專利名稱：源自Glaucocystophytes的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物的遺傳修飾、特別是將感興趣的多肽轉(zhuǎn)運到植物質(zhì)體(plastid)上。
背景技術：
質(zhì)體包含它自身的基因組。然而，在進化過程中，許多質(zhì)體基因被轉(zhuǎn)移到核基因組 中。因此，已經(jīng)發(fā)展了機制用于將核編碼的質(zhì)體蛋白轉(zhuǎn)運回到質(zhì)體上。這些蛋白是通過使 用位于被轉(zhuǎn)運蛋白的N端的轉(zhuǎn)運肽序列來進行轉(zhuǎn)運的。這些肽將這些蛋白引導(direct) 到質(zhì)體上并且可以隨后被特異性的蛋白酶識別，這可能導致轉(zhuǎn)運肽(transit peptid)的去 除。細胞生物學中的一個根本性問題是將由細胞質(zhì)核糖體合成的蛋白精確并且有效 的靶向到它們的適當?shù)募毎麅?nèi)的位置上。對于其中在適當?shù)募毎髦行枰撧D(zhuǎn)基因產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)基因高等植物而言尤其是這樣。本發(fā)明提供了將異源多肽有效地轉(zhuǎn)運進入轉(zhuǎn)基因高等植 物的葉綠體中的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽。出人意料地，這可以使用源自Glaucocystophyte的藍色小體 (cyanelle)轉(zhuǎn)運肽來完成。發(fā)明概述在此提供了用于將多肽靶向至葉綠體的組合物和方法。組合物包括轉(zhuǎn)運肽以及編 碼轉(zhuǎn)運肽(即，靶向質(zhì)體的肽或運輸肽(transport peptide))及其變異體的多個核苷酸序 列。組合物進一步包括DNA構建體，這些構建體包括對該轉(zhuǎn)運肽進行編碼的核苷酸序列，該 核苷酸序列與編碼異源多肽的核苷酸序列可操作連接。這些DNA構建體在表達以及將異源 多肽的靶向到質(zhì)體中找到了用途。組合物還包括多個表達盒、載體、轉(zhuǎn)化的植物、轉(zhuǎn)化的植 物細胞、以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，它們包含對異源多肽進行編碼的多核苷酸，該異源多肽 通過本發(fā)明的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽而靶向至葉綠體。發(fā)明詳細說明本發(fā)明的質(zhì)體靶向或轉(zhuǎn)運肽介導了可運作地連接的多肽進入質(zhì)體的靶向、定位、 或轉(zhuǎn)運。質(zhì)體是在植物和藻類中發(fā)現(xiàn)的細胞器。質(zhì)體負責光合作用、儲存產(chǎn)物(如淀粉)， 并且負責許多類別的分子(如脂肪酸、萜類、以及作為細胞構造單元(celluar building blocks)所需要的其它分子)的合成。質(zhì)體有能力來分化、或再分化成幾種形式，這取決 于它們在細胞中的作用。未分化的前質(zhì)體可以發(fā)展成為以下質(zhì)體中的任何一種，包括葉綠體、色質(zhì)體(chromoplasts)、白色體(Ieucoplasts)、造粉質(zhì)體(amyloplasts)、平衡石 (statoliths)、造油質(zhì)體(elaioplasts)、以及蛋白質(zhì)體(proteinoplasts)?！叭~綠體轉(zhuǎn)運肽”或“質(zhì)體運輸肽”或“質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽”或“靶向質(zhì)體的肽”或“轉(zhuǎn)運肽” 或“靶向肽”是必要的并且足以協(xié)助將蛋白輸入其天然宿主細胞的質(zhì)體之中。該質(zhì)體可以 是藍色小體或葉綠體。轉(zhuǎn)運肽被定位于輸入質(zhì)體中的蛋白質(zhì)的N端。轉(zhuǎn)運肽協(xié)助將可運作 地連接的多肽進入質(zhì)體中的共翻譯的或翻譯后的轉(zhuǎn)運。這些轉(zhuǎn)運肽一般包括40和100個之間的氨基酸。研究表明轉(zhuǎn)運鈦包含一些共同 的特征。這些包括它們幾乎沒有帶負電的氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰 胺；N端區(qū)域沒有帶電的氨基酸、并且沒有如甘氨酸或脯氨酸的氨基酸；它們的中心區(qū)域包 含非常高比例的堿性或羧基化的氨基酸，如絲氨酸或蘇氨酸；并且，它們的C端區(qū)域富含精 氨酸并且有能力形成兩親的β折疊二級結構。根據(jù)一個權威著作(Clineand Henry, Annu Rev Cell Dev Biol 12 1-26(1996))，來自高等植物的葉綠體轉(zhuǎn)運肽共享以下特征(1)它們具有與線粒體的轉(zhuǎn)運 肽表面上類似的特性。即它們富含羧基化的殘基并且缺少酸性殘基。(2)它們?yōu)?0-120個 殘基長。(3)N端的10-15個氨基酸沒有甘氨酸、脯氨酸以及帶電的殘基。(4)可變的、中間 的區(qū)域富含絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和精氨酸。(5)C-近端區(qū)域包含用于蛋白分解過程的寬 松保守的序列(Ile/Val-x_Ala/Cys*Ala)。(6)不存在延長的序列保護(conservation)或 保守的二級結構基序。(7)理論上，它們采取主要是隨機螺旋的構象。存在著幾種計算方法，它們使用以上特征來預測來自高等植物的葉綠體靶向序 列。