專利名稱：細胞系以及制備和使用其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型細胞和細胞系，以及關(guān)于制備和使用其的方法。
背景技術(shù)：
目前，據(jù)報告關(guān)于醫(yī)藥公司中的藥物開發(fā)項目的工業(yè)平均失敗率是大約98%。盡 管這包括在過程的所有階段的失敗，但高失敗率意味著迫切需要在過程效率中的任何改
口 ο促成高失敗率的一種因素是缺乏表達治療性靶標(biāo)的細胞系，所述治療性靶標(biāo)在藥 物開發(fā)過程中的基于細胞的功能測定法中使用。毫無疑問地，使用基于細胞的測定法的研 究，特別是藥物開發(fā)研究，將獲益于在基于細胞的測定法中使用的細胞和細胞系。因此，非常需要快速和有效建立基于細胞的測定法用于更快速開發(fā)新的和改良的 藥物。優(yōu)選地，對于更有效的藥物開發(fā)，測定法系統(tǒng)應(yīng)提供調(diào)節(jié)劑在體內(nèi)的效應(yīng)的更生理學(xué) 相關(guān)的預(yù)測物。除需要基于細胞的測定法外，還需要改良細胞用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)、基于細胞的療法 和各種其他用途。因此，存在關(guān)于表達目的功能蛋白質(zhì)或RNA的細胞和細胞系的急切需要。發(fā)明概述在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達來自所引入核酸的目的異源二聚體蛋白質(zhì) 的細胞，所述所引入核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征 在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的 蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細 胞在功能測定法中具有至少0. 4的V因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行 培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一 個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二 聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地 和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存 在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達來自所引入核酸的目的異源二聚體蛋白質(zhì) 的細胞，所述所引入核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征 在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的目的蛋白質(zhì)，其中所述細胞在不存在 選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一 個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的目的蛋白 質(zhì)，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)。
在某些實施方案中，編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的第二個亞單位的核酸是內(nèi)源 的。在其他實施方案中，編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的第二個亞單位的核酸是引入的。在 另外其他的實施方案中，目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自離子通道、G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受體。在某些實施方案 中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自甜味受體和鮮味受體。在其他實施方案中，目的異源二聚 體蛋白質(zhì)不具有已知配體。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)不在相同類型的細胞中表達。在某些 實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，細胞的進一步特征在于它具有選自下述的另外所需性質(zhì)信 噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪失表達，生理學(xué)EC50值和生 理學(xué)IC50值。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)以一定形式一致地和可重復(fù)性地 產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至少3個 月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月和至少9個月。在某些 實施方案中，功能測定法選自基于細胞的測定法、基于熒光細胞的測定法、高通量篩選測 定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基于細胞的測定法。 在其他實施方案中，細胞適合于在基于細胞的高通量篩選中使用。在某些實施方案中，選擇壓力是抗生素。在其他實施方案中，細胞在不存在選擇壓 力的情況下表達異源二聚體蛋白質(zhì)以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或 150 天。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 目的異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞單位，其中目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單 位由所引入核酸編碼，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的 目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的 形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述 細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 目的異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞單位，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn) 錄，所述內(nèi)源核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它 產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì) 不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功 能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或 其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 目的異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞單位，其中目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單 位由所引入核酸編碼，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式 的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述 目的異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞單位，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它 產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位的核酸是內(nèi)源 的。在某些實施方案中，編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位的核酸是引入 的。在某些實施方案中，目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自離子通道、G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受體。在其他實施方案 中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自GABA、ENaC和NaV。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋 白質(zhì)不具有已知配體。在某些實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)不在相同類型的細胞中表達。在其他 實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，細胞的進一步特征在于它具有選自下述的另外所需性質(zhì)信 噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪失表達，生理學(xué)EC50值和生 理學(xué)IC50值。在其他實施方案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)以一定形式一致地和可重復(fù)性地 產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至少3個 月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月和至少9個月。在某些實施方案中，功能測定法選自基于細胞的測定法、基于熒光細胞的測定 法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基 于細胞的測定法。在其他實施方案中，表達異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞適合于在基于細胞的 高通量篩選中使用。在某些實施方案中，表達異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞在不存在選擇壓力的情況下進 行培養(yǎng)。在某些實施方案中，選擇壓力是抗生素。在其他實施方案中，根據(jù)權(quán)利要求35或36 的細胞，其中細胞在不存在選擇壓力的情況下表達異源二聚體蛋白質(zhì)以至少15天、30天、 45天、60天、75天、100天、120天或150天。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達來自所引入核酸的2種或更多種目的蛋白 質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合 于在功能測定法中使用的形式的目的蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或 所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功能測定法中具有至少 0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，其中所 述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細 胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中 所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn) 生，使得細胞在功能測定法中具有至少0. 4的V因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情 況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達來自所引入核酸的2種或更多種目的蛋白 質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，其中所 述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細 胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)中的至少一種是二聚體蛋白質(zhì)。在其 他實施方案中，目的二聚體蛋白質(zhì)是同源二聚體蛋白質(zhì)。在其他實施方案中，目的二聚體蛋 白質(zhì)是異源二聚體蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)中的至少一種是多 聚體蛋白質(zhì)。在其他實施方案中，目的多聚體蛋白質(zhì)是同源多聚體蛋白質(zhì)。在其他實施方 案中，目的多聚體蛋白質(zhì)是異源多聚體蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)之一由內(nèi)源核酸編碼。在其他實施方 案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)之一由所引入核酸編碼。在其他實施方案中，目的蛋白質(zhì)不 包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)之一選自離子通道、G蛋白偶聯(lián)受 體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受體。在其他實施方 案中，目的異源二聚體蛋白質(zhì)不具有已知配體。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)之一不在相同類型的細胞中表達。在 某些實施方案中，表達2種或更多種蛋白質(zhì)的細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，表達2種或更多種蛋白質(zhì)的細胞的進一步特征在于它具有選 自下述的另外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪 失表達，生理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。在某些實施方案中，2種或更多種目的蛋白質(zhì)以一定形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn) 生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至少3個 月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月和至少9個月。在某些實施方案中，功能測定法選自基于細胞的測定法、基于熒光細胞的測定 法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基 于細胞的測定法。在其他實施方案中，表達2種或更多種蛋白質(zhì)的細胞適合于在基于細胞 的高通量篩選中使用。在某些實施方案中，表達2種或更多種蛋白質(zhì)的細胞在不存在選擇壓力的情況下 進行培養(yǎng)。在某些實施方案中，選擇壓力是抗生素。在其他實施方案中，細胞在不存在選擇 壓力的情況下表達2種或更多種蛋白質(zhì)以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120 天或150天。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達至少一種目的RNA的細胞，其中所述目的 RNA由所引入核酸編碼，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式 的至少一種目的RNA，其中所述目的RNA不包含標(biāo)簽，或所述RNA以這樣的形式一致地和可 重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選 擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達至少一種目的RNA的細胞，其中所述細胞 進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的RNA，所述細胞的特征在 于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的至少一種目的RNA，其中所述目的RNA不包含標(biāo)簽，或所述RNA以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得細胞在功能測定法中 具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組
I=I O在某些實施方案中，細胞表達至少2種目的RNA。在其他實施方案中，細胞表達至 少3種目的RNA。在某些實施方案中，細胞進一步表達由所引入核酸編碼的RNA。在某些實 施方案中，目的RNA選自編碼離子通道的RNA、編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的RNA、編碼酪 氨酸受體激酶的RNA、編碼細胞因子受體的RNA、編碼核類固醇激素受體的RNA和編碼免疫 受體的RNA。在某些實施方案中，目的RNA不在相同類型的細胞中表達。在某些實施方案中，表 達目的RNA的細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，表達目的RNA的細胞的進一步特征在于它具有選自下述的另 外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪失表達，生 理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。在某些實施方案中，目的RNA以一定形式一致地和可重復(fù) 性地產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至少 3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月和至少9個月。在某些實施方案中，功能測定法選自基于細胞的測定法、基于熒光細胞的測定 法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基 于細胞的測定法。在某些實施方案中，表達目的RNA的細胞適合于在基于細胞的高通量篩選中使用。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了由本文描述的細胞產(chǎn)生的細胞系。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生表達目的蛋白質(zhì)的細胞的方法，其中 所述細胞具有隨著時間的過去保持一致的至少一種所需性質(zhì)，所述方法包括步驟a)提供表達編碼目的蛋白質(zhì)的mRNA的多個細胞；b)將細胞單個分散到單個培養(yǎng)器皿內(nèi)，從而產(chǎn)生多個分離的細胞培養(yǎng)物；c)使用自動化細胞培養(yǎng)法在一組所需培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，所述自動化細胞培 養(yǎng)法的特征在于所述條件對于分離的細胞培養(yǎng)物各自是基本上等同的，在這個培養(yǎng)過程中 使細胞數(shù)目/分離的細胞培養(yǎng)物進行標(biāo)準化，并且其中分離培養(yǎng)物根據(jù)相同時間表進行傳 代；d)就目的蛋白質(zhì)的至少一種所需特征測定分離的細胞培養(yǎng)物至少2次；和e)鑒定在2種測定法中都具有所需特征的分離的細胞培養(yǎng)物。在某些實施方案中，在本文描述的方法的步驟a)中的多個細胞在步驟b)中的分 散前培養(yǎng)一段時間。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的單個培養(yǎng)器皿選自多孔平板的單 個孔和小瓶。在某些實施方案中，該方法進一步包括測定多個分離的細胞培養(yǎng)物的生長速率， 并且通過其生長速率將分離的細胞培養(yǎng)物分成組的步驟，從而使得在任何組中最快和最慢 的生長速率之間的差異在步驟b)和c)之間不超過1、2、3、4或5小時。在某些實施方案中，該方法進一步包括制備一種或多種分離培養(yǎng)物的貯藏原種的步驟。在某些實施方案中，該方法進一步包括分離的細胞培養(yǎng)物的一個或多個復(fù)制組和與 來源分離的細胞培養(yǎng)物分開培養(yǎng)一個或多個復(fù)制組的步驟。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟d)中的測定是用于蛋白質(zhì)的功能測 定法。在某些實施方案中，在步驟e)中保持不變的至少一種特征是蛋白質(zhì)功能。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟c)中的培養(yǎng)是機器人(robotic)細胞 培養(yǎng)器。在某些實施方案中，機器人細胞培養(yǎng)器包括多通道機器人移液器。在某些實施方 案中，多通道機器人移液器包括至少96個通道。在某些實施方案中，機器人細胞培養(yǎng)器進 一步包括擇優(yōu)挑選(cherry-picking)臂。在某些實施方案中，所述自動化方法包括下述中的一個或多個培養(yǎng)基去除、培養(yǎng) 基替換、細胞洗滌、試劑添加、細胞取出、細胞分散和細胞傳代。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少50 個培養(yǎng)物。在其他實施方案中，多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少100個培養(yǎng)物。在其他實施 方案中，多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少500個培養(yǎng)物。在另外其他的實施方案中，多個分離 的細胞培養(yǎng)物是至少1000個培養(yǎng)物。在某些實施方案中，生長速率通過選自下述的方法進行測定測量ATP、測量細胞 匯合、光散射、光密度測量。在某些實施方案中，組中最快和最慢的生長速率之間的差異不 超過1、2、3、4或5小時。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟C)中的培養(yǎng)是至少2天。在某些實施方案中，多個分離的細胞培養(yǎng)物的生長速率通過分散細胞且測量細胞 匯合進行測定。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法的每個分離的細胞培養(yǎng)物中的細胞在測 量細胞匯合前進行分散。在某些實施方案中，分散步驟包括將胰蛋白酶加入孔中并且消除 凝塊。在某些實施方案中，使用自動化微板讀取器測量多個分離的細胞培養(yǎng)物的細胞匯合。在某些實施方案中，在計算生長速率前進行至少2次匯合測量。