金魚吻端細胞系及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金魚吻端細胞系及其應用。該金魚吻端細胞系已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC?No.8558。本發(fā)明所述的金魚吻端細胞系特性穩(wěn)定、成分均一，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。
【專利說明】金魚吻端細胞系及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金魚吻端細胞系及其應用，屬于醫(yī)學生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]關于魚類細胞系的研究，國內(nèi)外取得了很大的研究進展。1962年由Wolf和Quimby建立的虹鱒性腺細胞系(RGT-2)開始，胖頭魚肌肉細胞系、劍尾魚胚胎細胞系SWT、大西洋鱒內(nèi)臟組織細胞系AS和巴拉圭鰺幼魚細胞系等多種包括海淡水魚類細胞系也陸續(xù)建立起來。魚類原代細胞系的建立技術目前是一種較為成熟的技術，但是要獲得針對病毒敏感的細胞系仍存著很大的偶然性和困難性，所以建立一株需要魚類細胞系有效的途徑是以數(shù)量對質(zhì)量，即制備大批量的原代細胞株，從而篩選出敏感的細胞系。
[0003]世界衛(wèi)生組織(OIE)推薦檢測水產(chǎn)動物病毒的“黃金標準”是通過細胞來分離病毒。為了能夠更好有效的分離到水產(chǎn)動物的病毒，及早的檢測出病毒，預防疾病的爆發(fā)，許多國內(nèi)外的學者仍然在進行魚類細胞系的研究。目前尚無關于建立金魚吻端細胞系的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細胞系(GS)，是一些水產(chǎn)動物病毒的敏感細胞系，是進一步研究未知病毒的良好材料。
[0005]本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種金魚吻端細胞系的制備方法。
[0006]本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供所述的金魚吻端細胞系在對水產(chǎn)動物病毒分離方面的初步應用。
·[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下述技術方案:
[0008]經(jīng)過篩選，本發(fā)明獲得了特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細胞系，該金魚吻端細胞系(GS)已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC N0.8558，保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101，其分類命名為金魚吻端細胞系。
[0009]進一步地，所述細胞系具有以下生物學特性:
[0010](I)細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點；
[0011](2)細胞具有較強的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
[0012]本發(fā)明還提供了一種上述金魚吻端細胞系的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0013](I)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的吻端，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中，放置10-15min ；
[0014](2)胰酶消化液消化lOmin，然后剪成小塊，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再用培養(yǎng)基進行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻；
[0015](3)將步驟(2)制備的重懸混勻液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0016](4)待細胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次；[0017](5)待細胞鋪滿板子，用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；
[0018](6)傳代3次后，凍存，復蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細胞系命名為GS。
[0019]進一步地，所述培養(yǎng)基為含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0020]進一步地，所述胰酶消化液的配制:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀 0.2g，EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0021]進一步地，本發(fā)明所述的金魚吻端細胞系GS可以作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細胞使用，用于水 產(chǎn)動物病毒的分離。
[0022]本發(fā)明的有益效果如下:
[0023]實驗中使用的是魚類細胞培養(yǎng)的最常用的培養(yǎng)基、且在簡單的條件進行原代細胞篩選培養(yǎng)，保證最終獲得的細胞無需特殊試劑和條件就能增殖，為其今后的應用提供更好的空間。該金魚吻端細胞系是首次成功在體外培養(yǎng)。該細胞在培養(yǎng)7天時，明顯出現(xiàn)延伸生長；15天后鋪滿板子，進行消化后，具有較強的繁殖能力，呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)。細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)16個月已傳至50代，仍然保持上述形態(tài)特點、生長和增殖特性。因此，該細胞是一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細胞系，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明；
[0025]圖1相差顯微鏡下的金魚吻端細胞系的形態(tài)；
[0026]圖2金魚吻端細胞系懸浮特性分析
[0027]圖3金魚吻端細胞系的最佳血清濃度的確定；
[0028]圖4金魚吻端細胞系的最佳培養(yǎng)溫度的確定；
[0029]圖5金魚吻端細胞系的倍增曲線分析；
[0030]圖6金魚吻端細胞系的增殖病毒的初步應用。
【具體實施方式】
[0031]為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā)明的保護范圍應包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0032]實施例1金魚吻端細胞的分離和原代培養(yǎng)
[0033]實驗材料和試劑
[0034]實驗動物:10g_30g的金魚(經(jīng)過反復分子方法驗證未感染水產(chǎn)動物病毒的健康金魚)。
[0035]實驗器具:解剖刀、眼科剪刀、眼科鑷子和紗布等。
[0036]培養(yǎng)基和相關試劑:
[0037]青霉素-鏈霉素雙抗溶液濃度為10000u/ml ；
[0038]培養(yǎng)基:含有濃度為100U/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的M199培養(yǎng)基(gibco公司)；
[0039]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml ；[0040]醫(yī)用酒精；
[0041]0.01M 的 PBS 緩沖液(NaC180g，Na2HPO4 ? 12H2029g, KH2P042g, KC12g，水 1000ml)。
[0042]實驗方法
[0043]經(jīng)過檢測的健康金魚，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)15天，無其他疾病，開始實驗。具體方法:
[0044](I)取一條金魚在醫(yī)用酒精中浸泡5min，無菌條件下，剪取金魚的吻端，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中,放置15min ；
[0045](2)胰酶消化液消化IOmin,用解剖刀切割成小塊(約1mm)。加入培養(yǎng)基,重懸。離心lOOOrmp，IOmin0棄掉上清液，再次加入培養(yǎng)基,進行重懸,離心,棄掉上清液,最后加入培
養(yǎng)基,重懸混勻。
[0046](3)鋪培養(yǎng)瓶，放入到25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0047](4)待培養(yǎng)2天后觀察細胞貼壁情況，適當加入培養(yǎng)基(保證培養(yǎng)基的pH)。待細胞鋪板到1/3的時候(約7天)，更換新鮮的培養(yǎng)基一次。
