)，和(c) (a)和(b)兩種基因的產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株(實(shí)施例1_3)，其中所述CJM-X是通過從在US12/062835(即美國專利公開第US2009-0253186A1號(hào))中公開的增加了 thrA 和 metX 的菌株 CJM-X/pthrA (M) -CL (保藏號(hào) KCCM10921P)中除去 pthrA (M) -CL質(zhì)粒而構(gòu)建的。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)表明，與對(duì)照CJM-X相比，在用攜帶(a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)的pCL-P(piO)-acs轉(zhuǎn)化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸的生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高了 2.8g/L，產(chǎn)率上提高了 4.7%;在用攜帶(b)的對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的pCL-P(PiO)-CoaA(R106A)轉(zhuǎn)化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸的生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高了
2.lg/L，產(chǎn)率上提高了 3.5%;在用(b)和(c)的 pCL-P (pro)-acs 和 pACYC-coaA (R106A)轉(zhuǎn)化的菌株中，O-乙酰高絲氨酸生產(chǎn)能力在產(chǎn)量上提高了 6.8g/L，產(chǎn)率上提高了 11.4%(參見實(shí)施例2，表2)。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株，從而在培養(yǎng)基中累積O-乙酰高絲氨酸。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括
(a)通過發(fā)酵本發(fā)明的產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸；
(b)分離O-乙酰高絲氨酸；和(C)在選自胱硫醚Y-合酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的轉(zhuǎn)化酶存在下，將分離的O-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸和乙酸。
[0052]當(dāng)與本發(fā)明的微生 物株組合使用時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人的W02008/013432中公開的基于使用轉(zhuǎn)化酶(胱硫醚Y -合酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶或O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶)的L-蛋氨酸生產(chǎn)方法能夠產(chǎn)生更高產(chǎn)量的L-蛋氨酸。
[0053]以上制備的產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的微生物株可以在本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解，可以根據(jù)所用微生物株對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行調(diào)整。發(fā)酵可以以分批、連續(xù)培養(yǎng)或分批補(bǔ)料的形式進(jìn)行，但并不限于此。以下參考文獻(xiàn)公開了多種發(fā)酵方法,Biochemical Engineering，，by James M.Lee, Prentice-Hall InternationalEditions, ppl38_176。
[0054]培養(yǎng)基必須滿足特定微生物株的培養(yǎng)條件。以下參考文獻(xiàn)中公開了多種微生物培養(yǎng)基:“ManuaI of Methods for General Bacteriology，，by the American Society forBacteriology, Washington D.C., USA, 1981。通常,培養(yǎng)基包括多種碳源、氮源和微量元素。碳源的實(shí)例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇類，例如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，例如乙酸。這些碳源可以單獨(dú)或組合使用。氮源的實(shí)例包括有機(jī)氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽膏、玉米漿(CSL)和豆粉；無機(jī)氮源，例如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，這些氮源可以單獨(dú)或組合使用。另外，所述培養(yǎng)基還可以包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和/或其相應(yīng)的含鈉鹽。另外，所述培養(yǎng)基中還可以以鹽的形式包含金屬，例如磷 酸鎂或硫酸鐵。此外，還可以加入氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那绑w?？梢苑峙蜻B續(xù)的方式將所述培養(yǎng)基或前體加入到培養(yǎng)物(culture)中。