在某些實施方案 中，通過自動化平板讀取器測量細胞匯合，并且匯合值與計算生長速率的軟件程序一起使 用。在某些實施方案中，在步驟d)中分離的細胞培養(yǎng)物就選自下述的所需性狀進行 表征脆性、形態(tài)、與固體表面的附著；缺乏與固體表面的附著和蛋白質(zhì)功能。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的細胞是真核細胞。在某些實施方案 中，在本發(fā)明的方法中使用的真核細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，哺乳動物細胞 系選自NS0細胞、CHO細胞、COS細胞、HEK-293細胞、HUVEC、3T3細胞和HeLa細胞。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中表達的目的蛋白質(zhì)是人蛋白質(zhì)。在某些實 施方案中，目的蛋白質(zhì)是異源多聚體。在某些實施方案中，目的蛋白質(zhì)是G蛋白偶聯(lián)受體。 在其他實施方案中，蛋白質(zhì)不具有已知配體。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法在鑒定步驟后進一步包括步驟a)在所需培養(yǎng)條件下擴增在步驟e)中鑒定的細胞培養(yǎng)物的貯藏等分試樣；b)測定a)的經(jīng)擴增的細胞培養(yǎng)物是否具有所需特征。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中克隆細 胞系具有相同細胞類型，并且其中實驗對象組中的每個細胞系表達目的蛋白質(zhì)，并且其中實驗對象組中的克隆細胞系相匹配，以共享相同生理特性，以允許平行加工。在某些實施方 案中，生理特性是生長速率。在其他實施方案中，生理特性是與組織培養(yǎng)表面附著。在其他 實施方案中，生理特性是Z'因子。在其他實施方案中，生理特性是編碼目的蛋白質(zhì)的RNA 的表達水平。在另外其他的實施方案中，生理特性是目的蛋白質(zhì)的表達水平。在某些實施方案中，實驗對象組中的克隆細胞系的生長速率在彼此的1、2、3、4或 5小時內(nèi)。在其他實施方案中，用于相匹配實驗對象組的培養(yǎng)條件對于實驗對象組中的所有 克隆細胞系都是相同的。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組中使用的克隆細胞系是真核細胞系。在 某些實施方案中，真核細胞系是哺乳動物細胞系。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組 中使用的細胞系細胞選自原代細胞和永生化細胞。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組中使用的細胞系細胞是原核生物或真核 生物的。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組中使用的細胞系細胞是真核生物的，并 且選自真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、藻類、甲殼類動物細胞、節(jié)肢動物細 胞、禽類細胞、爬行動物細胞、兩棲動物細胞和植物細胞。在某些實施方案中，在相匹配實 驗對象組中使用的細胞系細胞是哺乳動物的，并且選自人、非人靈長類動物、牛、豬、貓、大 鼠、有袋動物、鼠類、犬、綿羊、山羊、兔、豚鼠、倉鼠。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組的細胞系中的細胞進行改造以表達目的 蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組的細胞系中的細胞表達來自所引入核酸 的目的蛋白質(zhì)，所述所引入核酸編碼蛋白質(zhì)，或在多聚體蛋白質(zhì)的情況下，編碼蛋白質(zhì)的亞 單位。在某些實施方案中，細胞表達來自內(nèi)源核酸的目的蛋白質(zhì)，并且其中細胞進行改造以 激活內(nèi)源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，或在多聚體蛋白質(zhì)的情況下，激活蛋白質(zhì)的亞單位的轉(zhuǎn)錄。在某些實施方案中，實驗對象組包括至少4個克隆細胞系。在其他實施方案中，實 驗對象組包括至少6個克隆細胞系。在另外其他的實施方案中，實驗對象組包括至少25個 克隆細胞系。 在某些實施方案中，實驗對象組中的克隆細胞系中的2個或更多個表達相同目的 蛋白質(zhì)。在其他實施方案中，實驗對象組中的克隆細胞系中的2個或更多個表達不同目的 蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，實驗對象組中的細胞系表達不同形式的目的蛋白質(zhì)，其中所 述形式選自同種型、氨基酸序列變體、剪接變體、截短形式、融合蛋白、嵌合體或其組合。在某些實施方案中，實驗對象組中的細胞系表達一組目的蛋白質(zhì)中的不同蛋白 質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)組選自在相同信號傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)、相似蛋白質(zhì)的表達文 庫、單克隆抗體重鏈文庫、單克隆抗體輕鏈文庫和SNP。在某些實施方案中，在實驗對象組中表達的目的蛋白質(zhì)是單鏈蛋白質(zhì)。在某些實 施方案中，單鏈蛋白質(zhì)是G蛋白偶聯(lián)受體。在某些實施方案中，G蛋白偶聯(lián)受體是味覺受體。 在某些實施方案中，味覺受體選自苦味受體、甜味受體、咸味受體和鮮味受體。在其他實施方案中，在實驗對象組中表達的目的蛋白質(zhì)是多聚體蛋白質(zhì)。在某些 實施方案中，蛋白質(zhì)是異源二聚體或異源多聚體。在某些實施方案中，在實驗對象組中表達的目的蛋白質(zhì)選自離子通道、離子通 道、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受
17體。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組中表達的蛋白質(zhì)是上皮鈉通道(ENaC)。在某 些實施方案中，ENaC包括α亞單位、β亞單位和、亞單位。在其他實施方案中，在實驗 對象組中的細胞系表達不同ENaC同種型。在其他實施方案中，實驗對象組中的細胞系包括 ENaC的不同蛋白水解同種型。在某些實施方案中，ENaC是人ENaC。在某些實施方案中，在 相匹配實驗對象組中表達的蛋白質(zhì)是電壓門控的鈉通道(NaV)。在某些實施方案中，NaV包 括α亞單位和2個β亞單位。在某些實施方案中，NaV是人NaV。在某些實施方案中，在相匹配實驗對象組中表達的蛋白質(zhì)選自Y-氨基丁酸A受 體(GABAa受體)、Y -氨基丁酸B受體(GABAb受體)和γ -氨基丁酸C受體(GABAe受體)。 在某些實施方案中，蛋白質(zhì)是GABAa受體。在某些實施方案中，GABAa受體包括2個α亞單 位、2個β亞單位和γ或δ亞單位。在某些實施方案中，在實驗對象組中的克隆細胞系同時或在彼此不超過4周內(nèi)產(chǎn) 生。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了表達來自所引入核酸的目的單體蛋白質(zhì)的細 胞，所述所引入核酸編碼所述目的單體蛋白質(zhì)，其特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成 生物活性的形式的目的蛋白質(zhì)，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，并且 其中蛋白質(zhì)的表達經(jīng)過3個月改變不超過5%。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)的表達經(jīng)過6個 月改變不超過5%。在某些實施方案中，目的單體蛋白質(zhì)不具有已知配體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定目的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑的方法，其包括 步驟a)使根據(jù)上述細胞實施方案中任何一個的細胞與測試化合物接觸；和b)檢測相比于未與測試化合物接觸的細胞中的蛋白質(zhì)活性，與測試化合物接觸的 細胞中的目的蛋白質(zhì)活性中的改變；其中與在不存在的情況下相比較，在存在下產(chǎn)生活性中的差異的化合物是目的蛋 白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過先前段落的方法鑒定的調(diào)節(jié)劑。碰除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管下文描述了示例性方法和材料，但與本文描述的那些 相似或等價的方法和材料也可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用。在沖突的情況下，以本說 明書包括定義為準。本文提及的所有出版物和其他參考文獻通過引用整體合并。盡管本文引用了許多 文件，但這種引用并不構(gòu)成這些文件中的任何形成本領(lǐng)域的普通一般知識的部分的承認。本說明書和權(quán)利要求自始至終，單詞“包括”或變體例如“包含”或“含有”應(yīng)理解 為暗示包括所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)組。除非上下文另有要求，否 則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。材料、方法和例子僅是示例性的并且不 意欲是限制性的。為了本發(fā)明可以更容易地理解，首先定義了特定術(shù)語。另外的定義在詳述自始至 終闡述。術(shù)語“穩(wěn)定的”或“穩(wěn)定表達的”意欲使本發(fā)明的細胞和細胞系與瞬時表達蛋白質(zhì)
18的細胞區(qū)分，如術(shù)語“穩(wěn)定表達”和“瞬時表達”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。如本文所使用的，目的“功能”RNA或蛋白質(zhì)是在基于細胞的測定法中具有大于 1 1的信噪比的那種。在某些實施方案中，目的功能蛋白質(zhì)或RNA具有天然存在或內(nèi)源表 達的蛋白質(zhì)或RNA的一種或多種生物活性。術(shù)語“細胞系”或“克隆細胞系”指其為單一起源細胞的后代的細胞群體。如本文 所使用的，細胞系在體外在細胞培養(yǎng)中維持，并且可以以等分試樣冷凍以建立克隆細胞庫。術(shù)語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”描述用于使一種或多種核酸探針與核酸樣品 雜交且洗掉未與樣品中的靶核酸特異性結(jié)合的探針的溫度和鹽條件。嚴格條件是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的，并且可以在例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6. 3. 1-6. 3. 6中發(fā)現(xiàn)。水性和非水性的方法在方案中描述并且可以使用 任何一種。嚴格雜交條件的一個例子是在6X SSC中在約45°C下雜交，隨后為在0. 2X SSC、 0. 1% SDS中在60°C下的至少一次洗滌。嚴格雜交條件的另一個例子是在6X SSC中在約 45°C下雜交，隨后為在0. 2X SSC、0. 1% SDS中在65°C下的至少一次洗滌。嚴格雜交條件還 包括在0. 5M磷酸鈉、7% SDS中在65°C下雜交，隨后為在0. 2X SSCU % SDS下在65°C下的 至少一次洗滌。與氨基酸和/或核酸序列相關(guān)的短語“等同百分比”或“同一性百分比”指在至 少2個不同序列之間的相似性。同一性百分比可以通過標(biāo)準比對算法進行測定，例如， 由 Altshul 等人描述的 Basic LocalAlignment Tool (BLAST) ((1990) J. Mol. Biol.，215 403-410) ；Needleman 等人的算法((1970) J. Mol. Biol.，48 :444_453)；或 Meyers 等人的算 法((1988)Comput. Appl. Biosci.，4 :11_17)。一組參數(shù)可以是具有缺口罰分12、缺口延伸 罰分4和移碼缺口罰分5的Blosum 62評分矩陣。2個氨基酸或核苷酸序列之間的同一性 百分比還可以使用E. Meyers和W. Miller的算法((1989) CABI0S，4 11-17)進行測定，所述 算法已并入ALIGN程序(版本2.0)內(nèi)，使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分12和缺口 罰分4。同一性百分比通常通過比較相似長度的序列進行計算。蛋白質(zhì)分析軟件使相似氨基酸序列相匹配，其中使用對各種置換、缺失或其他修 飾包括保守氨基酸置換指定的相似性量度。例如，GCGWisconsin Package (Accelrys, Inc.) 包含諸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以與缺省參數(shù)一起用于測定緊密相關(guān)多肽之間 (例如來自不同物種的同源多肽)或野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白質(zhì)之間的序列同一性。參 見例如，GCG版本6. 1。多肽序列也可以使用FASTA進行比較，使用缺省或推薦參數(shù)。GCG版 本6. 1中的程序FASTA(例如，F(xiàn)ASTA2和FASTA3)提供了查詢和搜索序列之間的最佳重疊區(qū) 域的比對禾口序列同一'性百分比(Pearson，Methods Enzymol. 183 63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol. Biol. 132 185-219(2000))。就同一性比較的多肽序列的長度一般將是至少約16個氨基酸殘基，通常至少約 20個殘基，更通常至少約24個殘基，一般至少約28個殘基，和優(yōu)選超過約35個殘基。就同 一性比較的DNA序列的長度一般將是至少約48個核酸殘基，通常至少約60個核酸殘基，更 通常至少約72個核酸殘基，一般至少約84個核酸殘基，和優(yōu)選超過約105個核酸殘基。與氨基酸或核苷酸序列相關(guān)的短語“基本上如所示的”、“基本上等同的”或“基本 上同源的”意指，與比較器序列相比較，相關(guān)氨基酸或核苷酸序列將等同或不具有基本差異 (例如，保守氨基酸置換或編碼此種置換的核酸)。無基本差異包括較小的氨基酸改變，例如特定區(qū)域的50氨基酸序列和編碼那些序列的核酸中的1或2個置換。調(diào)節(jié)劑包括改變目的蛋白質(zhì)活性的任何物質(zhì)或化合物。調(diào)節(jié)劑可以是激動劑(增 效劑或激活劑)或拮抗劑(抑制劑或阻斷劑)，包括部分激動劑或拮抗劑、選擇激動劑或拮 抗劑和反激動劑，并且還可以是變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。即使物質(zhì)或化合物的調(diào)節(jié)活性在不同條件或 濃度下或就不同形式的目的蛋白質(zhì)而言改變，它也是調(diào)節(jié)劑。在其他方面，調(diào)節(jié)劑可以改變 另一種調(diào)節(jié)劑影響目的蛋白質(zhì)功能的能力。術(shù)語“增效劑”、“激動劑”或“激活劑”指增加目的蛋白質(zhì)的一種或多種活性的化 合物或物質(zhì)。術(shù)語“抑制劑”、“拮抗劑”或“阻斷劑”指減少或阻斷目的蛋白質(zhì)的一種或多種活 性的化合物或物質(zhì)。本發(fā)明首次提供了由細胞符合關(guān)于穩(wěn)定表達目的功能RNA或目的功能蛋白質(zhì)的 細胞的急切需要的細胞產(chǎn)生的新型細胞和細胞系，所述目的蛋白質(zhì)包括復(fù)雜蛋白質(zhì)例如異 源多聚體蛋白質(zhì)和關(guān)于其的配體未知的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的細胞和細胞系適合于其中需要目 的RNA或蛋白質(zhì)的一致的功能表達的任何用途。申請人已產(chǎn)生了符合這種描述的細胞系， 用于各種蛋白質(zhì)，單個亞單位和異源多聚體(包括異源二聚體和具有超過2個不同亞單位 的蛋白質(zhì))，包括膜蛋白質(zhì)、細胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)和分泌蛋白質(zhì)，以及這些的各種組合。在一個方面，本發(fā)明的細胞和細胞系適合于在基于細胞的測定法中使用。此類細 胞和細胞系提供隨著時間的過去目的蛋白質(zhì)的一致和重現(xiàn)性表達，并且因此在此類測定法 中是特別有利的。在另一個方面，本發(fā)明提供了適合于產(chǎn)生生物分子的細胞和細胞系。用于此類用 途的細胞和細胞系的特征在于例如蛋白質(zhì)或多肽的一致表達，所述蛋白質(zhì)或多肽是有功能 的或能夠變成有功能的。本發(fā)明進一步提供了用于產(chǎn)生穩(wěn)定表達目的RNA或蛋白質(zhì)的細胞和細胞系的方 法。使用本發(fā)明的方法，可以產(chǎn)生表達以功能形式的任何所需蛋白質(zhì)的細胞和細胞系，包括 復(fù)雜蛋白質(zhì)例如多聚體蛋白質(zhì)(例如異源多聚體蛋白質(zhì))和細胞毒性的蛋白質(zhì)。本文公開 的方法使得能夠產(chǎn)生在本發(fā)明前先前未產(chǎn)生的、穩(wěn)定表達功能蛋白質(zhì)的經(jīng)改造的細胞和細 胞系。不受理論束縛，認為因為該方法允許在任何所需條件組下研究非常大量的細胞或細 胞系，所以使得能夠鑒定罕見細胞，其在較小群體中未產(chǎn)生或無法以其他方式被發(fā)現(xiàn)，并且 最佳適合于在所需條件下表達以功能形式的所需蛋白質(zhì)。在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了細胞系的相匹配實驗對象組，即就一種或多 種生理特性相匹配的克隆細胞系的集合。因為本發(fā)明的方法允許在等同條件下維持和表征 大量細胞系，所以可以鑒定具有相似生理特性的任何數(shù)目的細胞系。使用本發(fā)明的方法，可 以制備包括任何所需數(shù)目的細胞系的相匹配實驗對象組或補足。此類相匹配實驗對象組可 以在等同條件包括細胞密度下維持，并且因此對于高通量篩選和其中需要比較且鑒定細胞 系之間的差異的其他用途有用。還在本發(fā)明內(nèi)的是就生長速率相匹配的細胞系的相匹配實 驗對象組。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生細胞或細胞系的方法，所述細胞或細胞系 表達具有先前未知功能和/或關(guān)于其的配體先前未得到鑒定的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可以是 已知的天然存在的蛋白質(zhì)、先前未知的天然存在的蛋白質(zhì)、已知的天然存在的蛋白質(zhì)的先前未知形式或前述任何的修飾形式。任何所需細胞類型都可以用于本發(fā)明的細胞。細胞可以是原核生物或真核生物 的。細胞可以表達以其天然狀態(tài)或非天然狀態(tài)的目的蛋白質(zhì)?？梢允褂玫恼婧思毎ǖ?不限于真菌細胞例如酵母細胞、植物細胞和動物細胞?？梢允褂玫膭游锛毎ǖ幌抻?哺乳動物細胞和昆蟲細胞。原代或永生化細胞可以衍生自真核生物體的中胚層、外胚層或 內(nèi)胚層。細胞可以是內(nèi)皮、表皮、間充質(zhì)、神經(jīng)、腎、肝、造血或免疫細胞。例如，細胞可以是 腸隱窩或絨毛細胞、克拉拉細胞、結(jié)腸細胞、腸細胞、杯狀細胞、腸嗜鉻細胞、腸內(nèi)分泌細胞。 在本發(fā)明中有用的哺乳動物細胞包括但不限于人、非人靈長類動物、牛、馬、山羊、綿羊、豬、 嚙齒類動物(包括大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠)、有袋動物、兔、犬和貓。細胞可以是分化細胞或 干細胞，包括胚胎干細胞。本發(fā)明的細胞可以是原代的、轉(zhuǎn)化的、致癌轉(zhuǎn)化的、病毒轉(zhuǎn)化的、永生化的、條件轉(zhuǎn) 化的、外植體、組織切片的細胞、動物、植物、真菌、原生生物、古細菌和真細菌、哺乳動物、 鳥類、魚類、爬蟲類動物、兩棲類動物和節(jié)肢動物、禽類、雞、爬行動物、兩棲動物、蛙、蜥蜴、 蛇、魚、蠕蟲、魷魚、龍蝦、海膽、海參、海鞘、蒼蠅、魷魚、水螅、節(jié)肢動物、甲蟲類、雞、七鰓鰻、 ricefish、斑胸草雀、河豚和斑馬魚。此外，細胞例如血液/免疫細胞、內(nèi)分泌(甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺)、GI (口、胃、 腸)、肝、胰腺、膽囊、呼吸道(肺、氣管、咽)、軟骨、骨、肌肉、皮膚、毛發(fā)、泌尿道(腎、膀胱)、 生殖(精子、卵子、睪丸、子宮、卵巢、陰莖、陰道)、感覺(眼、耳、鼻、口、舌、感覺神經(jīng)元)， 血液/免疫細胞例如B細胞、T細胞(細胞毒性T細胞、天然殺傷T細胞、調(diào)節(jié)T細胞、T輔 助細胞、T細胞、天然殺傷細胞；粒細胞(嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞/多 葉核(hypersegmented)嗜中性粒細胞)、單核細胞/巨噬細胞、紅血細胞(網(wǎng)織紅細胞)、 肥大細胞、凝血細胞/巨核細胞、樹突狀細胞；內(nèi)分泌細胞例如甲狀腺(甲狀腺上皮細胞、 濾泡旁細胞)、甲狀旁腺(甲狀旁腺主細胞、嗜酸細胞)、腎上腺(嗜鉻細胞)，神經(jīng)系統(tǒng)細 胞例如膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞)、大細胞神經(jīng)分泌細胞、星形細胞、核 鏈細胞、伯特徹氏細胞、腦下垂體(促性腺細胞、促皮質(zhì)激素細胞、促甲狀腺細胞、親軀體細 胞、催乳素細胞)，呼吸系統(tǒng)細胞例如肺細胞(I型肺細胞、II型肺細胞)、克拉拉細胞、杯狀 細胞；循環(huán)系統(tǒng)細胞例如心肌細胞、周細胞；消化系統(tǒng)細胞例如胃(胃主細胞、胃壁細胞)、 杯狀細胞、潘氏細胞、G細胞、D細胞、ECL細胞、I細胞、K細胞、腸內(nèi)分泌細胞、腸嗜鉻細胞、 APUD細胞、肝(肝細胞、肝巨噬細胞)、胰腺(β細胞、α細胞)、膽囊；軟骨/骨/肌肉/ 外皮系統(tǒng)細胞例如成骨細胞、骨細胞、破骨細胞，牙齒細胞(成牙骨質(zhì)細胞、成釉質(zhì)細胞)， 軟骨細胞成軟骨細胞、軟骨細胞、皮膚/毛發(fā)細胞絲胞(trichocyte)、角化細胞、黑色素 細胞，肌肉細胞肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞，泌尿系統(tǒng)細胞例如足細胞、腎小球旁細胞、 球內(nèi)系膜細胞/球外系膜細胞、腎近端小管刷狀緣細胞、致密斑細胞；生殖系統(tǒng)細胞例如精 子、支持細胞、萊迪希細胞、卵子、卵泡細胞；感覺細胞例如螺旋器細胞、嗅覺上皮、溫度敏感 的感覺神經(jīng)元、merckel細胞、嗅覺感受器神經(jīng)元、疼痛敏感的神經(jīng)元、感光細胞、味蕾細胞、 前庭器官的毛細胞、頸動脈體細胞用于制備本發(fā)明的細胞或細胞系。有用的植物細胞包括根、莖和葉以及植物組織包括分生組織、薄壁組織、厚角組 織、厚壁組織、分泌組織、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、周皮(樹皮)。對于本發(fā)明的細胞和細胞系有用的細胞也包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細