計算工具包括PSORT (Nakai and Kanehisa, Proteins 11(2) 95-110 (1991) ；Horton et al. , Proceedings of the 4th Annual Asia PacificBioinformatics Conference APBC06, Taipei, Taiwan pp. 39-48 (2006) ；http://www. psort.org) > ChloroP(Emanuelsson et al. ,J Mol Biol 300 1005-1016(1999) ；http://www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/)或 TargetP(Nielsen et al. ,Protein Engineer 10:1-6(1997) ；Emanuelsson et al. ,J Mol Biol 300 1005-1016(2000) ；http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/).Glaucocystophytes是藻類的這樣一家族，包含藍色小體作為光合細胞器。 在 Glaucocystophyte 中存在幾個屬，包括 Cyanophora、灰胞藻屬(Glaucocystis)禾口 Gloeochaete0藍色小體本質(zhì)上是原始性質(zhì)體。不同于其它真核的質(zhì)體，藍色小體具有肽聚 糖層，該肽聚糖層據(jù)信是來自藍細菌的質(zhì)體的內(nèi)共生起源的殘遺物。Glaucocystophyte包 含光合色素葉綠素a。與紅藻類和藍細菌一起，它們通過藻膽體(phycobilisomes)(主要由 藻膽蛋白構成的)結構來收獲光。綠藻類和陸生植物已經(jīng)失去了這種色素。在所有這些質(zhì)體之中，Glaucocystophyte藍色小體與自由生存的藍細菌最接近 的親緣物。在藍色小體的細胞壁中存在的肽聚糖層有可能是藍色小體的蛋白輸入機構 的關鍵部分。參見 Steiner and Loffelhardt, MolecularMembrane Biology 22(1-2) 123-132(2005)對于藍色小體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位的綜述。高等植物的葉綠體已經(jīng)失去了這種肽 聚糖層并且因此在它們的膜結構上與藍色小體不同。已經(jīng)進一步證實，藍色小體與高等 植物的輸入機構不同之處在于因為藍色小體靶向的蛋白(鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原 酶)被輸入分離的豌豆和菠菜葉綠體中(Steiner and Loffelhardt, Trends Plant Sci 7:72-77(2002))；然而，高等植物葉綠體靶向的蛋白與藍色小體不能作用(Steiner and
5Loffelhardt Mol. Memb. Biol. 22 123-132(2005))。藍色小體轉(zhuǎn)運肽序列與靶向葉綠體基質(zhì)的肽不同之處在于在其N端結構域中含 有不變的苯丙氨酸殘基，這對于通過藍色小體的輸入是關鍵性的。參見，例如Steiner and Loffelhardt Trends Plant Sci. 7 72-77(2002)；禾口Steinerand Loffelhardt Mol. Memb. Biol. 22 :123-132 (2005)。這種不變的苯丙氨酸殘基對于藍色小體以及藻紅體(紅藻質(zhì) 體)是獨特的并且不是綠色譜系的生物體(綠藻、裸藻屬(Euglena)、硅藻(diatoms)以 及高等植物)中的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的特征。藍色小體轉(zhuǎn)運序列與來自高等植物的靶向基質(zhì)的 肽類在它們的氨基酸組成、在它們的正的凈電荷并且在它們的結構域結構方面對應。藍 色小體轉(zhuǎn)運肽的N端顯示了短的共有序列。參見Steiner et al. (2005)ThePlant J. 44 646-652(2005)。盡管不受限于任何作用機理，據(jù)信N端的苯丙氨酸殘基僅對于輸入藍色小 體中是必要的，因此，這種殘基在實踐本發(fā)明時可以被修飾并且仍然將多肽有效地轉(zhuǎn)運進 入高等植物葉綠體中。一起來看，以上數(shù)據(jù)對靶向藍色小體的序列將異源蛋白引導至高等植物的葉綠體 上的能力產(chǎn)生了疑問。盡管Cyanophora paradoxa的前-FNR分子能夠進入從豌豆中分離 的葉綠體中，但是并非必須能夠得出該FNR轉(zhuǎn)運肽在附接到異源蛋白時將能夠與該高等植 物分泌系統(tǒng)相互作用以將異源蛋白有效地靶向至葉綠體上。出人意料地，本申請描述了使 用藍色小體轉(zhuǎn)運肽將異源蛋白靶向至高等植物中的葉綠體上的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，該轉(zhuǎn)運肽是來自Glaucocystophyte，它在可運作 地連接至異源蛋白并且在轉(zhuǎn)基因高等植物中表達時，將該異源蛋白靶向至該葉綠體。該 Glaucocystophyte 選自下組Cyanophora、灰胞藻屬(Glaucocystis)、Gloeochaete 以及 Cyanophora paradoxa0本發(fā)明的另一個實施方案是將異源蛋白靶向至轉(zhuǎn)基因高等植物的葉綠體的方法， 該方法包括以下步驟將來自Glaucocystophyte的轉(zhuǎn)運肽可運作地連接至異源蛋白上并 且產(chǎn)生含該異源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其中該異源蛋白在該轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體中被檢出。 