[0055]可以利用合適的化合物，例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸和硫酸，調(diào)整培養(yǎng)物的pH。為了防止在培養(yǎng)物中產(chǎn)生泡沫，可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了產(chǎn)生有氧條件，可以向培養(yǎng)基中充入氧或含氧氣體(例如空氣)。培養(yǎng)基保持在20~45°C，優(yōu)選25~40°C。將微生物株培養(yǎng)至L-蛋氨酸前體的期望水平，優(yōu)選培養(yǎng)10~160小時(shí)。
[0056]通過以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，但以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本發(fā)明的范圍。
[0057]實(shí)施例1:制備產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株
[0058]<1~1> 克隆 acs 基因
[0059]對(duì)于acs基因的克隆，利用大腸桿菌W3110(ATCC27325)的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼乙酰-Cok合酶的acs基因。從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得acs基因的堿基序列(NCB1-g1:89110790)，并表示為SEQ ID N0.7。在所述堿基序列的基礎(chǔ)上，利用含有選擇性酶切位點(diǎn)EcoRV和HindIII的引物對(duì)(SEQ ID N0S.1和2)，以大腸桿菌W3110的基因組DNA為模板，在高保真DNA聚合酶PfuUltra? (Stratagene)存在下，通過PCR擴(kuò)增從ATG至TAA的ORF。所述PCR包括96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)，從而合成含有EcoRV和HindIII位點(diǎn)的約2.0kb的acs基因。
[0060]用限制性酶EcoRV和HindIII消化后，將所擴(kuò)增的acs基因連接到此前用相同酶進(jìn)行處理的pPro-GFP載體上,從而構(gòu)建攜帶acs基因并包含組成型啟動(dòng)子Pro的重組組成型表達(dá)載體，稱為pCL-P (pro) -acs。圖2顯不了所述表達(dá)載體pCL_P (pro) -acs的遺傳圖和構(gòu)建。
[0061]<1-2>克隆反饋抗`性coaA基因
[0062]為了克隆反饋抗性coaA基因，利用大腸桿菌W3110(ATCC27325)的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的coaA基因。為此，首先從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得coaA基因的堿基序列(NCB1-g1:89110060)。在所述堿基序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增從ATG至TAA的coaA片段的引物對(duì)(SEQ ID N0S.3和4)，使其包含限制性酶切位點(diǎn)EcoRV，并且在第316~318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT，從而產(chǎn)生對(duì)CoA的反饋抑制的抗性。另外，單獨(dú)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增coaA片段的引物對(duì)(SEQID N0S.5和6)，使其包含限制性酶切位點(diǎn)Hindlll，并且出于與上述相同的原因而使其第316~318位的核苷酸為密碼子GCC而非CGT。
[0063]當(dāng)以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時(shí)，在高保真DNA聚合酶PfuUltra?(Stratagene)存在下，分別利用合成引物對(duì)SEQ ID N0S.3和4，以及SEQ IDN0S.5和6進(jìn)行PCR，包括在96°C變性30秒、50°C退火30秒和72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。結(jié)果，獲得兩個(gè)基因片段:一個(gè)片段從coaA的起始ATG密碼子開始延伸，并且在第316~318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼子的突變的大小約344bp的片段；另一個(gè)片段是包含終止密碼子TAA，并且在第316~318位核苷酸具有從CGT密碼子至GCC密碼子的突變的大小約642bp的片段。
[0064]利用所述兩種片段作為模板進(jìn)行PCR，所述PCR包括96°C變性60秒、50°C退火60秒和72°C延伸2分鐘的10個(gè)循環(huán)，隨后利用引物對(duì)SEQ ID N0S.3和6在相同的熱條件進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。結(jié)果，獲得第316~318位的CGT密碼子被取代為GCC密碼子的963bp的基因(coaA(R106A))。
[0065]用限制性酶EcoRV和Hindi 11消化后，通過連接將突變的coaA基因克隆至pPro-GFP載體上，從而構(gòu)建稱為pCL-P (pro) -coaA (R106A)的重組表達(dá)載體，該載體受組成型啟動(dòng)子Pro (SEQ ID N0.9)的控制，并攜帶第106位氨基酸殘基的密碼子由CGT突變?yōu)镚CC的突變coaA基因。所述突變coaA的氨基酸序列表示為SEQ ID N0.8。