21胞、已建立的神經(jīng)元細胞系、嗜鉻細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、成纖維細胞、橫紋肌肉瘤、背根神 經(jīng)節(jié)細胞、NSO 細胞、CV-1(ATCC CCL 70)、C0S-1 (ATCC CRL 1650)、C0S-7 (ATCC CRL1651)、 CHO-Kl (ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I (ATCC CRL1616)、BS—C—1 (ATCC CCL 26)、MRC—5 (ATCC CCL 171)、L-細胞、 HEK-293 (ATCC CRL1573)禾口 PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T (ATCC CRL-11268), RBL (ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、MDCK (ATCC CCL-34)、SJ-RH30 (ATCCCRL-2061)、 HepG2 (ATCCHB-8065)、ND7/23 (ECACC 92090903)、CHO (ECACC 85050302)、Vero (ATCC CCL 81), Caco-2 (ATCCHTB 37)、K562 (ATCC CCL 243)、Jurkat (ATCC TIB-152)、Per. C6(Crucell> Leiden> The Netherlands) > Huvec (ATCC HumanPrimary PCS 100—010、 /]、 鼠 CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH_7D12 (ECACC 01042712)、293 (ATCC CRL 10852)、 A549 (ATCC CCL 185)、IMR-90 (ATCC CCL 186)、MCF-7 (ATCHTB-22)、U-20S (ATCC HTB-96)、 T84(ATCC CCL 248)、或任何已建立的細胞系(極化或非極化的)或可從儲庫例如美國典型 培養(yǎng)物中心(ATCC，10801 University Blvd. Manassas, Va. 20110-2209USA)或歐洲細胞培 養(yǎng)物中心(ECACC，Salisbury Wiltshire SP4 OJGEngland)獲得的任何細胞系。此外，在本發(fā)明的方法中有用的細胞是順應(yīng)在包含血清的培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、 無任何動物衍生產(chǎn)物的完全限定的培養(yǎng)基中生長的哺乳動物細胞，和可以從這些條件之一 轉(zhuǎn)換成另一種的細胞。本發(fā)明的細胞包括編碼目的蛋白質(zhì)的核酸(或在異源多聚體蛋白質(zhì)的情況下，編 碼蛋白質(zhì)的一個或多個亞單位的核酸)已引入其內(nèi)的細胞。經(jīng)改造的細胞還包括用于轉(zhuǎn)錄 激活編碼目的蛋白質(zhì)的內(nèi)源序列(或用于轉(zhuǎn)錄激活編碼異源多聚體蛋白質(zhì)的一個或多個 亞單位的內(nèi)源序列)的核酸已引入其內(nèi)的細胞。經(jīng)改造的細胞還包括包含編碼目的蛋白質(zhì) 的核酸的細胞，所述核酸通過與激活化合物接觸而被激活。經(jīng)改造的細胞進一步包括前述 的組合，即表達來自編碼其的所引入核酸的異源多聚體蛋白質(zhì)的一個或多個亞單位和通過 基因激活表達蛋白質(zhì)的一個或多個亞單位的細胞。任何核酸都可以使用已知方法引入細胞內(nèi)。用于將核酸引入細胞內(nèi)的技術(shù)是 技術(shù)人員眾所周知且容易理解的。方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、病毒遞送、蛋白質(zhì)或肽介導(dǎo) 的插入、共沉淀法、基于脂質(zhì)的遞送試劑(脂轉(zhuǎn)染)、cytofection、脂多胺遞送、樹枝狀 聚合物(dendrimer)遞送試劑、電穿孔或機械遞送。轉(zhuǎn)染試劑的例子是GENEP0RTER、 GENEP0RTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10, TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE, GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT, UNIFECTOR、SIFECT0R、 TRANS IT-LTU TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE、 LYOVEC, LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE, CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、 P0LYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT,SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CL0NFECTIN和 METAFECTINE。當(dāng)引入2種或更多種核苷酸序列，例如編碼異源多聚體蛋白質(zhì)的2種或更多種亞 單位的序列或編碼2種或更多種不同目的蛋白質(zhì)的序列時，序列可以在相同載體上或優(yōu)選 地在分離載體上引入。DNA可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其混合物。在某些實施方 案中，編碼目的蛋白質(zhì)或部分目的蛋白質(zhì)的核酸不包括另外的序列，從而使得目的蛋白質(zhì)與另外的氨基酸一起表達，與蛋白質(zhì)的生理功能相比較，所述另外的氨基酸可以改變細胞 的功能。在某些實施方案中，與編碼野生型蛋白質(zhì)的核酸序列相比較，編碼目的蛋白質(zhì)的 核酸包含一個或多個置換、插入、突變或缺失。在包括包含突變的核酸的實施方案中，突變 可以是隨機突變或定點突變。這些核酸改變可以導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸置換。在某些實施方 案中，核酸是編碼目的蛋白質(zhì)的核酸的片段。其為片段或具有此類修飾的核酸編碼保留目 的蛋白質(zhì)的至少一種生物活性的多肽。本發(fā)明還包括穩(wěn)定表達核酸的細胞和細胞系，所述核酸的序列與編碼目的蛋白質(zhì) 的“野生型”序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸或編碼與那些核酸中的任何的相同氨 基酸序列的核酸至少約85%等同。在某些實施方案中，與那些序列相比較，序列同一性是 至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。本發(fā)明還包括這樣的細胞和細胞系， 其中編碼目的蛋白質(zhì)的核酸在嚴格條件下與野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核 酸、或編碼與那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸雜交。在某些實施方案中，細胞或細胞系包括編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，與野生型序列、或 衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸、或編碼與那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸比 較，所述核酸序列包括至少一個置換。置換可以包括小于10、20、30或40個核苷酸，或高達 或等于1 %、5 %、10 %或20 %的核苷酸序列。在某些實施方案中，被置換的序列可以基本上 等同于野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸、或編碼與那些核酸中的任何的相 同氨基酸序列的核酸(例如與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高等同 的序列)，或是在嚴格條件下能夠與野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸、或編 碼與那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸雜交的序列。在某些實施方案中，細胞或細胞系包括編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，所述核酸序列包 括來自野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸、或編碼與那些核酸中的任何的相 同氨基酸序列的核酸的插入或缺失。插入或缺失可以小于10、20、30或40個核苷酸，或高 達或等于1%、5%、10%或20%的核苷酸序列。在某些實施方案中，插入或缺失的序列可 以基本上等同于野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核酸、或編碼與那些核酸中的 任何的相同氨基酸序列的核酸(例如與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 更高等同的序列)，或是在嚴格條件下能夠與野生型序列、或衍生自除人外的物種的對應(yīng)核 酸、或編碼與那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸雜交的序列。在某些實施方案中，核酸置換或修飾導(dǎo)致氨基酸改變，例如氨基酸置換。例如，目 的野生型蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或衍生自除人外的物種的配對氨基酸可以由保守或非保守 置換替換。在某些實施方案中，原始和經(jīng)修飾的氨基酸序列之間的序列同一性可以相差約 1%、5%、10%或20%，或不同于與其基本上等同的序列(例如與其至少85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高等同的序列)?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基由具有與親本氨基酸殘基具有相似化學(xué)性 質(zhì)(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基的另一個氨基酸殘基置換的那種。在其中2個或更多 個氨基酸序列彼此相差保守置換的情況下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上調(diào)整 以校正置換的保守性質(zhì)。用于進行此類調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例 如，Pearson, Methods Mol. Biol. 243 :307_31 (1994)。
含有具有相似化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸組的例子包括1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈 天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、 精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。 優(yōu)選的保守氨基酸置換組是纈氨酸_亮氨酸_異亮氨酸、苯丙氨酸_酪氨酸、賴氨酸_精 氨酸、丙氨酸_纈氨酸、谷氨酸鹽_天冬氨酸鹽和天冬酰胺_谷氨酰胺。備選地，保守氨基 酸置換是在Gonnet等人，Science 256:1443-45(1992)中公開的PAM250對數(shù)似然性矩陣 中具有陽性值的任何改變?！斑m度保守的”替換是在PAM250對數(shù)似然性矩陣中具有非負值 的任何改變。目的蛋白質(zhì)中的保守修飾將產(chǎn)生具有與未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的那些相似的功能和 化學(xué)特征的蛋白質(zhì)(gp，至少50%、60%、70%、80%、90%或95%相同)。在一個實施方案中，宿主細胞是胚胎干細胞，其隨后用作基礎(chǔ)用于產(chǎn)生生產(chǎn)目的 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。胚胎干細胞穩(wěn)定表達目的功能蛋白質(zhì)，可以直接植入到生物體內(nèi)，或 它們的核可以轉(zhuǎn)移到其他接受者細胞內(nèi)并且這些隨后可以進行植入，或它們可以用于制備 轉(zhuǎn)基因動物。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)可以在具有所需時間和/或組織特異性表達的動 物中表達。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，適合于與所選宿主細胞一起使用的任何載體可以 用于將編碼目的蛋白質(zhì)的核酸引入宿主細胞內(nèi)。當(dāng)超過一種載體用于例如引入2種或更多 種不同亞單位或者2種或更多種目的蛋白質(zhì)時，載體可以是相同類型或可以是不同類型?？梢杂糜趯⒑怂嵋胨拗骷毎麅?nèi)的載體的例子包括但不限于質(zhì)粒、病毒包括 逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒、粘粒、人工染色體，并且可以包括例如，pCMVScript、pcDNA3. 1 Hygro > pcDNA3. lneo、pcDNA3. Ipuro > pSV2neo、ρ I RES puro、pSV2 zeo。用于制備本發(fā) 明的細胞和細胞系的示例性哺乳動物表達載體包括PFN11A(BIND) Flexi ,pGL4. 31， pfc14a( HaloTag 7)cmv Flexi ，pFC14K( HaloTag 7)cmv Flexi , pFN24A( HaloTag 7)CMVd3 Flexi , pFN24K( HaloTag 7)CMVd3 Flexi , HaloTagTM pHT2, pACT, pAdVAntage , pALTER -MAX, pBIND, pCAT 3-Basic， pCAT 3-Control, pCAT 3-Enhancer, pCAT 3-Promoter, pCI, pCMVTNT , pG51uc, pSI, pTARGET , pTNT , pF12A RM Flexi , pF12K RM Flexi , pReg neo, PYES2/GS, pAd/CMV/V5-DEST Gateway Vector, pAd/PL-DEST Gateway 載體，Gateway pdest 27 載體，Gateway pef-dest51 載體，Gateway pcDNA -DEST47 載體，pCMV/Bsd 載體，pEF6/His A、B 禾口 c，pcDNA 6. 2-DEST，pLenti6/ TR, pLP-AcGFPl-C, pLPS-AcGFPl-N, pLP-IRESneo, pLP_TRE2， pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ 和 pLP-CMVneo。在某些實施方案中，載體包括表達控制序列例如組成型或條件啟動子，優(yōu)選地，使 用組成型啟動子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠選擇此類序列。例如，合適的啟動子包括但 不限于CMV、TK、SV40和EF-I α。在某些實施方案中，啟動子是誘導(dǎo)型、溫度調(diào)節(jié)型、組織特 異性、阻遏型、熱休克、發(fā)育、細胞譜系特異性、真核生物、原核生物或瞬時啟動子，或上述任 何一種或多種的未經(jīng)修飾的或經(jīng)誘變處理的、隨機化的、經(jīng)改組的序列的組合或重組。在其他實施方案中，目的蛋白質(zhì)通過基因激活表達或附加地表達。在某些實施方案中，載體缺乏可選標(biāo)記或藥物抗性基因。在其他實施方案中，載 體任選包括編碼可選標(biāo)記的核酸，例如賦予藥物或抗生素抗性的蛋白質(zhì)、或更一般地對細 胞施加選擇壓力的任何產(chǎn)物。當(dāng)使用超過一種載體時，每種載體可以具有相同或不同的藥 物抗性或其他選擇壓力標(biāo)記。如果超過一種藥物抗性或選擇壓力標(biāo)記是相同的，那么通過 增加藥物的水平可以實現(xiàn)同時選擇。合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包 括但不限于賦予針對下述任何一種的抗性的多肽產(chǎn)物新霉素/G418、嘌呤霉素、潮霉素、 Zeocin、氨甲蝶呤和殺稻瘟菌素。盡管藥物選擇(或使用任何其他合適選擇標(biāo)記的選擇) 不是產(chǎn)生本發(fā)明的細胞和細胞系中的所需步驟，但它可以用于就穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞富集經(jīng)轉(zhuǎn) 染的細胞群體，前提是轉(zhuǎn)染構(gòu)建體設(shè)計為賦予藥物抗性。如果使用信號傳導(dǎo)探針完成表達 目的蛋白質(zhì)的細胞的后續(xù)選擇，那么在轉(zhuǎn)染后太快的選擇可以導(dǎo)致可能僅是瞬時而不是穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染的某些陽性細胞。然而，通過允許足夠的細胞傳代以允許稀釋經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞中的瞬 時表達，可以將這種效應(yīng)降到最低。在某些實施方案中，編碼蛋白質(zhì)的核酸序列進一步包括標(biāo)簽。此類標(biāo)簽可以編碼 例如HIS標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、血凝素(HA)標(biāo)簽、蛋白質(zhì)C、VSV-G、FLU、黃色熒光蛋白(YFP)Jf 色熒光蛋白、FLAG、BCCP、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽、Nus-標(biāo)簽、Softag-I、Softag_2、Strep-標(biāo) 簽、S-標(biāo)簽、硫氧還蛋白、GST、V5、TAP或CBP。標(biāo)簽可以用作標(biāo)記以測定蛋白質(zhì)表達水平、 細胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、目的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)的功能。標(biāo)簽還可以用 于純化或分餾蛋白質(zhì)。在表達目的RNA的細胞和細胞系的情況下，RNA可以是任何類型，包括反義RNA、 小干擾RNA(siRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RNA、核不均一 RNA(hnRNA)和核小 RNA(snRNA)。在其中本發(fā)明的細胞和細胞系表達目的功能蛋白質(zhì)的實施方案中，蛋白質(zhì)可以是 任何蛋白質(zhì)，包括但不限于單鏈蛋白質(zhì)、多鏈蛋白質(zhì)、異源多聚體蛋白質(zhì)。在多聚體蛋白質(zhì) 的情況下，在某些實施方案中，細胞表達組成天然蛋白質(zhì)的所有亞單位。蛋白質(zhì)可以具有 “野生型”序列或可以是變體。在某些實施方案中，細胞表達包括一個或多個亞單位的變體 的蛋白質(zhì)，包括等位基因變體、剪接變體、截短形式、同種型、嵌合亞單位和突變形式，其包 括氨基酸置換(保守或非保守的)、經(jīng)修飾的氨基酸包括經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸和非天然存 在的氨基酸。由本發(fā)明的細胞或細胞系表達的異源多聚體蛋白質(zhì)可以包括來自2個或更多 個物種的亞單位，例如來自目的蛋白質(zhì)的物種同系物。在某些實施方案中，本發(fā)明的細胞表達2種或更多種目的功能蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā) 明，此類表達可以來自編碼全部或部分目的蛋白質(zhì)的核酸的引入，來自激活來自內(nèi)源序列 的全部或部分目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄的核酸的引入，或來自其任何組合。細胞可以表達任何所 需數(shù)目的目的蛋白質(zhì)。在多種實施方案中，細胞表達3、4、5、6或更多種目的蛋白質(zhì)。例如， 本發(fā)明考慮了這樣的細胞和細胞系，其穩(wěn)定表達目的途徑中的功能蛋白質(zhì)，來自交叉途徑 包括酶促途徑、信號傳導(dǎo)途徑、調(diào)節(jié)途徑等的蛋白質(zhì)。特別地，由方法中使用的細胞或細胞系表達的蛋白質(zhì)是關(guān)于其的穩(wěn)定功能細胞系 先前未獲得的蛋白質(zhì)。不受理論束縛，認為此類細胞系迄今仍不可能的某些原因包括蛋白 質(zhì)是高度復(fù)雜的并且如果不制備大量表達蛋白質(zhì)的細胞，仍不可能鑒定其中蛋白質(zhì)適當(dāng)裝配的細胞；或因為沒有已知的蛋白質(zhì)配體或調(diào)節(jié)劑用于鑒定表達功能形式的蛋白質(zhì)的細胞 或細胞系；或因為當(dāng)在其天然背景外表達時，例如在未天然表達其的背景中，蛋白質(zhì)是細胞 毒性的?？梢灾苽湟恢碌乇磉_細胞內(nèi)、表面或分泌的任何目的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的細胞和細 胞系。此類蛋白質(zhì)包括異源多聚體離子通道、配體門控的(例如GABA A受體)，離子通道 (例如CFTR)，異源多聚體離子通道、電壓門控的(例如NaV)，異源多聚體離子通道、非配 體門控的(上皮鈉通道，ENaC)，異源二聚體GPCR(例如阿片類受體、味覺受體包括甜、鮮和 苦)，其他GPCR，孤兒GPCR，GCC,阿片類受體，生長激素受體，雌激素/hgh，核或膜結(jié)合的， TGF受體，PPAR核激素受體，煙堿/Ach和免疫受體例如B細胞/T細胞受體。本發(fā)明的細胞和細胞系可以表達功能蛋白質(zhì)，包括表2-13中列出的任何蛋白質(zhì) 或蛋白質(zhì)的組合(哺乳動物G蛋白、人孤兒GPCR、人阿片類受體、人嗅覺感受器、犬嗅覺感受 器、蚊子嗅覺感受器、其他異源多聚體受體和GABA受體。本發(fā)明的細胞和細胞系具有使得它們對于這樣的任何用途特別有利的許多屬性， 在所述任何用途中希望細胞隨著時間的過去提供目的功能蛋白質(zhì)的一致表達。術(shù)語“穩(wěn)定 的”或“一致的”當(dāng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的表達和蛋白質(zhì)的功能時，意欲使本發(fā)明的細胞和細胞系 和具有瞬時表達或可變功能的細胞區(qū)分，如由本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的術(shù)語“穩(wěn)定表達” 和“瞬時表達”。本發(fā)明的細胞或細胞系具有功能蛋白質(zhì)的穩(wěn)定或一致表達，其對于至少2-4 天具有小于10%的變異。