該Glaucocystophyte 選自下組Cyanophora、Glaucocystis、Gloeochaete 以及 Cyanophora Paradoxa0這些組合物包括對轉(zhuǎn)運肽連同其變異體進行編碼的核苷酸序列。在一個實施方案 中，該轉(zhuǎn)運肽包括SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列或其片段及變異體，連同SEQ ID NO=I 中列出的核苷酸序列及其變異體。組合物進一步包括DNA構建體，這些構建體含有編碼轉(zhuǎn) 運肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼異源多肽的核苷酸序列可操作連接。這些DNA構 建體在表達以及將該異源多肽的靶向到質(zhì)體中找到了用途。組合物還包括表達盒、載體、轉(zhuǎn) 化的植物、轉(zhuǎn)化的植物細胞、以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，其中異源多肽通過本發(fā)明的轉(zhuǎn)運肽 靶向到質(zhì)體上。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種轉(zhuǎn)運肽是來自Glaucocystophyte，它在可運作 地連接至異源蛋白并且在轉(zhuǎn)基因高等植物中表達時，將該異源蛋白靶向至該葉綠體上。轉(zhuǎn)運肽是源自將靶向至該Glaucocystophyte的藍色小體的蛋白進行編碼的核 酸序列。轉(zhuǎn)運肽可以在已知的要在宿主細胞的細胞核中被編碼但是在翻譯時將被靶向至 該宿主細胞的光合細胞器的基因中發(fā)現(xiàn)，并且可以選自下組，其組成為二磷酸核酮糖酯 羧化酶/加氧酶，5-烯醇丙酮酸莽草酸_3磷酸合成酶、乙酰乳酸合成酶、葉綠體核糖體蛋白CS17、Cs蛋白、鐵氧還蛋白、質(zhì)體藍素、二磷酸核酮糖羧化酶活化酶、色氨酸合成酶、酰 基載體蛋白、質(zhì)體伴侶素-60、細胞色素C552、22-kDA熱休克蛋白、33-kDA放氧增強蛋白 1 (oxygen-evolving enhancer protein 1)、ATP 合成酶 γ 亞基、ATP 合成酶 ω 亞基、葉綠 素-a/b-結合蛋白11-1、放氧增強蛋白2、放氧增強蛋白3、光系統(tǒng)I P21、光系統(tǒng)I P28、光 系統(tǒng)I P30、光系統(tǒng)I P35、光系統(tǒng)I P37、甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、葉綠素a/b結合蛋白、 CAB2蛋白、羥甲基-膽色烷合成酶(hydroxymethyl-bilane synthase)、丙酮酸-正磷酸二 激酶、CAB3蛋白、質(zhì)體鐵蛋白、鐵蛋白、早期光誘導蛋白、谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶、原葉綠素 還原酶、淀粉_粒子結合型淀粉酶合成酶、光系統(tǒng)II的集光葉綠素a/b-結合蛋白、主要花 粉變應原Lol ρ 5a、質(zhì)體ClpB ATP依賴性蛋白酶、超氧化物歧化酶、鐵氧還蛋白NADP氧化 還原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合成酶、ATP 合成酶CFO亞基1、2、3或4 ；細胞色素f、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、谷酰胺合成酶、谷酰胺 合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、熱休克蛋白hsp 21、磷酸轉(zhuǎn)運體、質(zhì)體CIpAATP依賴性蛋白 酶、質(zhì)體核糖體蛋白CL24、質(zhì)體核糖體蛋白CL9、質(zhì)體核糖體蛋白PsCL18、質(zhì)體核糖體蛋白 PsCL25、DAHP合成酶、淀粉磷酸化酶、根酰基載體蛋白11、甜菜堿_醛脫氫酶、GapB蛋白、谷 酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亞硝酸鹽還原酶、核糖體蛋白L12、核糖體蛋白L13、核糖體 蛋白L21、核糖體蛋白L35、核糖體蛋白L40、磷酸丙糖-3-磷酸甘油酸磷酸轉(zhuǎn)運體、鐵氧還蛋 白依賴性谷氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、NADP依賴性蘋果酸酶、以及NADP蘋果酸 脫氫酶。表1識別了含有質(zhì)體靶向序列的另外的核編碼的基因。在本發(fā)明的一個實施方案 中，轉(zhuǎn)運肽是來自Cyanophora pardoxa、具體來自C. pardoxa鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原 酶并且包括SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列。表1 對靶向到質(zhì)體上的蛋白進行編碼的核基因。參考文獻以其全文通過引用結 合在此。
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權利要求
分離的核酸，該核酸包括編碼來自Glaucocystophytes的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列與編碼異源多肽的第二核苷酸序列可操作連接。
2.如權利要求1所述的分離的核酸，其中該Glaucocystophytes是Cyanophora。
3.如權利要求1所述的分離的核酸，其中該Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxB。