[0066]接著，將突變coaA的基因克隆到pACYC177載體中。用限制性酶處理重組質(zhì)粒 pCL-P (pro) -coaA (R106A)，以從其中切出含有 Pro 啟動(dòng)子的 1.45kb 的 coaA (R106A)片段。將所述coaA(R106A)片段插入到此前用BamHI和HindIII處理的pACYC177載體中，由此構(gòu)建重組載體pACYC-coaA(R106A)。在圖3中，圖示說明了重組表達(dá)載體pCL-P (pro) -coaA (R106A)和 pACYC-coaA (R106A)的構(gòu)建。
[0067]<1-3>制備產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸株
[0068]將實(shí)施例〈1_1>和〈1_2>中構(gòu)建的質(zhì)粒pCL-P (pro)-acs和pCL-P (pro) -coaA (R106A)轉(zhuǎn)化到菌株 CJM-X 中，然后在 LB-Sp (酵母提取物 10g/L、NaC15g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25μ g/L)上培養(yǎng)從而針對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化體選出10個(gè)壯觀霉素抗性菌落，其中，所述CJM-X是通過從US12/062835 (即，美國專利公開第US2009-0253186A1號(hào))中公開的(^1^/?讓^(11)-(^中除去？訪^(10-(^質(zhì)粒而構(gòu)建的。另外，用實(shí)施例〈1_2>中構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pACYC-CoaA (R106A)轉(zhuǎn)化攜帶pCL_P (pro) -acs載體的CJM-X，并在LB-Sp-Ap (酵母提取物10g/L、NaC15g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25μ g/L、氨芐青霉素50 μ g/L)上培養(yǎng)，從而選出10個(gè)具有壯觀霉素和氨芐青霉素抗性的菌落。對(duì)其產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的能力進(jìn)行相互比較。 [0069]實(shí)施例2:發(fā)酵產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸
[0070]為了檢測實(shí)施例1中制備的菌株產(chǎn)生蛋氨酸前體O-乙酰高絲氨酸的能力，在錐形瓶中培養(yǎng)這些菌株。
[0071]對(duì)于該培養(yǎng),使用表1中所示的O-乙酰高絲氨酸滴定培養(yǎng)基(titer medium)。
[0072]表1
[0073]用于生產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸的培養(yǎng)基的組成
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種具有提高的O-乙酰高絲氨酸生產(chǎn)力的埃希氏菌屬的菌株，其中在所述菌株中引入并增強(qiáng)了: 乙酰-CoA合酶基因(acs);和 編碼對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。
2.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中，所述埃希氏菌屬的菌株通過進(jìn)一步修飾引入并增強(qiáng)了高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
3.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其中通過利用新的啟動(dòng)子或突變的啟動(dòng)子或者通過增加所述基因的拷貝數(shù)來引入并增強(qiáng)所述基因。
4.如權(quán)利要求3所述的埃希氏菌屬的菌株,其中所述新的啟動(dòng)子選自由pTrc、pPro、pR和pL組成的組。
5.如權(quán)利要求2所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述由基因coaA編碼、對(duì)CoA的反饋抑制具有抗性的泛酸激酶具有用丙氨酸取代野生型泛酸激酶(NCB1-Gene ID948479)第106位的精氨酸的取代。
6.如權(quán)利要求5所述的埃希氏菌屬的菌株，其中所述泛酸激酶的氨基酸序列為SEQIDN0.8的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求2所述的埃希氏菌屬的菌株，其源自的菌株中引入并增強(qiáng)了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性。
8.如權(quán)利要求1所述的埃希氏菌屬的菌株，其屬于大腸桿菌。
9.生產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的微生物，和從培養(yǎng)基或所述微生物回收O-乙酰高絲氨酸。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103756948SQ201310711976
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2010年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2009年8月28日
【發(fā)明者】金素影, 申容旭, 許仁庚, 金賢雅, 徐昌一, 金朱恩, 孫晟光, 李相穆, 全成后, 李漢珍, 羅光鎬 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社