在多種實施方案中，本發(fā)明的細胞或細胞系表達目的功能RNA或蛋白質(zhì)，即在生 長至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200天或超過200天后，細胞是一致地有功能的，其中一致表達或一致地有功 能的指，經(jīng)過2-4天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、 8% 9%或10% ；經(jīng)過5-15天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、4%、6%、8%、 10%或12% ；經(jīng)過16-20天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、4%、6%、8%、 10 %、12 %、14 %、16 %、18 %或20 % ；經(jīng)過21-30天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過 1%>2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18%,20%,22%,24% ；經(jīng)過 30-40 天連續(xù) 細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過 1% >2%,4%,6%,8% ,10% ,12% ,14% ,16% ,18%,20%, 22%、24%、26%、28%或30%;經(jīng)過41-45天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1 %、2%、 4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28% 或 30%;經(jīng)過 45-50 天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、 18%、20%、22%、24%、26%、28%或30% ；經(jīng)過45-50天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不 超過 1 %、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28%、 30 %或35 % ；經(jīng)過50-55天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、4%、6%、8%、 10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%、28% 或 30% 或 35% ；經(jīng)過 50-55 天 連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、 20 %、22 %、24 %、26 %、28 %、30 %或35 % ；經(jīng)過55-75天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超 過 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35% 或 40% ；經(jīng)過 75-100 天連續(xù) 細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35 %、40 %或45 % ；經(jīng)過101-125天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、3%、4%、 5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或 45% ；經(jīng)過 126-150 天連續(xù)細胞培養(yǎng)， 表達水平改變不超過 1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40% 或45% ；經(jīng)過151-175天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、3%、4%、5%、5%、 10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %或45 % ；經(jīng)過176-200天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平 改變不超過1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%;經(jīng) 過超過200天連續(xù)細胞培養(yǎng)，表達水平改變不超過1%、2%、3%、4%、5%、5%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40% 或 45%?？梢赃x擇具有所需性質(zhì)加上功能蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達的細胞?？梢赃x擇可以檢測出 的任何所需性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道此類特征。作為非限制性例子，此類性質(zhì)包括脆性，形態(tài)和與固體表面的附著，通過胰蛋白酶或細胞解離試劑的單分散性，對自 動化培養(yǎng)條件的適應(yīng)性，在含血清條件下的表現(xiàn)，在無血清條件下的表現(xiàn)，對無血清懸浮條 件的可轉(zhuǎn)換性，形成凝塊的傾向，在傳代后形成單分散的細胞層的傾向，恢復(fù)力，在不同力 量的流動添加步驟下保持與生長室表面附著的傾向，未破碎的核，細胞內(nèi)空泡的缺乏，微生 物污染的缺乏，支原體屬的缺乏，病毒污染的缺乏，克隆形成能力，細胞在孔內(nèi)的肉眼可見 物理性質(zhì)的一致性，關(guān)于在室溫以下/室溫/室溫以上生長的傾向，關(guān)于耐受各種溫度以各 種時間段的傾向，細胞平衡攝取質(zhì)粒/寡核苷酸/熒光探針/肽/蛋白質(zhì)/化合物的傾向， 細胞經(jīng)受住與DMSO/EtOH/MeOH、有機溶劑/洗滌劑一起溫育的傾向，細胞經(jīng)受住維持的UPR 誘導(dǎo)的傾向，細胞經(jīng)受住暴露于DTT的傾向，細胞被病毒/慢病毒/粘粒載體感染的傾向， 所需一種或多種RNA/ —種或多種蛋白質(zhì)的內(nèi)源表達或其缺乏，染色體數(shù)目，染色體異常， 順應(yīng)在5/6/7/8/9pH下生長，對UV/誘變劑/輻射的耐受性，在改變/人工/按比例增加的 生長條件(即包括反應(yīng)器)下維持上述特征的能力。與通過常規(guī)方法制備的細胞和細胞系相比較，本發(fā)明的細胞和細胞系具有增強的 性質(zhì)。例如，本發(fā)明的細胞和細胞系具有增強的表達穩(wěn)定性和/或表達水平(甚至在無選 擇壓力的培養(yǎng)中維持時，所述選擇壓力包括例如抗生素和其他藥物)。在其他實施方案中， 本發(fā)明的細胞和細胞系在多種測定法中具有高Z'值。在另外其他的實施方案中，與更常規(guī) 改造的細胞相比較，本發(fā)明的細胞和細胞系在其生理學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)活性的表達背景中得 到改善。這些性質(zhì)增強且改善本發(fā)明的細胞和細胞系用于任何用途的能力，無論在鑒定調(diào) 節(jié)劑的測定法中、用于細胞療法、用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)還是任何其他用途，并且改善經(jīng)鑒定的調(diào) 節(jié)劑的功能屬性。本發(fā)明的細胞和細胞系的進一步有利的性質(zhì)是它們在不存在藥物或其他選擇壓 力的情況下穩(wěn)定表達目的蛋白質(zhì)。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細胞和細胞系維 持在無任何選擇壓力的培養(yǎng)中。在進一步的實施方案中，細胞和細胞系無需任何藥物或抗 生素而維持。如本文所使用的，細胞維持指在它們已如對于蛋白質(zhì)表達所述進行選擇后培 養(yǎng)細胞。維持不指在細胞分選前在選擇壓力(例如抗生素)下生長細胞的可選步驟，在所 述細胞分選中，引入細胞內(nèi)的一種或多種標(biāo)記允許富集混合群體中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。本發(fā)明的細胞和細胞系無藥物和無選擇壓力的細胞維持提供許多優(yōu)點。例如， 藥物抗性細胞可能不以足夠水平表達共轉(zhuǎn)染的目的轉(zhuǎn)基因，因為選擇依賴于已攝取藥物 抗性基因、連同或不連同轉(zhuǎn)基因的細胞的存活。此外，選擇藥物和其他選擇壓力因素通
27常是致誘變的或以其他方式干擾細胞的生理學(xué)，導(dǎo)致在基于細胞的測定法中的偏差結(jié) 果。例如，選擇藥物可以降低對凋亡的敏感性(Robinson等人，Biochemistry, 36 (37) 11169-11178(1997))，增加 DNA 修復(fù)和藥物代謝(Deffie 等人，Cancer Res. 48(13) 3595-3602(1988))，增加細胞 pH(Thiebaut 等人，J Histochem Cytochem. 38(5) 685-690(1990) ；Roepe 等人，Biochemistry. 32(41) 11042-11056(1993) ；Simon 等 人，Proc Natl Acad Sci U S A. 91(3) 1128-1132 (1994))，降低溶酶體和胞內(nèi) 體 pH(Schindler 等人，Biochemistry. 35(9) :2811_2817 (1996) ；Altan 等人，J Exp Med. 187(10) 1583-1598 (1998)),降低質(zhì)膜電位(Roepe 等人，Biochemistry. 32(41) 11042-11056(1993))，增加對氯化物(Gill 等人，Cell. 71 (1) =23-32(1992))和 ATP (Abraham等人，Proc Natl Acad Sci US A. 90(1) :312_316 (1993))的質(zhì)膜電導(dǎo)，和增加 囊泡轉(zhuǎn)運的速率(Altan 等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8) :4432_4437 (1999))。因 此，本發(fā)明的細胞和細胞系允許不含由選擇壓力引起的假象的篩選測定法。在某些優(yōu)選實 施方案中，在細胞分選前或后，本發(fā)明的細胞和細胞系不與選擇壓力因素例如抗生素一起 培養(yǎng)，從而使得即使當(dāng)未從富集細胞群體開始時，也通過分選來分離具有所需性質(zhì)的細胞 和細胞系。在表達和表達水平(RNA或蛋白質(zhì))的背景中，與通過常規(guī)方法產(chǎn)生的細胞和細胞 系相比較，本發(fā)明的細胞和細胞系具有增強的穩(wěn)定性。為了鑒定特征在于此類穩(wěn)定表達的 細胞和細胞系，經(jīng)過時間過程測量細胞或細胞系的目的蛋白質(zhì)表達，并且比較表達水平。穩(wěn) 定細胞系將在時間過程自始至終繼續(xù)表達(RNA或蛋白質(zhì))。在本發(fā)明的某些方面，時間過 程可以是至少1周、2周、3周等，或至少1個月、或至少2、3、4、5、6、7、8或9個月，或兩者之 間的任何時間長度。經(jīng)分離的細胞和細胞系可以例如通過PCR、RT-PCR、qRT_PCR和單終末點RT-PCR進 行進一步表征，以測定被表達(RNA)的絕對量和相對量(在多亞單位蛋白質(zhì)或多重目的蛋 白質(zhì)的情況下)。優(yōu)選地，多亞單位蛋白質(zhì)的亞單位的擴增水平在本發(fā)明的細胞和細胞系中 基本上是相同的。在其他實施方案中，隨著時間的過去測定目的功能蛋白質(zhì)的表達。在這些實施方 案中，通過比較功能測定法經(jīng)過時間過程的結(jié)果來測量穩(wěn)定表達?；诠δ軠y定法的細胞 和細胞系的測定提供鑒定這樣的細胞和細胞系的益處，所述細胞和細胞系不僅穩(wěn)定表達蛋 白質(zhì)(RNA或蛋白質(zhì))，還穩(wěn)定產(chǎn)生且適當(dāng)加工(例如，翻譯后修飾、亞單位裝配和在細胞內(nèi) 的定位)蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)。本發(fā)明的細胞和細胞系具有提供具有高重現(xiàn)性的測定法的進一步有利性質(zhì)，如由 其 Z'因子證明的。參見 Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, “ A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluationand Validation of High Throughput Screening Assays. “ J. Biomol. Screen. 1999 ；4(2) :67_73，所述參考文獻通過引用整體合并入本文。 Z'值涉及細胞或細胞系的品質(zhì)，因為它反映細胞或細胞系將一致地響應(yīng)調(diào)節(jié)劑的程度。 Z'是考慮到跨越多孔平板對參考化合物的功能應(yīng)答的信噪比范圍和信號變異性(即，從 孔到孔之間)的統(tǒng)計計算。使用得自具有陽性對照的多個孔和具有陰性對照的多個孔的 Z'數(shù)據(jù)計算Z'。根據(jù)下式其組合的標(biāo)準差的比乘以3至差異因子，用1減去其平均值以 得到Z'
V Ι3 = 1_((3σ陽性對照+3 σ陰性對照)/(μ陽性對照_口陰性對照))如果因子是1. 0，這將指示具有理論最大V的理想測定法，無變異性和無限的動 態(tài)范圍。如本文所使用的，“高Z' ”指具有至少0.6、至少0.7、至少0.75或至少0.8、或0.6 至1.0之間的任何小數(shù)的Z'因子。在復(fù)雜靶的情況下，高Z'意指至少0.4或更大的Z'。 接近于0的得分是不希望的，因為它指示在陽性和陰性對照之間存在重疊。在工業(yè)中，對于 簡單的基于細胞的測定法，直到0.3的Z'得分被視為邊緣得分，0.3至0.5的Z'得分表示 為可接受的，并且超過0. 5的Z'得分表示為極佳的。無細胞或生物化學(xué)測定法可以接近關(guān) 于基于細胞的系統(tǒng)的得分，因為更高的Z'得分而趨于更低，但基于Z'細胞的系統(tǒng)是復(fù)雜 的。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認識到的，使用表達甚至單鏈蛋白質(zhì)的常規(guī)細胞的基于 細胞的測定法一般也未達到高于0.5至0.6的Z'。即使在本領(lǐng)域中得到報告，由于其添加 的復(fù)雜性，具有多亞單位蛋白質(zhì)的改造表達(來自所引入編碼序列或基因激活)的細胞也 將更低。此類細胞對于在測定法中的使用將是不可靠的，因為結(jié)果將不是可重現(xiàn)性的。另一 方面，本發(fā)明的細胞和細胞系具有更高的Z'值，并且有利地在測定法中產(chǎn)生一致的結(jié)果。 事實上，本發(fā)明的細胞和細胞系提供用于高通量篩選(HTS)相容測定法的基礎(chǔ)，因為它們 一般具有與常規(guī)產(chǎn)生的細胞不同的值。在本發(fā)明的某些方面，細胞和細胞系導(dǎo)致至少0.3、 至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z'。對于本發(fā)明的細胞和細胞系，甚 至至少0.3-0. 4的Z'值也是有利的，因為目的蛋白質(zhì)是多基因靶。在本發(fā)明的其他方面， 即使在細胞維持多次傳代后，例如，在5-20代之間，包括在5和20之間的任何整數(shù)，本發(fā)明 的細胞和細胞系也導(dǎo)致至少0. 7、至少0. 75或至少0. 8的Z'。在本發(fā)明的某些方面，在維 持1、2、3、4或5周或2、3、4、5、6、7、8或9個月的細胞和細胞系中，包括兩者之間的任何時 間段，細胞和細胞系導(dǎo)致至少0. 7、至少0. 75或至少0. 8的Z'。在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的細胞和細胞系的方法。在 一個實施方案中，該方法包括步驟a)提供表達編碼目的蛋白質(zhì)的mRNA的多個細胞；b)將細胞單個分散到單個培養(yǎng)器皿內(nèi)，從而產(chǎn)生多個分離的細胞培養(yǎng)物；c)使用自動化細胞培養(yǎng)法在一組所需培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，所述自動化細胞培 養(yǎng)法的特征在于所述條件對于分離的細胞培養(yǎng)物各自是基本上等同的，在這個培養(yǎng)過程中 使細胞數(shù)目/分離的細胞培養(yǎng)物進行標(biāo)準化，并且其中分離培養(yǎng)物根據(jù)相同時間表進行傳 代；d)就目的蛋白質(zhì)的至少一種所需特征測定分離的細胞培養(yǎng)物至少2次；和e)鑒定在2種測定法中都具有所需特征的分離的細胞培養(yǎng)物。根據(jù)該方法，細胞在所需培養(yǎng)條件組下進行培養(yǎng)。條件可以是任何所需條件。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解在一組培養(yǎng)條件內(nèi)包括何種參數(shù)。例如，培養(yǎng)條件包括但不限于培 養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM、MEM、RPMI、無血清、含血清、完全化學(xué)成分限定的、無動物衍生的 組分)，單和二價離子(鈉、鉀、鈣、鎂)濃度，加入的另外組分(氨基酸、抗生素、谷氨酰胺、 葡萄糖或其他碳源、HEPES、通道阻斷劑、其他靶的調(diào)節(jié)劑，維生素，微量元素，重金屬，輔因 子，生長因子、抗凋亡試劑)，新鮮或條件培養(yǎng)基，具有HEPES，pH，特定營養(yǎng)素耗盡或限制性 的(氨基酸、碳源))，在分裂/傳代前允許細胞達到的匯合水平，細胞的飼養(yǎng)層，或Y輻射的細胞，CO2，三氣系統(tǒng)(氧、氮、二氧化碳)，濕度，溫度，靜止或在振蕩器上等，這將是本領(lǐng)域 技術(shù)人員眾所周知的。細胞培養(yǎng)條件可以為了方便起見或為了細胞的特定所需用途而選擇。有利地，本 發(fā)明提供了最佳適合于特定所需用途的細胞和細胞系。即，在其中細胞在用于特定所需用 途的條件下進行培養(yǎng)的本發(fā)明的實施方案中，選擇在用于特定所需用途的條件下具有所需 特征的細胞。作為舉例說明，如果細胞將在其中希望細胞是粘附的測定法中在平板中使用，那 么可以選擇在測定法的條件下顯示粘附的細胞。類似地，如果細胞將用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，那么 細胞可以在適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的條件下進行培養(yǎng)，并且就關(guān)于這個用途的有利性質(zhì)進行選 擇。在某些實施方案中，該方法包括測量分離的細胞培養(yǎng)物的生長速率的另外步驟。 可以使用技術(shù)人員眾所周知的多種技術(shù)方法中的任何一種測定生長速率。此類技術(shù)包括但 不限于測量ATP、細胞匯合、光散射、光密度(例如，OD 260用于DNA)。優(yōu)選地，使用使培養(yǎng) 物在所選擇的培養(yǎng)條件外花費的時間量降到最低的方法測定生長速率。在某些實施方案中，測量細胞匯合，并且根據(jù)匯合值計算生長速率。在某些實施方 案中，在測量細胞匯合前使細胞分散并且去除凝塊用于改善的準確度。用于使細胞單分散 的方法是眾所周知的，并且可以例如通過向待測量的培養(yǎng)物中加入分散劑來實現(xiàn)。分散劑 是眾所周知且容易獲得的，并且包括但不限于，酶促分散劑例如胰蛋白酶，和基于EDTA的 分散劑。使用用于這個用途的商購可得的軟件例如HAMILTON VECTOR,根據(jù)匯合日期可以計 算生長速率。例如使用自動化微板讀取器的自動化匯合測量是特別有用的。測量匯合的平 板讀取器是商購可得的，并且包括但不限于，CLONE SELECT IMAGER(Genetix)。一般地，在 計算生長速率前進行細胞匯合的至少2次測量。用于測定生長速率的匯合值的數(shù)目可以是 方便的或適合于培養(yǎng)的任何數(shù)目。例如，匯合可以經(jīng)過例如1周、2周、3周或任何時間段且 以任何所需頻率測量多次。當(dāng)生長速率是已知的時，根據(jù)該方法，通過生長速率的相似性將多個分離的細胞 培養(yǎng)物分成組。通過將培養(yǎng)物分組到生長速率框內(nèi)，可以一起處理組中的培養(yǎng)物，從而提供 減少培養(yǎng)物之間的變異的另一個標(biāo)準化水平。例如，框中的培養(yǎng)物可以同時進行傳代，同時 用所需試劑進行處理等等。此外，功能測定法結(jié)果一般依賴于測定孔中的細胞密度。單個 克隆的真實比較僅通過使其鋪平板且以相同密度進行測定來完成。分組成特定生長速率同 期組群(cohorts)使得克隆能夠以特定密度鋪平板，這允許它們以高通量形式在功能上進 行表征。每個組中的生長速率范圍可以是任何方便的范圍。選擇允許細胞同時被傳代且避 免細胞數(shù)目的頻繁重新標(biāo)準化的生長速率范圍是特別有利的。生長速率組可以包括非常窄 的范圍用于緊密分組，例如，在彼此1小時內(nèi)的平均倍增時間。但根據(jù)該方法，范圍可以彼 此直到2小時、直到3小時、直到4小時、直到5小時或直到10小時或甚至更廣泛的范圍。 當(dāng)框中的生長速率不相同，從而使得某些培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目增加得比其他的快時，出現(xiàn) 關(guān)于重新標(biāo)準化的需要。為了維持用于框中的所有培養(yǎng)物的基本上等同的條件，必須定期 取出細胞以重新標(biāo)準化跨越框的數(shù)目。生長速率越不等，就需要越頻繁地重新標(biāo)準化。在步驟d)中，細胞和細胞系可以就任何生理特性進行測試且選擇，所述生理特性