4.如權利要求1所述的分離的核酸，其中該質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽選自下組SEQID N0s:2、3、5 禾口 7。
5.轉(zhuǎn)基因植物，包括編碼來自Glaucocystophytes的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽第一核苷酸序列，其 中所述第一核苷酸序列與編碼異源多肽的第二核苷酸序列可操作連接，其中所述異源多肽 靶向葉綠體。
6.如權利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該Glaucocystophytes是Cyanophora。
7.如權利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxB。
8.如權利要求6所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物是單子葉植物。
9.如權利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物是雙子葉植物。
10.如權利要求5-9任何一項所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽編碼選自下組的 多肽=SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
11.如權利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該單子葉植物是玉米或甘蔗植物。
12.如權利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該雙子葉植物是大豆或甜菜植物。
13.用于在植物中穩(wěn)定地表達異源多肽的方法，所述方法包括向所述植物中引入DNA 構建體，該構建體包括編碼來自Glaucocystophyte的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的第一核苷酸序列，其中 所述第一核苷酸序列與編碼所述異源多肽的第二核苷酸序列可操作連接。
14.如權利要求13所述的方法，其中該Glaucocystophyte是Cyanophora。
15.如權禾丨J要求13所述的方法,其中該Glaucocystophyte是Cyanophoraparadoxa。
16.如權利要求14所述的方法，其中該植物是單子葉植物。
17.如權利要求15所述的方法，其中該植物是雙子葉植物。
18.如權利要求13-17中任一項所述的方法，其中該質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽編碼選自下組的多肽 SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
19.如權利要求16所述的方法，其中該單子葉植物是玉米或甘蔗植物。
20.如權利要求17所述的方法，其中該雙子葉植物是大豆或甜菜植物。
21.分離的多肽，包括來自Glaucocystophyte的、與異源多肽可操作連接的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽。
22.如權利要求21所述的分離的多肽，其中該Glaucocystophyte是Cyanophora。
23.如權利要求21所述的分離的多肽，其中該Glaucocystophyte是Cyanophora paradoxB。
24.如權利要求21-23中任一項所述的分離的多肽，其中該植物是單子葉植物。
25.如權利要求21-23中任一項所述的分離的多肽，其中該植物是雙子葉植物。
26.如權利要求21-23中任一項所述的分離的多肽，其中該質(zhì)體轉(zhuǎn)運序列編碼選自下 組的多肽:SEQ ID NOs :2、3、5 和 7。
27.如權利要求24所述的分離的多肽，其中該單子葉植物是玉米或甘蔗植物。
28.如權利要求25所述的分離的多肽，其中該雙子葉植物是大豆或甜菜(sugarbeet) 植物。
全文摘要
在此提供了用于將多肽靶向到質(zhì)體上的組合物和方法。組合物包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽以及對此類轉(zhuǎn)運肽及其變異體進行編碼的核苷酸序列。組合物進一步包括DNA構建體，這些構建體含有對該質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽進行編碼的核苷酸序列，該質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽可運作地與編碼感興趣的多肽的核苷酸序列相連。這些DNA構建體在對該感興趣的多肽的表達以及將該感興趣的多肽靶向到質(zhì)體中找到了用途。組合物還包括表達盒、載體、轉(zhuǎn)化的植物、轉(zhuǎn)化的植物細胞、以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，其中通過本發(fā)明的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽將感興趣的多肽靶向至質(zhì)體上。
文檔編號C12N15/11GK101960011SQ200980107578
公開日2011年1月26日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權日2008年1月30日
發(fā)明者斯泰西·米爾斯, 格雷戈里·W·沃倫, 約翰·希普斯金德 申請人:先正達參股股份有限公司