[0048](5)待細胞鋪滿板子(約15天)，用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；
[0049](6)傳代3次后，凍存，復蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細胞系命名為GS;
[0050](7)每隔7天傳代I次。
[0051]實驗結(jié) 果:
[0052]圖1為相差顯微鏡下的金魚吻端細胞系的形態(tài)；圖2是金魚吻端細胞系懸浮特性分析，結(jié)果表明細胞均一性比較好，集中在直徑12-18微米。
[0053]實施例2金魚吻端細胞系的傳代培養(yǎng)和凍存保種
[0054]試劑
[0055]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0056]凍存液:含10 % DMS0、25 %的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0057]實驗方法
[0058]待細胞生長至90 %時，棄掉舊的培養(yǎng)基，加入2.5ml胰酶消化液進行消化；
[0059]待細胞呈現(xiàn)“白霧”狀的時候，加入2ml的凍存液，以終止胰酶的作用，輕輕幌動，使細胞混勻，計數(shù)。
[0060]收集細胞到凍存管中，于凍存管上注明細胞的名稱、細胞數(shù)和凍存日期。
[0061]一個月后，按照常規(guī)細胞復蘇的方法，進行細胞復蘇，細胞增殖能力仍然很強，狀態(tài)良好。
[0062]獲得的金魚吻端細胞系(GS)已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC N0.8558。
[0063]實施例3金魚吻端細胞系的最適條件確定
[0064]—、試劑
[0065]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0066]培養(yǎng)基:不同濃度的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0067]二、實驗方法[0068]1、最適血清的確定
[0069]分別配制特級胎牛血清濃度為10%、15%、20%的培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為
1.SXlO5mL'三種血清濃度培養(yǎng)基各按ImL/孔的量接種于24孔板，于25 °C，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d從每個實驗組里取出3孔細胞，消化收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)12d，連續(xù)計數(shù)6次，繪制其生長曲線。
[0070]2、最適溫度的確定
[0071]選擇15°C、20°C、25°C、30°C四個不同培養(yǎng)溫度，使用添加20%特級太牛血清的M199培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為1.8 X IO5IiiL-1,細胞懸液按ImL/孔的量接種于24孔板并置于四個不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每2d從每個實驗組里取出3孔細胞，收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)12d，連續(xù)計數(shù)6次，繪制其生長曲線。
[0072]三、實驗結(jié)果
[0073]最適血清的確定(圖3)，金魚吻端細胞系在特級胎牛血清20%的M199培養(yǎng)基中，增長繁殖最好。
[0074]最適溫度的確定(圖4),金魚吻端細胞系在25°C生長,繁殖最好。
[0075]實施例4金魚吻端細胞系的生長曲線
[0076]一、試劑
[0077]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0078]培養(yǎng)基:20%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0079]二、實驗方法
[0080]取對數(shù)生長期的細胞，收集計數(shù)細胞，使用含20%FBS的M199培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度為8.38X IOW1,按ImL/孔的量接種至24孔板中，置培養(yǎng)箱中25°C培養(yǎng)。每天取3個孔細胞，胰酶消化消化制成細胞懸液，混勻后用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，實驗重復3次，連續(xù)進行9d，以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標，細胞濃度(細胞/mL)為縱坐標，繪制生長曲線；根據(jù)公式T=tXlg2/lg(Nt/N0)計算細胞的群體倍增時間，其中，N0為接種細胞數(shù)，Nt為時間t后的細胞數(shù)。
[0081]三、實驗結(jié)果
[0082]金魚吻端細胞系在傳代24h內(nèi)為遲緩期，對數(shù)生長期在第24_120h，當120h時進入到平穩(wěn)期(圖5)
[0083]實施例5金魚吻端細胞系的初步應用
[0084]一、試劑
[0085]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0086]培養(yǎng)基:20%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0087]由ATCC購買的錦鯉皰疹病毒(KHV)參考株(ATCCVR1592)。
[0088]二、實驗方法
[0089]對金魚吻端細胞系用胰酶消化液進行消化，含有20%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基1:1傳代，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞增殖在24h內(nèi)接入KHV病毒，置于20°C培養(yǎng)箱中，每天觀察變化。[0090]三、實驗結(jié)果[0091]圖6所示，細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)，說明金魚吻端細胞系能夠增殖病毒KHV,為KHV的研究提供了有力的材料。
[0092]顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【權(quán)利要求】
1.一種金魚吻端細胞系GS，其保藏號為CGMCC N0.8558。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金魚吻端細胞系GS，其特征在于，所述細胞系具有以下生物學特性: (1)細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點； (2)細胞具有 較強的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
3.—種權(quán)利要求1所述的金魚吻端細胞系GS的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_2min，于無菌條件下剪取金魚的吻端，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中； (2)胰酶消化液消化lOmin，然后剪成小塊，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再用培養(yǎng)基進行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻； (3)將步驟(2)制備的重懸混勻液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4)待細胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次； (5)待細胞鋪滿板子，用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)； (6)傳代3次后，凍存，復蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細胞系命名為GS。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀 0.1g,氯化鈉 8.0g,氯化鉀 0.2g，EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
6.權(quán)利要求1所述的金魚吻端細胞系GS作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細胞的應用。
7.權(quán)利要求1所述的金魚吻端細胞系GS在水產(chǎn)動物病毒分離中的應用。
【文檔編號】C12N7/00GK103710298SQ201310711835
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】景宏麗, 高隆英, 張旻, 張利峰, 王娜, 林祥梅, 吳紹強, 江育林 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院