30包括但不限于由基因組編碼的細胞過程中的改變；由基因組調(diào)節(jié)的細胞過程中的改變； 染色體活性模式中的改變；染色體沉默模式中的改變；基因沉默模式中的改變；基因激活 模式或效率中的改變；基因表達模式或效率中的改變；RNA表達模式或效率中的改變；RNAi 表達模式或效率中的改變；RNA加工模式或效率中的改變；RNA轉(zhuǎn)運模式或效率中的改變； 蛋白質(zhì)翻譯模式或效率中的改變；蛋白質(zhì)折疊模式或效率中的改變；蛋白質(zhì)裝配模式或效 率中的改變；蛋白質(zhì)修飾模式或效率中的改變；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運模式或效率中的改變；使膜蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞表面的模式或效率中的改變；生長速率中的改變；細胞大小中的改變；細 胞形狀中的改變；細胞形態(tài)中的改變；RNA含量％中的改變；蛋白質(zhì)含量％中的改變；含水 量％中的改變；脂質(zhì)含量％中的改變；核糖體含量中的改變；線粒體含量中的改變；ER質(zhì)量 中的改變；質(zhì)膜表面積中的改變；細胞體積中的改變；質(zhì)膜的脂質(zhì)組成中的改變；核被膜的 脂質(zhì)組成中的改變；質(zhì)膜的蛋白質(zhì)組成中的改變；核被膜的蛋白質(zhì)組成中的改變；分泌囊 泡數(shù)目中的改變；溶酶體數(shù)目中的改變；空泡數(shù)目中的改變；細胞關(guān)于下述的能力或潛力 中的改變蛋白質(zhì)生產(chǎn)，蛋白質(zhì)分泌，蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)裝配，蛋白質(zhì)修飾，蛋白質(zhì)的酶促 修飾，蛋白質(zhì)糖基化，蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)去磷酸化，代謝產(chǎn)物生物合成，脂質(zhì)生物合成， DNA合成，RNA合成，蛋白質(zhì)合成，營養(yǎng)素吸收，細胞生長，有絲分裂，減數(shù)分裂，細胞分裂，去 分化，轉(zhuǎn)化成干細胞，轉(zhuǎn)化成多潛能細胞，轉(zhuǎn)化成全能細胞，轉(zhuǎn)化成任何器官(即，肝、肺、皮 膚、肌肉、胰腺、腦、睪丸、卵巢、血液、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 胃腸道、胃、甲狀腺、舌、膽囊、腎、鼻、眼、趾甲、毛發(fā)、味蕾)的干細胞類型，轉(zhuǎn)化成分化的任 何細胞類型(即，肌肉、心肌、神經(jīng)元、皮膚、胰腺、血液、免疫、紅血細胞、白血細胞、殺傷T細 胞、腸內(nèi)分泌細胞、味覺、分泌細胞、腎、上皮細胞、內(nèi)皮細胞，還包括可以用于引入核酸序列 的已列舉的任何動物或人細胞類型)，攝取DNA，攝取小分子，攝取熒光探針，攝取RNA，與固 體表面附著，適應(yīng)無血清條件，適應(yīng)無血清懸浮條件，適應(yīng)按比例增加的細胞培養(yǎng)，用于大 規(guī)模細胞培養(yǎng)的用途，用于在藥物開發(fā)中使用，用于在高通量篩選中使用，用于在基于功能 細胞的測定法中使用，用于在膜電位測定法中使用，用于在鈣流測定法中使用，用于在G蛋 白受體測定法中使用，用于在基于報道細胞的測定法中使用，用于在ELISA研究中使用，用 于在體外測定法中使用，用于在體內(nèi)應(yīng)用中使用，用于在二次測試中使用，用于在化合物測 試中使用，用于在結(jié)合測定法中使用，用于在淘選測定法中使用，用于在抗體淘選測定法中 使用，用于在成像測定法中使用，用于在顯微成像測定法中使用，用于在多孔平板中使用， 用于適應(yīng)自動化細胞培養(yǎng)，用于適應(yīng)小型化自動化細胞培養(yǎng)，用于適應(yīng)大規(guī)模自動化細胞 培養(yǎng)，用于適應(yīng)在多孔平板(6、12、24、48、96、384、1536或更高密度)中的細胞培養(yǎng)，用于 在細胞芯片中使用，用于在載玻片上使用，用于在玻璃載玻片上使用，用于在載玻片或玻璃 載玻片上的微陣列，用于免疫熒光研究，用于在蛋白質(zhì)純化中使用，用于在生物制品生產(chǎn)中 使用，用于在工業(yè)酶生產(chǎn)中使用，用于在用于研究的試劑生產(chǎn)中使用，用于在疫苗開發(fā)中使 用，用于在細胞療法中使用，用于在植入動物或人內(nèi)使用，用于在由細胞分泌的因子分離中 使用，用于cDNA文庫的制備，用于RNA的純化，用于DNA的純化，用于經(jīng)由病原體、病毒或其 他因子感染，用于對經(jīng)由病原體、病毒或其他因子感染的抵抗力，用于對藥物的抵抗力，用 于在自動化小型化細胞培養(yǎng)條件下維持的適合性，用于在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中用于表征，包括蛋 白質(zhì)晶體學(xué)、疫苗開發(fā)、免疫系統(tǒng)的刺激、抗體生產(chǎn)或抗體的產(chǎn)生或測試。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將容易認識到用于上文列出的特性中的任何一種的合適測試。
可以用于表征本發(fā)明的細胞和細胞系和/或本發(fā)明的相匹配實驗對象組的測試 包括但不限于氨基酸分析、DNA測序、蛋白質(zhì)測序、NMR、用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的測試、用于核質(zhì) 轉(zhuǎn)運的測試、用于蛋白質(zhì)的亞細胞定位的測試、用于核酸的亞細胞定位的測試、顯微分析、 亞顯微分析、熒光顯微鏡檢查、電子顯微鏡檢查、共焦顯微鏡檢查、激光消融技術(shù)、細胞計數(shù) 和透析。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解如何使用上文列出的測試中的任何一種。當(dāng)產(chǎn)生細胞或細胞系的集合或?qū)嶒瀸ο蠼M例如用于藥物篩選時，集合或?qū)嶒瀸ο?組中的細胞或細胞系可以這樣相匹配，使得它們就一種或多種選擇的生理特性而言是相同 的(包括基本上相同的)。在這個背景中的“相同生理特性”意指所選擇的生理特性在集合 或?qū)嶒瀸ο蠼M中的成員當(dāng)中是足夠相似的，從而使得細胞集合或?qū)嶒瀸ο蠼M可以在藥物篩 選測定法中產(chǎn)生可靠結(jié)果；例如，藥物篩選測定法中的讀數(shù)中的變異將是由于例如測試化 合物對表達不同形式的蛋白質(zhì)的細胞的不同生物活性，而不是由于細胞中的固有變異。例 如，細胞或細胞系可以相匹配以具有相同生長速率，即在細胞集合或?qū)嶒瀸ο蠼M的成員當(dāng) 中具有不超過1、2、3、4或5小時差異的生長速率。例如通過經(jīng)由其生長速率將細胞框并 成5、6、7、8、9或10個組，并且使用來自相同框并組的細胞產(chǎn)生實驗對象組，可以實現(xiàn)這點。 測定細胞生長速率的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。實驗對象組中的細胞或細胞系還可以相匹 配，以具有相同Z'因子(例如，相差不超過0.1的Z'因子)、蛋白質(zhì)表達水平(例如，相差 不超過5%、10%、15%、20%、25%或30%的CFTR表達水平)、RNA表達水平、與組織培養(yǎng)表 面的附著等。相匹配的細胞和細胞系可以在通過例如自動化平行加工實現(xiàn)的等同條件下生 長，以維持所選擇的生理特性。在一個實施方案中，實驗對象組就在相同條件組下的生長速率相匹配。此類實驗 對象組在本文中也稱為相匹配實驗對象組，對于在廣泛范圍的基于細胞的研究中使用是高 度希望的，在所述研究中希望跨越2種或更多種細胞系比較實驗變量的效應(yīng)。就生長速率 相匹配的細胞系隨著時間的過去維持大致相同的細胞數(shù)目/孔，從而減少生長條件例如實 驗對象組中的細胞系之間的營養(yǎng)素含量中的變異。根據(jù)本發(fā)明，相匹配實驗對象組可以具有在任何所需范圍內(nèi)的生長速率，依賴于 許多因素，包括細胞的特征、實驗對象組的預(yù)期用途、實驗對象組的大小、培養(yǎng)條件等。此類 因素將是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。生長速率可以通過任何合適和方便的方法進行測定，唯一要求是關(guān)于相匹配實驗 對象組的所有細胞系的生長速率通過相同方法進行測定。用于測定生長速率的眾多方法是 已知的，如本文所描述的。本發(fā)明的相匹配實驗對象組可以包括任何數(shù)目的克隆細胞系。在實驗對象組中的 克隆細胞系的最大數(shù)目對于每個用途和用戶都不同，并且可以與可以維持的一樣多。在多 種實施方案中，實驗對象組可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個克隆細胞系，例如至 少12、至少15、至少20、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少48、至少 50、至少75、至少96、至少100、至少200、至少300、至少384、至少400個或更多個克隆細胞 系。根據(jù)本發(fā)明，實驗對象組包括多個克隆細胞系，即由不同的單一親本細胞產(chǎn)生的 多個細胞系。任何所需細胞類型都可以用于產(chǎn)生相匹配實驗對象組。實驗對象組可以包括 所有相同類型的細胞系或不同細胞類型的細胞系。
實驗對象組中的克隆細胞系穩(wěn)定表達一種或多種目的蛋白質(zhì)。穩(wěn)定表達可以是任 何時間段，其適合于實驗對象組的所需用途，但最低限度地，足夠長以允許在相匹配實驗對 象組中選擇和使用。在相匹配實驗對象組中的克隆細胞系可以全部表達相同的一種或多種目的蛋白 質(zhì)，或?qū)嶒瀸ο蠼M中的某些克隆細胞系可以表達不同目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，相匹配實驗對象組包括表達不同目的蛋白質(zhì)的一個或多個克 隆細胞系。即，實驗對象組中的第一個克隆細胞系可以表達第一種目的蛋白質(zhì)，實驗對象 組中的第二個克隆細胞系可以表達第二種目的蛋白質(zhì)，實驗對象組中的第三個克隆細胞系 可以表達第三種目的蛋白質(zhì)，等等，對于與需要的一樣多的不同目的蛋白質(zhì)。不同目的蛋白 質(zhì)可以是不同同種型、等位基因變體、剪接變體、或突變的(包括但不限于序列突變或截短 的)、嵌合或化學(xué)包括酶促修飾形式的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，不同蛋白質(zhì)可以是 功能上限定的蛋白質(zhì)組的成員，例如苦味受體的實驗對象組或激酶的實驗對象組。在某些 實施方案中，不同蛋白質(zhì)可以是相同或相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑的部分。在涉及異源多聚體蛋 白質(zhì)(包括異源二聚體)的另外其他的實驗對象組中，實驗對象組可以包括亞單位的2種 或更多種不同組合直到亞單位的所有可能組合。組合可以包括亞單位序列變體、亞單位同 種型組合、亞單位的種間組合和亞單位類型的組合。例如，γ -氨基丁酸(GABA)a受體一般包括2個α亞單位、2個β亞單位和1個 Y亞單位。存在6種α同種型、5種β同種型、4種γ同種型，以及δ、π、θ和ε亞單 位。本發(fā)明考慮了包括這些亞單位中的任何的2種或更多種組合的實驗對象組，包括包含 α、β、γ、δ、Ji、ε和θ亞單位的每一種可能組合的實驗對象組。此外，GABA受體家族 還包括GABAb和GABAe受體。本發(fā)明還考慮了包括GABAa、GABAb和GABAe亞單位的任何組合 的實驗對象組。在某些實施方案中，此類實驗對象組包括人GABA亞單位，哺乳動物GABA受 體實驗對象組，例如非人靈長類動物(例如食蟹猴)GABA受體，小鼠、大鼠或人GABA受體實 驗對象組或其混合物。在一個進一步的例子中，本發(fā)明考慮了一種或多種上皮鈉通道(ENaC)實驗對象 組，包括任何哺乳動物ENaC實驗對象組，例如非人靈長類動物(例如食蟹猴)ENaC，小鼠、 大鼠或人ENaC實驗對象組或其混合物。如同GABA受體，完整ENaC包括多個亞單位α或 δ、β和Y。本發(fā)明考慮了具有ENaC亞單位的至少2種不同組合的實驗對象組，并且還考 慮了 ENaC亞單位的所有可能組合，包括來自不同物種的亞單位的組合，同種型、等位基因 變體、SNP、嵌合亞單位、包括經(jīng)修飾的和/或非天然氨基酸的形式和經(jīng)化學(xué)修飾的例如經(jīng) 酶促修飾的亞單位的組合。本發(fā)明還考慮了包括國際申請PCT/US09/31936中所示的ENaC 形式的實驗對象組，所述國際申請的內(nèi)容通過引用整體合并。在一個進一步特別的實施方案中，25種苦味受體的相匹配實驗對象組包括表達表 10中列出的天然(無標(biāo)簽)功能苦味受體的細胞系。在某些實施方案中，實驗對象組就生 長速率相匹配。在某些實施方案中，實驗對象組就生長速率和另外的目的生理特性相匹配。 在某些實施方案中，實驗對象組中的細胞系平行產(chǎn)生和/或平行篩選。實驗對象組及其用途的進一步示例性但非限制性例子是下述有氣味性受體(昆 蟲、犬、人、臭蟲)的實驗對象組，例如對于香味的概況分析或調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)；表達與測試 肽融合的基因的細胞的實驗對象組，即發(fā)現(xiàn)作用于使負荷(cargo)內(nèi)在化到細胞內(nèi)的肽，所述負荷例如蛋白質(zhì)，包括單克隆抗體或非蛋白質(zhì)藥物(負荷可以是報道分子例如GFP或 AP)。關(guān)于這個實施方案，來自這個實驗對象組的細胞的上清液可以加入其他細胞中，用于 評估內(nèi)在化。在此類實施方案中，實驗對象組可以包括不同細胞類型以評估細胞類型特異 性遞送。表達不同單克隆抗體重鏈/輕鏈組合的細胞系實驗對象組以鑒定活性mAbs。抗體 實驗對象組還可以提供單克隆抗體的一系列衍生化形式，以鑒定具有改善特征的那種，例 如在血清中的穩(wěn)定性、結(jié)合親和力等。另外一個實驗對象組可以用于在多種信號傳導(dǎo)分子 例如不同G蛋白的存在下表達靶蛋白。另外一種類型的實驗對象組可以用于就改善的活性 /穩(wěn)定性測試靶蛋白的變體。實驗對象組可以包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)或其他突變形式 的靶蛋白，以選擇作用于亞組、許多形式或所有形式的調(diào)節(jié)劑。其他實驗對象組可以用于限 定測試化合物對于蛋白質(zhì)家族或蛋白質(zhì)同種型(例如GABAa或其他CNS離子通道)的活性 模式。差異作用的化合物隨后可以用于進一步研究中，以測定相對應(yīng)亞單位組合在體內(nèi)的 功能/作用/定位。測試化合物可以是在臨床中失敗的已知調(diào)節(jié)劑或具有不利的脫靶效應(yīng) 的那種，以測定可能與此類效應(yīng)相關(guān)的亞單位組合。另外其他的實驗對象組可以在HTS中 用于平行篩選，用于可靠評估化合物對多重靶亞型的活性，以幫助發(fā)現(xiàn)對所需靶有活性的 化合物和具有最低限度脫靶效應(yīng)的化合物。實驗對象組可以包括任何所需蛋白質(zhì)組，并且本發(fā)明考慮了所有此類實驗對象組。通過順次、平行或兩者的組合產(chǎn)生用于實驗對象組的不同細胞系，可以產(chǎn)生本發(fā) 明的相匹配實驗對象組。例如，可以單獨制備每個細胞系并且隨后使它們相匹配。更優(yōu)選 地，為了使細胞系之間的差異降到最低，順次產(chǎn)生的細胞系可以在相同階段或傳代數(shù)時冷 凍，并且平行解凍。更加優(yōu)選地，平行制備細胞系。在一個優(yōu)選實施方案中，實驗對象組中的細胞系平行進行篩選或測定。根據(jù)本發(fā)明，相匹配實驗對象組的細胞系維持在相同細胞培養(yǎng)條件下，包括但不 限于相同培養(yǎng)基、溫度等。實驗對象組中的所有細胞系以相同頻率進行傳代，所述相同頻率 可以是任何所需頻率，依賴于許多因素，包括細胞類型、生長速率。如應(yīng)理解的，為了維持從 實驗對象組的細胞系到細胞系之間大致相等的細胞數(shù)目，應(yīng)定期標(biāo)準化細胞數(shù)目。根據(jù)該方法，細胞可以以任何細胞培養(yǎng)形式進行培養(yǎng)，只要細胞或細胞系在測量 生長速率的步驟前在單個培養(yǎng)物中分散。例如，為了方便起見，細胞可以最初合并用于在所 需條件下培養(yǎng)，并且隨后單個細胞分離成1個/細胞或器皿。細胞可以以任何方便的細胞數(shù)目在多孔組織培養(yǎng)平板中進行培養(yǎng)。此類平板是可 容易地商購獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在某些實施方案中，細胞可以優(yōu)選 在小瓶中或以任何其他方便的形式培養(yǎng)，各種形式將是技術(shù)人員已知的，并且是可容易地 商購獲得的。在包括測量生長速率的步驟的實施方案中，在測量生長速率前，使細胞培養(yǎng)足夠 長的時間，用于使它們適應(yīng)培養(yǎng)條件。如技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，時間的長度將依賴于許多因 素而改變，所述因素例如細胞類型、所選擇的條件、培養(yǎng)形式，并且可以是從1天到數(shù)天、1 周或更長時間的任何時間量。優(yōu)選地，多個分離的細胞培養(yǎng)物中的每個單個培養(yǎng)物維持在下文討論的基本上等 同的條件下，包括標(biāo)準化的維持時間表。該方法的另一個有利特征是可以同時維持大量單
34個培養(yǎng)物，從而使得可以鑒定具有所需性狀組的細胞，即使非常罕見。由于這些及其他原 因，根據(jù)本發(fā)明，使用自動化細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)多個分離的細胞培養(yǎng)物，從而使得條件對于 每個孔基本上等同。自動化細胞培養(yǎng)防止了人工細胞培養(yǎng)固有的不可避免的變異性。任何自動化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)都可以在本發(fā)明的方法中使用。許多自動化細胞培養(yǎng)系 統(tǒng)是商購可得的，并且是技術(shù)人員眾所周知的。在某些實施方案中，自動化系統(tǒng)是機器人系 統(tǒng)。優(yōu)選地，系統(tǒng)包括獨立移動的通道、多通道頭(例如96-尖端頭)和夾子或擇優(yōu)挑選臂 (cherry-picking arm)、以及HEPA過濾裝置以維持在操作過程中的無菌性。移液器中的通 道數(shù)目應(yīng)適合于培養(yǎng)形式。方便的移液器具有例如96或384個通道。此類系統(tǒng)是已知且 商購可得的。例如，MICROLAB STAR 儀器(Hamilton)可以用于本發(fā)明的方法中。自動化 系統(tǒng)應(yīng)能夠執(zhí)行多種所需細胞培養(yǎng)任務(wù)。此類任務(wù)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。它們包括 但不限于去除培養(yǎng)基、替換培養(yǎng)基、添加試劑、細胞洗滌、去除洗滌溶液、加入分散劑、從培 養(yǎng)器皿中取出細胞、將細胞加入培養(yǎng)器皿中等等。本發(fā)明的細胞或細胞系的產(chǎn)生可以包括任何數(shù)目的分離的細胞培養(yǎng)物。然而，由 該方法提供的優(yōu)點隨著細胞數(shù)目的增加而增加。不存在可以在該方法中利用的細胞或分 離的細胞培養(yǎng)物數(shù)目的理論上限。根據(jù)本發(fā)明，分離的細胞培養(yǎng)物的數(shù)目可以是2個或更 多個，但更有利地是至少3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個分離的細胞培養(yǎng)物，例如至少12、 至少15、至少20、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少48、至少50、至 少75、至少96、至少100、至少200、至少300、至少384、至少400、至少500、至少1000、至少 10，000、至少100，000、至少500，000個或更多個。在某些實施方案中，如所述培養(yǎng)的本發(fā)明的細胞和細胞系是先前已對于目的核酸 選擇為陽性的細胞，所述目的核酸可以是編碼全部或部分目的蛋白質(zhì)的所引入核酸，或激 活編碼全部或部分目的蛋白質(zhì)的序列的轉(zhuǎn)錄的所引入核酸。在某些實施方案中，如本文所 述培養(yǎng)的細胞是已就編碼目的蛋白質(zhì)的mRNA選擇為陽性的細胞。為了制備本發(fā)明的細胞和細胞系，可以使用例如美國專利6，692，965和 TO/2005/079462中描述的技術(shù)。這些文件都通過引用整體合并入本文。這個技術(shù)提供數(shù) 百萬細胞的實時評估，從而使得任何所需數(shù)目的克隆(從數(shù)百個到數(shù)千個克隆)。使用細胞 分選技術(shù)，例如流式細胞術(shù)細胞分選(例如用FACS機器)或磁性細胞分選(例如用MACS機 器)，1個細胞/孔可以以高統(tǒng)計可靠性自動地存放于培養(yǎng)器皿(例如96孔培養(yǎng)平板)中。 技術(shù)的速度和自動化允許容易地分離多基因重組細胞系。使用該技術(shù)，使用信號傳導(dǎo)探針，也稱為分子信標(biāo)或熒光探針，可以檢測出關(guān)于目 的蛋白質(zhì)的RNA序列。在某些實施方案中，包含編碼序列的載體具有編碼RNA標(biāo)簽序列的另 外序列?！皹?biāo)簽序列”指其為經(jīng)表達的RNA或待通過信號傳導(dǎo)探針檢測的RNA的部分的核酸 序列。信號傳導(dǎo)探針可以檢測出多種RNA序列，其中任何一種都可以用作標(biāo)簽，包括編碼肽 的那些和上文描述的蛋白質(zhì)標(biāo)簽。通過將探針設(shè)計為包括與標(biāo)簽的序列互補的部分，信號 傳導(dǎo)探針可以針對標(biāo)簽。標(biāo)簽序列可以是質(zhì)粒的3'非翻譯區(qū)，其與目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物一 起共轉(zhuǎn)錄，并且包括用于信號傳導(dǎo)探針結(jié)合的靶序列。標(biāo)簽序列可以與基因的信使的蛋白 質(zhì)編碼部分一起在框內(nèi)或與其一起在框外，依賴于是否希望給產(chǎn)生的蛋白質(zhì)加上標(biāo)簽。因 此，標(biāo)簽序列不必被翻譯用于通過信號傳導(dǎo)探針檢測。標(biāo)簽序列可以包括相同或不同的多 重靶序列，其中一種信號傳導(dǎo)探針與每種靶序列雜交。標(biāo)簽序列可以定位在編碼目的基因的RNA內(nèi)，或標(biāo)簽序列可以定位在5'或3'非翻譯區(qū)內(nèi)。標(biāo)簽序列可以是具有二級結(jié)構(gòu)的 RNA。結(jié)構(gòu)可以是三臂連接結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，信號傳導(dǎo)探針檢測在關(guān)于目的蛋白質(zhì) 的編碼序列內(nèi)的序列。在DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)和后續(xù)藥物選擇(如果使用)后，或在基因激活后，其 各自靶向不同的標(biāo)簽序列且差異標(biāo)記的分子信標(biāo)(例如熒光探針)可以引入細胞內(nèi)，并且 流式細胞術(shù)細胞分選器用于分離對于其信號陽性的細胞(可以執(zhí)行多輪分選)。在一個實 施方案中，流式細胞術(shù)細胞分選器是FACS機器。還可以使用MACS(磁性細胞分選)或使用 激光激活的分析和加工的陰性細胞的激光消融。還可以使用其他熒光平板讀取器，包括與 高通量篩選相容的那些。信號陽性細胞攝取一種或多種所引入序列的至少一個拷貝，并且 可以將它整合到其基因組內(nèi)。隨后鑒定引入關(guān)于目的蛋白質(zhì)的信使的細胞。例如，編碼序 列可以整合到細胞中的基因組的不同位置處。所引入序列的表達水平可以基于拷貝數(shù)或整 合位點而改變。此外，可以獲得包括目的蛋白質(zhì)的細胞，其中一種或多種所引入核酸是附加 型(印isomal)的或起因于基因激活。在本發(fā)明中有用的信號傳導(dǎo)探針是本領(lǐng)域已知的，并且一般是包括與靶序列互補 的序列和信號發(fā)射系統(tǒng)的寡核苷酸，所述信號發(fā)射系統(tǒng)如此安排，使得當(dāng)探針不與靶序列 結(jié)合時，無信號發(fā)射，并且當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時，發(fā)射信號。作為非限制性舉例說明，信號 傳導(dǎo)探針可以包括如此定位在探針中的熒光團和猝滅劑，使得猝滅劑和熒光團在未結(jié)合的 探針中被放在一起。在探針和靶序列之間結(jié)合后，猝滅劑和熒光團分離，導(dǎo)致信號的發(fā)射。 例如國際公開WCV2005/079462描述了許多信號傳導(dǎo)探針，其可以在本文的細胞和細胞系 的產(chǎn)生中使用。上文對于將核酸引入細胞內(nèi)描述的方法可以用于引入信號傳導(dǎo)探針。當(dāng)使用標(biāo)簽序列時，每種載體(當(dāng)使用多重載體時)可以包括相同或不同的標(biāo)簽 序列。無論標(biāo)簽序列是相同的還是不同的，信號傳導(dǎo)探針都可以包括不同信號發(fā)射器，例如 不同顏色的熒光團等，從而使得可以分開檢測每個亞單位的表達。作為舉例說明，特異性檢 測第一種目的mRNA的信號傳導(dǎo)探針可以包括紅色熒光團，檢測第二種目的mRNA的探針可 以包括綠色熒光團，并且檢測第三種目的mRNA的探針可以包括藍色熒光團。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)知道在三重轉(zhuǎn)染的細胞中用信號傳導(dǎo)探針差異檢測3種亞單位的表達的其他方法。在一個實施方案中，信號傳導(dǎo)探針設(shè)計為與編碼目的蛋白質(zhì)的RNA的部分或5' 或3'非翻譯區(qū)的部分互補。即使設(shè)計為識別目的信使RNA的信號傳導(dǎo)探針能夠檢測虛假 地內(nèi)源表達的靶序列，與由經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生的目的序列的比例相比較，這些的比例是這 樣的，使得分選器能夠區(qū)分2種細胞類型。目的蛋白質(zhì)的表達水平可以從細胞到細胞之間或從細胞系到細胞系之間不等。由 于后生事件例如DNA甲基化以及基因沉默和轉(zhuǎn)基因拷貝的喪失，細胞或細胞系中的表達水 平還可以隨著時間的過去而下降。這些變異可以歸于各種因素，例如由細胞攝取的轉(zhuǎn)基因 的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因的基因組整合的位點、和在基因組整合后轉(zhuǎn)基因的完整性。可以使用FACS 或其他細胞分選方法(即MACS)評估表達水平。可以使用引入信號傳導(dǎo)探針的另外輪次， 例如以測定對于它們最初分離的任何一種或多種RNA，隨著時間的過去細胞是否保持陽性 且至何種程度。任選地，可以制備用于一個或多個生長速率組的培養(yǎng)物的一個或多個復(fù)制組。在 某些情況下，冷凍一個或多個生長框的復(fù)制組例如以充當(dāng)冷凍原種可以是有利的。然而，
36根據(jù)該方法，冷凍細胞原種可以與所需的一樣頻繁且在其產(chǎn)生過程中的任何點和許多點上 進行制備。用于冷凍細胞培養(yǎng)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，復(fù)制組可以 在任何溫度下冷凍，例如在_70°C至-80°C下。在一個實施方案中，使細胞溫育直至達到 70-100%匯合。接下來，抽吸培養(yǎng)基并且將90% FBS和10%培養(yǎng)基的溶液加入平板中，溫 育且冷凍。本發(fā)明考慮了使用不同培養(yǎng)條件用任何數(shù)目的復(fù)制組執(zhí)行該方法。即，該方法可 以用在第一組培養(yǎng)條件下的第一個多個(組)分離的細胞培養(yǎng)物和用在第二組條件下培養(yǎng) 的第二組分離的細胞培養(yǎng)物構(gòu)成，所述第二組條件不同于第一種條件，對于任何所需數(shù)目 的條件組依此類推。使用不同條件組的方法可以同時或順次執(zhí)行或兩者的組合(例如同時 2個組隨后為2個更多的組，等等)。用于選擇具有目的蛋白質(zhì)的一致功能表達的細胞的本文所述方法的一個優(yōu)點是， 細胞通過功能而不是通過特定核酸在細胞中的存在進行選擇。包括編碼目的蛋白質(zhì)的核酸 的細胞可能不表達它，或即使產(chǎn)生蛋白質(zhì)，由于許多原因，蛋白質(zhì)也可能不是有功能的，或 與“天然”功能相比較具有改變的功能，所述“天然”功能即在天然表達蛋白質(zhì)的其正常背 景中在細胞中有功能的。通過基于功能選擇細胞，本文描述的方法使得能夠鑒定新型功能 形式。例如，可以鑒定在相同測定法中具有多種程度功能的多種細胞，例如用相同測試化合 物或用一系列化合物。差異功能提供了一系列功能“概況分析”。此類概況分析例如用于鑒 定差異影響蛋白質(zhì)的不同功能形式的化合物。此類化合物用于鑒定蛋白質(zhì)在特定組織或疾 病狀態(tài)等中的功能形式。用于制備本發(fā)明的細胞和細胞系的方法的進一步優(yōu)點包括，表達復(fù)雜蛋白質(zhì)或多 重目的蛋白質(zhì)的細胞是可以在比通過常規(guī)方法明顯更少的時間內(nèi)產(chǎn)生的細胞。例如，依賴 于許多因素包括功能測定法所需的細胞數(shù)目，生長速率框并是否完成和其他因素，表達可 證實的功能蛋白質(zhì)的細胞可以在少至2天或1周內(nèi)產(chǎn)生，但即使2周、3周、1個月、2個月、3 個月或甚至6個月的生產(chǎn)時間也明顯快于通過常規(guī)方法可以達到的，甚至對于復(fù)雜或多重 蛋白質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的細胞和細胞系的方法。本發(fā)明的細胞 和細胞系可以用于對于其需要目的功能蛋白質(zhì)的任何應(yīng)用中。細胞和細胞系可以用于例如 體外基于細胞的測定法或體內(nèi)測定法中，在所述體內(nèi)測定法中，將細胞植入動物(例如，非 人動物)中，以例如篩選調(diào)節(jié)劑；產(chǎn)生蛋白質(zhì)用于晶體學(xué)和結(jié)合研究；且研究化合物選擇性 和劑量、受體/化合物結(jié)合動力學(xué)和穩(wěn)定性、和受體表達對細胞生理學(xué)(例如，電生理學(xué)、蛋 白質(zhì)運輸、蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié))的作用。本發(fā)明的細胞和細胞系可以在敲減(knock down)研究中用于檢查目的蛋白質(zhì)的作用。本發(fā)明的細胞和細胞系還可以用于鑒定可溶性生物競爭劑，用于功能測定法，生 物淘選(例如，使用噬菌體展示文庫)，基因芯片研究以評估基因表達中所產(chǎn)生的改變，雙 雜交研究以鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，特異性亞單位在細胞系中的敲減以評估其作 用，電生理學(xué)，蛋白質(zhì)運輸?shù)难芯?，蛋白質(zhì)折疊的研究，蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的研究，針對蛋白質(zhì)的抗 體的產(chǎn)生，針對蛋白質(zhì)的探針的分離，針對蛋白質(zhì)的熒光探針的分離，蛋白質(zhì)的表達對總體 基因表達/加工的作用的研究，蛋白質(zhì)的表達對總體蛋白質(zhì)表達和加工的作用的研究，和 蛋白質(zhì)的表達對細胞結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、特征的作用的研究。
本發(fā)明的細胞和細胞系進一步用于表征目的蛋白質(zhì)(DNA、RNA或蛋白質(zhì))，包括 DNA、RNA或蛋白質(zhì)化學(xué)計量學(xué)，蛋白質(zhì)折疊，裝配，膜整合或表面呈遞，構(gòu)象，活性狀態(tài)，激活 電位，應(yīng)答，功能和基于細胞的測定法功能，其中目的蛋白質(zhì)包括多基因系統(tǒng)、復(fù)合物或途 徑，無論這些的所有組分是由引入細胞內(nèi)的一種或多種靶基因提供，還是由所引入和內(nèi)源 表達的序列的任何組合提供。本發(fā)明使得能夠產(chǎn)生表達目的蛋白質(zhì)的多重細胞系。本發(fā)明的克隆細胞系將具有 此種表達的不同絕對和相對水平。此類克隆的大型實驗對象組可以用許多已知參考化合物 就活性進行篩選。以這種方式，每個經(jīng)分離的細胞系將具有對測試化合物的應(yīng)答的“指紋 (fingerprint) ”，這代表蛋白質(zhì)的差異功能表達的活性。細胞系隨后可以基于對化合物的 此類應(yīng)答的相似性進行分組?？梢赃x擇代表每種功能上獨特的表達譜的至少一個細胞系用 于進一步研究。這些細胞系的集合隨后可以用于篩選大量化合物。以這種方式，可以鑒定 選擇性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的一種或多種相對應(yīng)獨特功能形式的化合物。這些調(diào)節(jié)劑隨后可以在次 級測定法中或在體內(nèi)模型中進行測試，以測定何種在這些測定法或模型中證實活性。在這 種背景中，調(diào)節(jié)劑將用作參考化合物，以鑒定蛋白質(zhì)的何種相對應(yīng)功能形式可能存在或在 所采用的次級測定法或模型系統(tǒng)中起作用。此類測試可以用于測定可能在體內(nèi)存在的蛋白 質(zhì)的功能形式以及可能是生理學(xué)相關(guān)的那些。這些調(diào)節(jié)劑可以用于區(qū)分功能上獨特形式中 的何種涉及特定表型或生理功能例如疾病。當(dāng)制備細胞系用于仍未得到充分表征的蛋白質(zhì)時，這種方法也是有用的。對于此 類蛋白質(zhì)，通常關(guān)于其對已知化合物的功能應(yīng)答性質(zhì)的信息很少。評估克隆活性的已確定 的功能基準的此類缺乏可以是產(chǎn)生生理學(xué)相關(guān)細胞系中的一個挑戰(zhàn)。上文描述的方法提供 了獲得生理學(xué)相關(guān)細胞系的途徑，即使對于當(dāng)存在此類信息的缺乏時，未得到充分表征的 蛋白質(zhì)。通過尋找代表許多或所有功能形式的克隆，其可以起因于包括蛋白質(zhì)的基因的表 達，可以獲得包括蛋白質(zhì)的生理學(xué)相關(guān)形式的細胞系?；谄鋵Ω鞣N調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答，通過使蛋白質(zhì)的體內(nèi)形式的身份與蛋白質(zhì)的已知形 式的身份相關(guān)聯(lián)，本發(fā)明的細胞和細胞系可以用于鑒定目的蛋白質(zhì)的不同形式在不同病理 狀態(tài)中的作用。這允許選擇疾病或組織特異性調(diào)節(jié)劑用于與蛋白質(zhì)相關(guān)的病理狀態(tài)的高度 靶向治療。為了鑒定調(diào)節(jié)劑，在其中蛋白質(zhì)將預(yù)期是有功能的條件下，使本發(fā)明的細胞或細 胞系暴露于測試化合物，并且隨后檢測與合適對照例如未暴露于測試化合物的細胞相比 較，蛋白質(zhì)活性中的統(tǒng)計學(xué)顯著改變(例如，P < 0. 05)。還可以使用采用已知激動劑或拮 抗劑和/或表達目的蛋白質(zhì)的細胞的陽性和/或陰性對照。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解 各種測定法參數(shù)例如信噪比可以得到最佳化。在某些實施方案中，使本發(fā)明的一種或多種細胞或細胞系暴露于多種測試化合 物，例如測試化合物的文庫。使用本發(fā)明的細胞系可以篩選此類測試化合物文庫，以鑒定目 的蛋白質(zhì)的一種或多種調(diào)節(jié)劑。測試化合物可以是化學(xué)部分，包括小分子、多肽、肽、肽模擬 物、抗體或其抗原結(jié)合部分、天然化合物、合成化合物、提取物、脂質(zhì)、洗滌劑等。在抗體的情 況下，它們可以是非人抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體?？贵w可以是包括重鏈和輕 鏈的完全互補體的完整抗體或任何抗體的抗原結(jié)合部分，包括抗體片段(例如Fab和Fab、 Fab\ F(ab' )2、Fd、Fv, dAb等)、單鏈抗體(scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、重鏈或輕鏈可變區(qū)的全部或抗原結(jié)合部分。在某些實施方案中，在暴露于測試化合物前，本發(fā)明的細胞或細胞系可以通過預(yù) 處理例如酶進行修飾，所述酶包括哺乳動物或其他動物酶、植物酶、細菌酶、蛋白質(zhì)修飾酶 和脂質(zhì)修飾酶。此類酶可以包括例如激酶，蛋白酶，磷酸酶，糖苷酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水 解酶，裂解酶，異構(gòu)酶，連接酶，細菌蛋白酶，來自腸的蛋白酶，來自GI道的蛋白酶，在唾液、 口腔中的蛋白酶，來自lysol細胞/細菌的蛋白酶等。備選地，細胞和細胞系可以首先暴露 于測試化合物，隨后為酶處理，以鑒定通過處理改變蛋白質(zhì)的修飾的化合物。在某些實施方案中，在基于細胞的、功能性的高通量篩選(HTS)中，例如使用96 孔、384孔、1536孔或更高密度的形式，就蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)活性測試大型化合物集合。在某些實 施方案中，使用超過一種本發(fā)明的細胞或細胞系，可以篩選測試化合物或多重測試化合物， 包括測試化合物文庫。在某些實施方案中，本發(fā)明的細胞和細胞系對于目的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑具有增加的 敏感性。本發(fā)明的細胞和細胞系還響應(yīng)對于蛋白質(zhì)具有生理學(xué)范圍EC5(I或IC5(I值的調(diào)節(jié) 劑。如本文所使用的，EC5(i指在細胞或細胞系中誘導(dǎo)半最大激活應(yīng)答所需的化合物或物質(zhì) 的濃度。如本文所使用的，IC5(I指在細胞或細胞系中誘導(dǎo)半最大抑制應(yīng)答所需的化合物或 物質(zhì)的濃度。EC5(I和IC5(I值可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行測定，例如使化合物或物 質(zhì)的濃度與表達蛋白質(zhì)的細胞系的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的劑量應(yīng)答曲線。本發(fā)明的細胞和細胞系的進一步有利的性質(zhì)是，使用那些細胞和細胞系在起始篩 選中鑒定的調(diào)節(jié)劑在次級功能測定法中是有功能的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到的，在起 始篩選測定法中鑒定的化合物一般必須是例如通過組合化學(xué)、藥物化學(xué)或合成化學(xué)進行修 飾的，用于其衍生物或類似物在次級功能測定法中有功能。然而，由于本發(fā)明的細胞和細胞 系的高生理學(xué)相關(guān)性，使用這些細胞和細胞系鑒定的許多化合物無需進一步修飾即是有功 能的。在某些實施方案中，在起始測定法中鑒定的至少25 %、30 %、40 %、50 %或更多的調(diào)節(jié) 劑在次級測定法中是有功能的。此外，本發(fā)明的細胞系在功能測定法中表現(xiàn)與“黃金標(biāo)準” 測定法相當(dāng)。例如，表達GABA A受體的本發(fā)明的細胞系在膜電位測定法和電生理學(xué)中表現(xiàn) 基本上相同。本發(fā)明的這些和其他實施方案可以在下述非限制性實施例中進一步舉例說明。 實施例實施例1產(chǎn)生穩(wěn)定的表達GABAa&細胞系產(chǎn)生表達載體基于pCMV-SCRIPT (Stratagene)產(chǎn)生允許流水線克隆的質(zhì)粒表達載體，并且包含 關(guān)于目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的多種所需組分，包括CMV和SV40真核啟動子；SV40和HSV-TK多 腺苷酸化序列；多克隆位點；Kozak序列和新霉素/卡那霉素抗性盒。步驟1-轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T和CH0細胞。該實施例聚焦在CH0細胞，其中CH0細胞用3種單獨 質(zhì)粒以下述組合進行共轉(zhuǎn)染al33y2s(al)、a 3 y 2s (a 2), a333y2s(a3)禾口 a 3 y 2s (a 5), 一種質(zhì)粒編碼人 GABA a 亞單位(SEQ ID NO :GABA1_GABA4)、一種質(zhì)粒編 碼人GABA 0 3亞單位(SEQ ID NO :GABA5)，并且另一種質(zhì)粒編碼人GABA y 2亞單位(SEQ IDNO :GABA6)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，適合于與所選擇的宿主細胞一起使用的任何試 劑都可以用于將核酸(例如質(zhì)粒、寡核苷酸、經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸)引入具有合適最佳化的宿 主細胞內(nèi)?？梢杂糜趯⒑怂嵋胨拗骷毎麅?nèi)的試劑的例子包括但不限于Lipofectamine、 Lipofectamine 2000、01igofectamine> TFX i式齊[J、Fugene 6、D0TAP/D0PE、Metafectine ^ Fecturin。盡管藥物選擇在本發(fā)明的方法中是任選的，還是包括一種藥物抗性標(biāo)記/質(zhì)粒。 序列在CMV啟動子的控制下。用于通過信號傳導(dǎo)探針檢測的編碼標(biāo)簽的非翻譯序列也連 同編碼藥物抗性標(biāo)記的序列一起存在。所利用的標(biāo)簽序列是GABA靶序列1(SEQ ID NO GABA7)、GABA 靶序列 2 (SEQ ID NO :GABA8)和 GABA 靶序列 3 (SEQ IDN0 :GABA9)。在這些例 子中，包含GABA a亞單位基因的載體包含GABA靶序列1，包含GABA 0亞單位基因的載體包 含GABA靶序列2，并且包含GABA y亞單位基因的載體包含GABA靶序列3。步驟2-選擇步驟經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞在HAMF12-FBS中生長2天，隨后為在含抗生素的HAMF12-FBS中 14天。含抗生素的時期具有如下加入培養(yǎng)基中的抗生素嘌呤霉素(3.5ug/ml)、潮霉素 (150ug/ml)和 G418/ 新霉素(300ug/ml)步驟3-細胞傳代在抗生素選擇后且在引入熒光探針前，使細胞在不存在抗生素的情況下傳代6-18 次，以允許經(jīng)過所選擇的時間段不穩(wěn)定的表達以減退的時間。步驟4-細胞暴露于熒光探針收獲細胞并且用GABA信號傳導(dǎo)探針(SEQ ID NO :GABA10-GABA12)進行轉(zhuǎn)染。如 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，適合于與所選擇的宿主細胞一起使用的任何試劑都可以用于 將核酸(例如質(zhì)粒、寡核苷酸、經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸)引入具有合適最佳化的宿主細胞內(nèi)?？?以用于將核酸引入宿主細胞內(nèi)的試劑的例子包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、01igofectamine> TFX i式齊[J、Fugene 6、D0TAP/D0PE、Metafectine ^ Fecturin。GABA信號傳導(dǎo)探針1結(jié)合GABA靶序列1，GABA信號傳導(dǎo)探針2結(jié)合GABA靶序列 2并且GABA信號傳導(dǎo)探針3結(jié)合GABA靶序列3。隨后收集細胞用于分析且使用熒光激活 細胞分選器分選(下文)。通過信號傳導(dǎo)探針檢測的靶序列GABA 靶 15，-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3，(SEQ IDN0 :GABA7) ( a 亞單位)GABA 靶 25，-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3，(SEQ ID NO :GABA8) 亞單位)GABA 革巴 35，-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3，(SEQ ID NO :GABA9) (y 亞單位)信號傳導(dǎo)探針作為100 ii M原液供應(yīng)在特定實驗中使用具有與Cy5相似的譜性質(zhì)的Quasar Dye (BioSearch)的相似探 針。還應(yīng)當(dāng)指出在某些情況下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探針而不是DNA探針。GABA信號傳導(dǎo)探針1_結(jié)合(GABA靶1)
40
5，-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ3 猝滅-3，(SEQ ID NO :GABA10)GABA信號傳導(dǎo)探針2_結(jié)合(GABA靶2)5，-Cy5. 5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3 猝滅-3，(SEQ ID NO: GABA11)應(yīng)當(dāng)指出BHQ3可以由探針1或探針2中的BHQ2或金顆粒置換。
GABA信號傳導(dǎo)探針3-結(jié)合(GABA靶3)5，-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1 猝滅-3” (SEQ ID NO GABA12)應(yīng)當(dāng)指出BHQ1可以由探針3中的BHQ2或Dabcyl置換。步驟5-陽性細胞的分離使細胞解離并收集用于分析和使用熒光激活細胞分選器進行分選。標(biāo)準分析方 法用于門控發(fā)熒光超過本底的細胞，并且將歸入門內(nèi)的單個細胞分離到有條形碼的96孔 平板內(nèi)。門控層次如下門控層次符合門(coincidence gate) >單峰(singlets)門> 活門(live gate) >分選門(Sort gate)。用這種門控策略，標(biāo)記出三重陽性細胞的頂端 0. 04-0. 4%用于分選到有條形碼的96孔平板內(nèi)。步驟6-步驟1-5和/或3-5的另外循環(huán)重復(fù)步驟1-5和/或3-5以獲得更大數(shù)目的細胞。完成步驟1-5的2個獨立循環(huán)， 并且對于這些循環(huán)中的每一個，執(zhí)行步驟3-5的至少3個內(nèi)部循環(huán)用于獨立循環(huán)的合計。步驟7-關(guān)于細胞群體的生長速率的估計將平板轉(zhuǎn)移至Hamilton Microlabstar自動化液體處理器。使細胞在2_3天條件 生長培養(yǎng)基新鮮生長培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基是Ham’sF12/10%FBS)的1 1混合物中溫育 5-7天，其中補充有100單位青霉素/ml加上0. lmg/ml鏈霉素，并且隨后使用0. 25%胰蛋 白酶通過胰蛋白酶消化進行分散，以使凝塊降到最低，并且轉(zhuǎn)移至新96孔平板。在克隆分 散后，使平板成像以測定孔的匯合(Genetix)。使每塊平板聚焦用于跨越平板的可靠圖像采 集。不依靠報告的超過70%的匯合。在經(jīng)過9天(在分散后第1和10天之間)每3次的 天數(shù)時獲得匯合測量，并且用于計算生長速率。步驟8-根據(jù)生長速率估計框并細胞群體根據(jù)在步驟7中的分散步驟后10-11天之間的生長速率，使細胞框并(獨立地分 組且作為同期組群鋪平板)。獨立地收集框并且鋪平板在個別96孔平板上用于下游處理， 并且可以存在超過一塊靶平板/特定框。通過考慮生長速率的擴展且將覆蓋細胞群體總數(shù) 目的高百分比的范圍歸為同類(bracket)來計算框。依賴于分選反復(fù)操作(iteration)(參 見步驟5)，使用具有1-4天分隔的5-6個生長框。因此每個框相應(yīng)于在12-14. 4小時之間 的生長速率或群體倍增時間，依賴于反復(fù)操作。步驟9-重復(fù)鋪平板以加快平行加工且提供嚴格QC使平板在標(biāo)準和固定條件(濕潤的37°C、5% C02/95%空氣)下在不含抗生素的 Ham's F12培養(yǎng)基/10%FBS中溫育。使細胞的平板分開，以產(chǎn)生4組(組由關(guān)于所有生長 框的所有平板組成_這些步驟確保起始組的4個重復(fù))靶平板。高達2塊靶平板組提交用 于低溫保存(參見下文)，并且其余組按比例放大，并且進一步重復(fù)鋪平板，用于傳代和用 于功能測定法實驗。不同和獨立的組織培養(yǎng)試劑、溫箱、人員和二氧化碳來源用于每個獨立
41執(zhí)行的平板組。采取質(zhì)量控制步驟以確保所有組織培養(yǎng)試劑的適當(dāng)產(chǎn)生和品質(zhì)加入到制 備用于使用的每瓶培養(yǎng)基中的每種組分通過一個指定人員在一個指定通風(fēng)櫥中加入，其中 通風(fēng)櫥中僅有那種試劑，同時第二個指定人員進行監(jiān)督以避免錯誤。設(shè)定用于液體處理的 條件以消除跨越的交叉污染。新鮮尖端用于所有步驟，或使用嚴格的尖端洗滌方案。設(shè)定 液體處理條件用于準確體積轉(zhuǎn)移、有效細胞處理、洗滌循環(huán)、移液速度和定位、用于細胞分 散的移液循環(huán)數(shù)目、和尖端與平板的相對位置。步驟10-冷凍細胞群體的早期傳代原種使至少2組平板在-70至_80°C下冷凍。首先允許每個組中的平板達到70_100% 的匯合。抽吸培養(yǎng)基并且加入90% FBS和10%DMS0。平板用Parafilm密封，并且隨后通 過l-5cm泡沫材料分別圍繞，并且放置到-80°C冷藏庫中。步驟11-用于產(chǎn)生VSF的起始轉(zhuǎn)化步驟的方法和條件其余平板組如步驟9中所述進行維持(上文)。所有細胞分開(splitting)使用 自動化液體處理步驟來執(zhí)行，包括培養(yǎng)基去除、細胞洗滌、胰蛋白酶添加和溫育、猝滅和細 胞分散步驟。步驟12-校正生長速率的任何其余變異性的標(biāo)準化方法控制用于所有細胞群體的細胞和培養(yǎng)條件的一致性和標(biāo)準化。通過跨越平板的細 胞數(shù)目的定期標(biāo)準化，可以控制由于生長速率中的輕微差異導(dǎo)致的跨越平板的任何差異。步驟13-細胞群體的表征使細胞維持6-8周的細胞培養(yǎng)，以允許其在這些條件下的體外進化。在這個時間 過程中，觀察大小、形態(tài)、脆性、對胰蛋白酶消化或解離的應(yīng)答、解離后的圓形/平均圓形 度、活力百分比、朝向微匯合(microconfluency)的趨勢、或細胞維持的其他方面例如與培 養(yǎng)平板表面的附著。步驟14-細胞群體在VSF條件下的潛在功能性的評估使用功能標(biāo)準測試細胞群體。根據(jù)制造商的說明書使用膜電位測定試劑盒 (Molecular Devices/MDS)。細胞在96或384孔平板中以多重不同密度進行測試并且分析 應(yīng)答。使用鋪平板后的各個時間點，例如鋪平板后12-48小時。還就測定應(yīng)答差異測試不 同的鋪平板密度。步驟15使來自在低和較高傳代數(shù)下執(zhí)行的實驗的功能應(yīng)答相比較，以鑒定經(jīng)過3-9周的 限定時間段具有最一致應(yīng)答的細胞。還指出注意隨著時間的過去改變的其他細胞特征，包 括形態(tài)、朝向微匯合的趨勢、和鋪平板后與培養(yǎng)基質(zhì)附著前的時間。步驟16符合功能和其他標(biāo)準的細胞群體進行進一步評估，以確定最順應(yīng)以產(chǎn)生活的、穩(wěn) 定的和有功能的細胞系的那些。所選擇的細胞群體在更大的組織培養(yǎng)器皿中進行擴增，并 且在這些條件下繼續(xù)或重復(fù)上文描述的表征步驟。在這點上，引入另外的標(biāo)準化步驟用于 一致和可靠傳代。這些包括不同的鋪平板細胞密度、傳代時間、培養(yǎng)皿大小/形式和包被、 流體學(xué)最佳化、細胞解離最佳化(類型、所用體積和時間長度)、以及洗滌步驟。當(dāng)經(jīng)過培養(yǎng) 中的4周過程每數(shù)天進行測試時，測定法Z'得分是穩(wěn)定的。此外，測定在每次傳代時的細胞活力。增加人工干預(yù)，并且更緊密地觀察且監(jiān)控細胞。這個信息用于幫助鑒定并選擇保留所需性質(zhì)的最終細胞系。選擇顯示一致生長、合適 附著以及功能應(yīng)答的最終細胞系和備份細胞系。步驟17-細胞庫的建立與最終細胞系和備份細胞系相對應(yīng)的低傳代冷凍平板(參見上文)在37°C下解 凍，用Ham's F12/10% FBS洗滌2次，并且在濕潤的37°C /5% C02條件下溫育。細胞隨后 擴增2-3周的時間段。建立關(guān)于每個最終和備份細胞系的細胞庫，由各具有10，000，000細 胞的25個小瓶組成。步驟18使來自細胞庫的至少一個小瓶解凍，并且在培養(yǎng)中擴增。測試所得到的細胞，以證 實它們符合它們最初就其進行選擇的相同特征。實施例2 GABAa細胞系響應(yīng)GABA配體的驗證評估表達GABAa (a 1^3y2s(a 1), a 3 y 2s (a 2), a 3 y 2s (a 3)禾口 a 3 y 2s (a 5)的亞單位組合)的CHO細胞系對GABA——內(nèi)源GABAa配體的應(yīng)答。使用 下述方案，通過測量響應(yīng)GABA的GABAa膜電位，評估細胞系與GABA的相互作用。在測定前24小時，細胞在生長培養(yǎng)基(Ham’ s F_12培養(yǎng)基加上FBS和谷氨酰胺) 中在384孔平板中以10-25，000細胞/孔鋪平板。去除培養(yǎng)基，隨后為添加在裝載緩沖液 (137mM NaCl、5mMKCl、l. 25mM CaCl、25mM HEPES、lOmM葡萄糖)中稀釋的膜電位染料。溫育 為1小時，隨后為平板裝載到高通量熒光平板讀取器(HamamastuFDSS)上。使GABA配體在 MP測定法緩沖液(137mM NaCl、5mMKGluconate、l. 25mM CaCl、25mM HEPES、lOmM葡萄糖)中 稀釋至所需濃度(需要時，產(chǎn)生GABA的連續(xù)稀釋，所用濃度3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、 1uM、3UM、10UM)，并且加入每個孔中。讀取平板90秒。表GABA1 (下文)證實所產(chǎn)生的細胞系各自響應(yīng)GABA配體。這些結(jié)果指示如預(yù) 期的響應(yīng)內(nèi)源配體的所產(chǎn)生的GABAa細胞系，對于在高通量篩選測定法中使用是生理學(xué)相 關(guān)的。此外，復(fù)制孔產(chǎn)生孔到孔之間的精確EC5(i值，指示GABAa細胞系的高重現(xiàn)性。使用 膜電位測定法產(chǎn)生的 Z'值是 al3 3y2s 0. 58、a 23 3 Y 2s 0.67, a 3 ^ 3 y 2s 0. 69 和 a 3 y 2s 0.62。實施例3使用已知GABAa調(diào)節(jié)劑另外驗證GABAa細胞系。使用在荷包牡丹堿(已知拮抗劑)的測定法緩沖液中以30uM、10uM、3uM、luM、 300nM、100nM和30nM的系列稀釋，通過實施例2中描述的方法驗證GABAa細胞系和膜電位 測定法。發(fā)現(xiàn)在GABA的EC5(1濃度的存在下，荷包牡丹堿與所有4個GABAa細胞系相互作用。 這些結(jié)果指示如預(yù)期的響應(yīng)GABAa&這種已知調(diào)節(jié)劑的所產(chǎn)生的GABAa細胞系，對于在高通 量篩選測定法中使用是生理學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)的。實施例4使用膜電位測定法就天然GABAa功能表征表達GABAa的細胞系評估表達GABAA(a 13 3y2s(a 1)、a23 3y2s(a2)、a33 3y2s(a3) 和a 5 3 3 Y 2s ( a 5)的亞單位組合)的CHO細胞系與來自LOPAC 1280 (Library of Pharmacologically Active Compounds)的 1280 種化合物的相互作用(Sigma-RBI 產(chǎn)品編 號L01280)。L0PAC 1280文庫包含具有充分證明的藥理學(xué)活性的高純度、小有機配體。使 用下述方案，通過測量響應(yīng)測試化合物的GABAa的膜電位，評估細胞系與測試化合物的相互
在測定前24小時，細胞在生長培養(yǎng)基(Ham’ s F_12培養(yǎng)基加上FBS和谷氨酰胺) 中在384孔平板中以10-25，000細胞/孔鋪平板。去除培養(yǎng)基，隨后為添加在裝載緩沖液 (137mM NaCl、5mMKCl、l. 25mM CaCl、25mM HEPES、lOmM葡萄糖)中稀釋的膜電位染料。溫育 為1小時，隨后為平板裝載到高通量熒光平板讀取器(HamamastuFDSS)上。使測試化合物 在MP測定法緩沖液(137mM NaCl、5mMKGluconate、l. 25mM CaCl、25mM HEPES、lOmM葡萄糖) 中稀釋至所需濃度(需要時，產(chǎn)生每種測試化合物的連續(xù)稀釋，所用濃度3nM、10nM、30nM、 100nM、300nM、luM、3uM、10uM)，并且加入每個孔中。讀取平板90秒。
權(quán)利要求
表達來自所引入核酸的目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
2.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn) 錄，所述內(nèi)源核酸編碼所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在 于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋 白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述 細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進 行培養(yǎng)，或其任何組合。
3.表達來自所引入核酸的目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼所述 目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠 變成生物活性的形式的所述目的蛋白質(zhì)，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培 養(yǎng)。
4.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn) 錄，所述內(nèi)源核酸編碼所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在 于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的所述目的蛋白質(zhì)，其中所述細胞在不存 在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的細胞，其中所述編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的第二個 亞單位的核酸是內(nèi)源的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4的細胞，其中所述編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的第二個亞單位 的核酸是引入的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自離子通 道、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受 體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自甜味受體和鮮味受體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)不具有已知 配體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)不在相同類 型的細胞中表達。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的細胞，其中所述細胞的進一步特征在于它具有選自 下述的另外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪失 表達，生理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5-13中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)以一 定形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8 個月和至少9個月。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5-13中任一項的細胞，其中所述功能測定法選自基于細胞 的測定法、基于熒光細胞的測定法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo) 的基于細胞的測定法和鈣流基于細胞的測定法。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5-13中任一項的細胞，其中所述細胞適合于在基于細胞的高 通量篩選中使用。
17.根據(jù)權(quán)利要求3-13中任一項的細胞，其中所述選擇壓力是抗生素。
18.根據(jù)權(quán)利要求3-13和17中任一項的細胞，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況 下表達所述異源二聚體蛋白質(zhì)以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
19.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述目異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個 亞單位，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位由所引入核酸編碼，所述細胞 的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其 中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn) 生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少0. 4的V因子，或所述細胞在不存在選擇壓力 的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
20.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3 個亞單位，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼所述目的異 源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中 使用的形式的所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所 述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少 0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
21.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞 單位，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位由所引入核酸編碼，所述細胞的 特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的所述目的蛋白質(zhì)。
22.表達目的異源二聚體蛋白質(zhì)的細胞，其中所述異源二聚體蛋白質(zhì)包含至少3個亞 單位，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼所述目的異源二 聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞單位，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活 性的形式的所述目的蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任一項的細胞，其中所述編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至 少一個亞單位的核酸是內(nèi)源的。
24.根據(jù)權(quán)利要求20或22的細胞，其中所述編碼目的異源二聚體蛋白質(zhì)的至少一個亞 單位的核酸是引入的。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自離子 通道、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫 受體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)選自GABA、ENaC和NaV。
28.根據(jù)權(quán)利要求19-26中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)不具有已 知配體。
29.根據(jù)權(quán)利要求19-28中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)不在相同 類型的細胞中表達。
30.根據(jù)權(quán)利要求19-29中任一項的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求19-30中任一項的細胞，其中所述細胞的進一步特征在于它具有選 自下述的另外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪 失表達，生理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。
32.根據(jù)權(quán)利要求19、20和23-31中任一項的細胞，其中所述目的異源二聚體蛋白質(zhì)以 一定形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少 1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8 個月和至少9個月。
33.根據(jù)權(quán)利要求19、20和23-31中任一項的細胞，其中所述功能測定法選自基于細 胞的測定法、基于熒光細胞的測定法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介 導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基于細胞的測定法。
34.根據(jù)權(quán)利要求19、20和23-31中任一項的細胞，其中所述細胞適合于在基于細胞的 高通量篩選中使用。
35.根據(jù)權(quán)利要求21-31中任一項的細胞，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的細胞，其中所述選擇壓力是抗生素。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36的細胞，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下表達所述 異源二聚體蛋白質(zhì)以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
38.表達來自所引入核酸的2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼至 少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的所 述目的蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致 地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞 在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
39.表達2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的 轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功 能測定法中使用的形式的所述目的蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或所 述蛋白質(zhì)以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少 0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
40.表達來自所引入核酸的2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼至 少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的 所述目的蛋白質(zhì)。
41.表達2種或更多種目的蛋白質(zhì)的細胞，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的 轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的蛋白質(zhì)，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以生物活性或 能夠變成生物活性的形式的所述目的蛋白質(zhì)。
42.根據(jù)權(quán)利要求38-41中任一項的細胞，其中至少一種目的蛋白質(zhì)是二聚體蛋白質(zhì)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的細胞，其中所述目的二聚體蛋白質(zhì)是同源二聚體蛋白質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的細胞，其中所述目的二聚體蛋白質(zhì)是異源二聚體蛋白質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求38-41中任一項的細胞，其中至少一種目的蛋白質(zhì)是多聚體蛋白質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的細胞，其中所述目的多聚體蛋白質(zhì)是同源多聚體蛋白質(zhì)。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的細胞，其中所述目的多聚體蛋白質(zhì)是異源多聚體蛋白質(zhì)。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-47中任一項的細胞，其中所述蛋白質(zhì)之一由內(nèi)源核酸編碼。
49.根據(jù)權(quán)利要求39或41的細胞，其中所述蛋白質(zhì)之一由所引入核酸編碼。
50.根據(jù)權(quán)利要求38-49中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)不包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
51.根據(jù)權(quán)利要求38-49中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)之一選自離子通道、G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體和免疫受體。
52.根據(jù)權(quán)利要求38-51中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)之一不具有已知配體。
53.根據(jù)權(quán)利要求38-52中任一項的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)之一不在相同類型的 細胞中表達。
54.根據(jù)權(quán)利要求38-53中任一項的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求38-54中任一項的細胞，其中所述細胞的進一步特征在于它具有選 自下述的另外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪 失表達，生理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。
56.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-55中任一項的細胞，其中所述2種或更多種目的蛋白質(zhì) 以一定形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至 少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至 少8個月和至少9個月。
57.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-55中任一項的細胞，其中所述功能測定法選自基于細 胞的測定法、基于熒光細胞的測定法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介 導(dǎo)的基于細胞的測定法和鈣流基于細胞的測定法。
58.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-55中任一項的細胞，其中所述細胞適合于在基于細胞的 高通量篩選中使用。
59.根據(jù)權(quán)利要求40-55中任一項的細胞，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的細胞，其中所述選擇壓力是抗生素。
61.根據(jù)權(quán)利要求59或60的細胞，其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下表達所述 2種或更多種蛋白質(zhì)以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
62.表達至少一種目的RNA的細胞，其中所述目的RNA由所引入核酸編碼，所述細胞的 特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的所述至少一種目的RNA，其中所述 目的RNA不包含標(biāo)簽，或所述RNA以這樣的形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在 功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)， 或其任何組合。
63.表達至少一種目的RNA的細胞，其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源核酸的轉(zhuǎn)錄，所 述內(nèi)源核酸編碼至少一種目的RNA，所述細胞的特征在于它產(chǎn)生以適合于在功能測定法中使用的形式的所述至少一種目的RNA，其中所述目的RNA不包含標(biāo)簽，或所述RNA以這樣的 形式一致地和可重復(fù)性地產(chǎn)生，使得所述細胞在功能測定法中具有至少0. 4的Z'因子，或 所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，或其任何組合。
64.根據(jù)權(quán)利要求62或63的細胞，其中所述細胞表達至少2種目的RNA。
65.根據(jù)權(quán)利要求62或63的細胞，其中所述細胞表達至少3種目的RNA。
66.根據(jù)權(quán)利要求64-65中任一項的細胞，其中所述細胞進一步表達由所引入核酸編 碼的RNA。
67.根據(jù)權(quán)利要求62-66中任一項的細胞，其中所述目的RNA選自編碼離子通道的 RNA、編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的RNA、編碼酪氨酸受體激酶的RNA、編碼細胞因子受體的 RNA、編碼核類固醇激素受體的RNA和編碼免疫受體的RNA。
68.根據(jù)權(quán)利要求62-67中任一項的細胞，其中所述目的RNA不在相同類型的細胞中表達。
69.根據(jù)權(quán)利要求62-68中任一項的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
70.根據(jù)權(quán)利要求62-69中任一項的細胞，其中所述細胞的進一步特征在于它具有選 自下述的另外所需性質(zhì)信噪比大于1，隨著時間的過去是穩(wěn)定的，無選擇壓力生長而不喪 失表達，生理學(xué)EC50值和生理學(xué)IC50值。
71.根據(jù)權(quán)利要求62-70中任一項的細胞，其中所述目的RNA以一定形式一致地和可重 復(fù)性地產(chǎn)生選自下述的時間段至少1周、至少2周、至少3周、至少1個月、至少2個月、至 少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月和至少9個月。
72.根據(jù)權(quán)利要求62-71中任一項的細胞，其中所述功能測定法選自基于細胞的測定 法、基于熒光細胞的測定法、高通量篩選測定法、基于報道細胞的測定法、G蛋白介導(dǎo)的基于 細胞的測定法和鈣流基于細胞的測定法。
73.根據(jù)權(quán)利要求61-72中任一項的細胞，其中所述細胞適合于在基于細胞的高通量 篩選中使用。
74.細胞系，其由權(quán)利要求1-73中任一項的細胞產(chǎn)生。
75.用于產(chǎn)生表達目的蛋白質(zhì)的細胞的方法，其中所述細胞具有隨著時間的過去一致 的至少一種所需性質(zhì)，所述方法包括步驟a)提供表達編碼所述目的蛋白質(zhì)的mRNA的多個細胞；b)將所述細胞單個分散到單個培養(yǎng)器皿內(nèi)，從而產(chǎn)生多個分離的細胞培養(yǎng)物；c)使用自動化細胞培養(yǎng)法在一組所需培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述細胞，所述自動化細胞培養(yǎng) 法的特征在于所述條件對于所述分離的細胞培養(yǎng)物各自是基本上等同的，在這個培養(yǎng)過程 中使細胞數(shù)目/分離的細胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)物與培養(yǎng)物之間進行標(biāo)準化，并且其中所述分離 培養(yǎng)物根據(jù)相同時間表進行傳代；d)就所述目的蛋白質(zhì)的至少一種所需特征測定所述分離的細胞培養(yǎng)物至少2次；和e)鑒定在2種測定法中都具有所需特征的分離的細胞培養(yǎng)物；其中所述細胞是細胞。
76.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟a)中的所述多個細胞在步驟b)中的分散前培養(yǎng) 一段時間。
77.權(quán)利要求75的方法，其中所述單個培養(yǎng)器皿選自多孔平板的單個孔和小瓶。
78.權(quán)利要求75的方法，其進一步包括測定多個所述分離的細胞培養(yǎng)物的生長速率，并且通過其生長速率將所述分離的細胞培養(yǎng)物分成組的步驟，從而使得在任何組中最快和 最慢的生長速率之間的差異在步驟b)和c)之間不超過1、2、3、4或5天。
79.權(quán)利要求75或權(quán)利要求78的方法，其進一步包括制備一種或多種所述分離培養(yǎng)物 的貯藏原種的步驟。
80.權(quán)利要求75的方法，其進一步包括所述分離的細胞培養(yǎng)物的一個或多個復(fù)制組和 與所述來源分離的細胞培養(yǎng)物分開培養(yǎng)所述一個或多個復(fù)制組的步驟。
81.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟d)中的所述測定是用于所述蛋白質(zhì)的功能測定法。
82.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟e)中保持不變的所述至少一種特征是蛋白質(zhì)功能。
83.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟c)中的所述培養(yǎng)是在機器人細胞培養(yǎng)器中。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述機器人細胞培養(yǎng)器包括多通道機器人移液器。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述多通道機器人移液器包括至少96個通道。
86.權(quán)利要求84的方法，其中所述機器人細胞培養(yǎng)器進一步包括擇優(yōu)挑選臂。
87.權(quán)利要求75的方法，其中所述自動化方法包括下述中的一個或多個培養(yǎng)基去除、 培養(yǎng)基替換、細胞洗滌、試劑添加、細胞取出、細胞分散和細胞傳代。
88.權(quán)利要求75的方法，其中所述多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少50個培養(yǎng)物。
89.權(quán)利要求75的方法，其中所述多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少100個培養(yǎng)物。
90.權(quán)利要求75的方法，其中所述多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少500個培養(yǎng)物。
91.權(quán)利要求75的方法，其中所述多個分離的細胞培養(yǎng)物是至少1000個培養(yǎng)物。
92.權(quán)利要求78的方法，其中所述生長速率通過選自下述的方法進行測定測量ATP、 測量細胞匯合、光散射、光密度測量。
93.權(quán)利要求78的方法，其中組中最快和最慢的生長速率之間的差異不超過1、2、3、4 或5小時。
94.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟c)中的所述培養(yǎng)是至少2天。
95.權(quán)利要求78的方法，其中所述多個分離的細胞培養(yǎng)物的生長速率通過分散所述細 胞且測量細胞匯合進行測定。
96.權(quán)利要求95的方法，其中每個分離的細胞培養(yǎng)物中的所述細胞在測量細胞匯合前 進行分散。
97.權(quán)利要求95或96的方法，其中所述分散步驟包括將胰蛋白酶加入孔中并且消除凝塊。
98.權(quán)利要求95的方法，其中使用自動化微板讀取器測量所述多個分離的細胞培養(yǎng)物 的細胞匯合。
99.權(quán)利要求95的方法，其中在計算生長速率前進行至少2次匯合測量。
100.權(quán)利要求98的方法，其中通過自動化平板讀取器測量所述細胞匯合，并且所述匯 合值與計算生長速率的軟件程序一起使用。
101.權(quán)利要求75的方法，其中在步驟d)中所述分離的細胞培養(yǎng)物就選自下述一種或 多種的所需性狀進行表征脆性、形態(tài)、與固體表面的附著；缺乏與固體表面的附著和蛋白 質(zhì)功能。
102.權(quán)利要求75的方法，其中所述細胞是真核細胞。
103.權(quán)利要求75的方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
104.權(quán)利要求75的方法，其中所述哺乳動物細胞系選自NS0細胞、CHO細胞、COS細 胞、HEK-293細胞、HUVEC、3T3細胞和HeLa細胞。
105.權(quán)利要求75的方法，其中所述目的蛋白質(zhì)是人蛋白質(zhì)。
106.權(quán)利要求75的方法，其中所述目的蛋白質(zhì)是異源多聚體。
107.權(quán)利要求75的方法，其中所述目的蛋白質(zhì)是G蛋白偶聯(lián)受體。
108.權(quán)利要求75的方法，其中所述蛋白質(zhì)不具有已知配體。
109.權(quán)利要求75的方法，其在所述鑒定步驟后進一步包括步驟a)在所需培養(yǎng)條件下擴增在步驟e)中鑒定的所述細胞培養(yǎng)物的貯藏等分試樣；b)測定a)的所述經(jīng)擴增的細胞培養(yǎng)物是否具有所需特征。
110.克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述克隆細胞系具有相同細胞類型，并且 其中所述實驗對象組中的每個細胞系表達目的蛋白質(zhì)，并且其中所述實驗對象組中的所述 克隆細胞系相匹配，以共享相同生理特性，以允許平行加工。
111.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述生理特性是生長速率。
112.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述生理特性是與組織培養(yǎng)表面附著。
113.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述生理特性是Z'因子。
114.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述生理特性是編碼所述 目的蛋白質(zhì)的RNA的表達水平。
115.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述生理特性是所述目的 蛋白質(zhì)的表達水平。
116.權(quán)利要求111的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的克隆 細胞系的所述生長速率在彼此的1、2、3、4或5小時內(nèi)。
117.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述培養(yǎng)條件對于所述實 驗對象組中的所有克隆細胞系都是相同的。
118.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述克隆細胞系是真核細 胞系。
119.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述真核細胞系是哺乳動 物細胞系。
120.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系細胞選自原 代細胞和永生化細胞。
121.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系細胞是原核生 物或真核生物的。
122.權(quán)利要求121的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系細胞是真核生 物的，并且選自真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、藻類、甲殼類動物細胞、節(jié) 肢動物細胞、禽類細胞、爬行動物細胞、兩棲動物細胞和植物細胞。
123.權(quán)利要求122的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系細胞是哺乳動物的，并且選自人、非人靈長類動物、牛、豬、貓、大鼠、有袋動物、鼠類、犬、綿羊、山羊、兔、 豚鼠、倉鼠。
124.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系中的細胞進行 改造以表達所述目的蛋白質(zhì)。
125.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞系中的細胞表達 來自所引入核酸的所述目的蛋白質(zhì)，所述所引入核酸編碼蛋白質(zhì)，或在多聚體蛋白質(zhì)的情 況下，編碼蛋白質(zhì)的亞單位。
126.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述細胞表達來自內(nèi)源核 酸的所述目的蛋白質(zhì)，并且其中所述細胞進行改造以激活內(nèi)源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，或在多聚體 蛋白質(zhì)的情況下，激活蛋白質(zhì)的亞單位的轉(zhuǎn)錄。
127.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組包括至少 4個克隆細胞系。
128.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組包括至少 6個克隆細胞系。
129.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組包括至少 25個克隆細胞系。
130.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的克隆 細胞系的2個或更多個表達相同目的蛋白質(zhì)。
131.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的克隆 細胞系的2個或更多個表達不同目的蛋白質(zhì)。
132.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的細胞 系表達不同形式的目的蛋白質(zhì)，其中所述形式選自同種型、氨基酸序列變體、剪接變體、截 短形式、融合蛋白、嵌合體或其組合。
133.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的細胞 系表達一組目的蛋白質(zhì)中的不同蛋白質(zhì)，其中所述目的蛋白質(zhì)組選自在相同信號途徑中 的蛋白質(zhì)、相似蛋白質(zhì)的表達文庫、單克隆抗體重鏈文庫、單克隆抗體輕鏈文庫和SNP。
134.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述目的蛋白質(zhì)是單鏈蛋 白質(zhì)。
135.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述單鏈蛋白質(zhì)是G蛋白 偶聯(lián)受體。
136.權(quán)利要求135的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述G蛋白偶聯(lián)受體是味 覺受體。
137.權(quán)利要求136的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述味覺受體選自苦味 受體、甜味受體、咸味受體和鮮味受體。
138.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)是多聚體蛋白質(zhì)。
139.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)是異源二聚體 或異源多聚體。
140.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)選自離子通道、離子通道、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、酪氨酸受體激酶、細胞因子受體、核類固醇激素受體 和免疫受體。
141.權(quán)利要求140的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)是上皮鈉通道 (ENaC)。
142.權(quán)利要求140的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述ENaC包括α亞單位、 β亞單位和Y亞單位。
143.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的細胞 系表達不同ENaC同種型。
144.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的細胞 系包括ENaC的不同蛋白水解同種型。
145.權(quán)利要求141-143中任一項的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述ENaC是 人ENaC。
146.權(quán)利要求140的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)是電壓門控的 鈉通道(NaV)。
147.權(quán)利要求146的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述NaV包括α亞單位和 2個β亞單位。
148.權(quán)利要求140的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述NaV是人NaV。
149.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)選自氨基 丁酸A受體(GABAa受體)、Y -氨基丁酸B受體(GABAb受體)和γ -氨基丁酸C受體(GABAe 受體)。
150.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述蛋白質(zhì)是GABAa受體。
151.權(quán)利要求150的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述GABAa受體包括2個 α亞單位、2個β亞單位和γ或δ亞單位。
152.權(quán)利要求110的克隆細胞系的相匹配實驗對象組，其中所述實驗對象組中的克隆 細胞系同時或在彼此不超過4周內(nèi)產(chǎn)生。
153.表達來自所引入核酸的目的單體蛋白質(zhì)的細胞，所述所引入核酸編碼所述目的單 體蛋白質(zhì)，其特征在于它產(chǎn)生以生物活性或能夠變成生物活性的形式的所述目的蛋白質(zhì)， 其中所述細胞在不存在選擇壓力的情況下進行培養(yǎng)，并且其中所述蛋白質(zhì)的表達經(jīng)過3個 月改變不超過5%。
154.根據(jù)權(quán)利要求153的細胞，其中所述蛋白質(zhì)的表達經(jīng)過6個月改變不超過5%。
155.根據(jù)權(quán)利要求153或154的細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)不具有已知配體。
156.用于鑒定目的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑的方法，其包括步驟a)使根據(jù)權(quán)利要求1-74中任一項的細胞與測試化合物接觸；和b)檢測與未由所述測試化合物接觸的細胞中的所述蛋白質(zhì)活性相比較，與所述測試化 合物接觸的所述細胞中的所述目的蛋白質(zhì)活性中的改變；其中與在不存在的情況下相比較，在存在下產(chǎn)生活性中的差異的化合物是所述目的蛋 白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑。
157.調(diào)節(jié)劑，其通過權(quán)利要求156的方法鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型細胞和細胞系，以及關(guān)于制備和使用其的方法。
文檔編號C12N15/67GK101960014SQ200980107825
公開日2011年1月26日 申請日期2009年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日
發(fā)明者K·謝克達 申請人:克羅莫塞爾公司