專(zhuān)利名稱(chēng)：：頂泌細(xì)胞系的制作方法頂泌細(xì)胞系本發(fā)明涉及頂泌細(xì)胞系，特別地涉及展示長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系。除了外分泌腺外，頂泌腺分泌含有各種脂類(lèi)和氨基酸溶質(zhì)的含水液體(aqueousfluid)，其中，當(dāng)在人皮膚上暴露于皮膚細(xì)菌群時(shí)，所述溶質(zhì)被轉(zhuǎn)化成有臭味的化合物，包括類(lèi)固醇和短鏈脂肪酸。換句話說(shuō)，頂泌腺有助于人出汗。相當(dāng)多的研究仍在繼續(xù)進(jìn)行以發(fā)現(xiàn)阻礙在皮膚上產(chǎn)生有臭味的化合物的手段，但這受到缺少準(zhǔn)確模擬頂泌腺原位(即在人皮膚中)功能的頂泌細(xì)胞系的阻礙。準(zhǔn)確模擬頂泌腺原位(即在人皮膚中)功能的頂泌細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)將非常有價(jià)值，因?yàn)槠淇商峁┍疚闹刑峒暗囊粋€(gè)或多個(gè)益處。其使得能夠進(jìn)行更多的體外(相對(duì)于體內(nèi))研究。這可以(i)幫助鑒定頂泌腺內(nèi)導(dǎo)致出汗的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理，(ii)有助于篩選和鑒定用于減少形成有臭味的化合物的物質(zhì)，和(iii)幫助測(cè)定它們的有效濃度，即，當(dāng)局部施用于身體時(shí)用作除臭劑所需的濃度。存在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系還提供了鑒定除了出汗本身以外的腺體新功能的機(jī)會(huì)。與在長(zhǎng)期培養(yǎng)中維持其他分泌細(xì)胞的努力一樣，從頂泌培養(yǎng)物獲得的原代細(xì)胞系在喪失頂泌腺的形態(tài)學(xué)、表型和/或功能方面的特征之前，從未傳代超過(guò)數(shù)代。由RWicher等人的Andrologia35，pp342-350中標(biāo)題為"Establishingoftwoinvitromodelsofepithelialcellsfromtheapocrinesecretingratcoagulatinggland"的論文涉及來(lái)自大鼠的頂泌細(xì)胞，但未公開(kāi)展示長(zhǎng)期增殖的人源性頂泌細(xì)胞。此外，該論文中用于證明功能的細(xì)胞標(biāo)記不必然與人頂泌模型相關(guān)。此外，其作者似乎沒(méi)有尋求在冷凍和解凍后對(duì)它們的細(xì)胞進(jìn)行傳代，從而沒(méi)有證明它們的長(zhǎng)期增殖能力。由Z.Maras等人在InVitroCell.Dev.Biol.Animal第35巻，Nov-Dec(1999)，pp606-611中公開(kāi)的標(biāo)題為"CultivationofEpitheliafromtheSecretoryCoiloftheOvineApocrineGland;EvidenceofSecretoryCellFunctionandDuctalMorphogenesisinVitro"的論文涉及來(lái)自綿羊的頂泌細(xì)胞，類(lèi)似地，其同樣沒(méi)有公開(kāi)展示長(zhǎng)期增殖的人源性頂泌細(xì)胞系。由DieterC.Gruenert等人在InVitroCell.Dev.Biol.第26巻，April(1990)，pp411-416中公開(kāi)的標(biāo)題為"LongTermCultureofNormalandCysticFibrosoisEpithelialCellsgrownunderSerum—freeConditions"的論文涉及夕卜分泌細(xì)胞而非頂泌細(xì)胞，因此，其沒(méi)有公開(kāi)展示長(zhǎng)期增殖的人源性頂泌細(xì)胞系。輛,,本發(fā)明的目的是提供模擬頂泌腺出汗功能的頂泌細(xì)胞系，其可通過(guò)傳代培養(yǎng)在培養(yǎng)中得到保持，并且展示長(zhǎng)期增殖。輛,娜根據(jù)本發(fā)明，提供了展示長(zhǎng)期增殖的培養(yǎng)的頂泌細(xì)胞系。增殖，在本文中表示當(dāng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞保持分裂的能力，但并不意味著細(xì)胞系是永生的。長(zhǎng)期，在本發(fā)明中表示細(xì)胞在傳代培養(yǎng)(傳代)至少30代后仍然保持它們?cè)鲋车哪芰?。事?shí)上，當(dāng)細(xì)胞系已獲得這樣的長(zhǎng)期增殖時(shí)，其通常能夠展示經(jīng)歷傳代至少100或1000代的增殖。至少對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)的頂泌細(xì)胞系的實(shí)際目的來(lái)說(shuō)，經(jīng)歷這樣多代增殖的增殖是無(wú)限增殖的標(biāo)志。特別地，提供了已以保藏號(hào)07021301保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCulture)(ECACC)，PortonDown，Salisbury,SP4OJG，England,并且展示至少長(zhǎng)期增殖的人頂泌細(xì)胞系。輛日扁嫌輔錄麵齢白勺糊娜本文描述了長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系的產(chǎn)生以及隨后通過(guò)電生理、分子和生物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行的其表征和與原代培養(yǎng)頂泌細(xì)胞的比較。具體關(guān)于已經(jīng)被證明至少長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系A(chǔ)SG5，類(lèi)固醇合成和氣味(odour)前體化合物的分析得到了特別的關(guān)注。丁頁(yè)薩,m麵代麟通過(guò)下列方法獲得展示長(zhǎng)期增殖能力的頂泌細(xì)胞系。在之前已獲得相關(guān)倫理委員會(huì)和受試者的受試者同意書(shū)后，通過(guò)剪切年齡在30和70之間的婦女的腋窩皮膚(axillaryskin)來(lái)分離完整的頂泌腺。通過(guò)剪切處理破碎一些頂泌汗腺(apocrinesweatgland)，并且能夠從那些碎片培養(yǎng)細(xì)胞。顯微鏡觀察和中性紅吸收實(shí)驗(yàn)顯示通過(guò)剪切分離的頂泌腺完全由與管道分開(kāi)的曲腺(coil)組成。從大約50mmx5mm的腋窩皮膚樣品分離平均10至IOO個(gè)頂泌曲腺(apocrinecoil)。然后使用由Lee等人在J.CellSci.83:103-118，1986中提出的改良方法，在含有II型膠原酶(以2mgml—1的濃度)的WilliamsE培養(yǎng)基(本文中縮寫(xiě)成WEM)中，于37°CT，5%C02/空氣、95%相對(duì)濕度中溫育頂泌曲腺30分鐘。然后將曲腺在補(bǔ)充有10ngm戶(hù)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、10iigm廣胰島素、10ngml—1氫化可的松、10ygm廣全轉(zhuǎn)鐵蛋白(holotransferrin)、lmML-谷氨酰胺、100Uml—1青霉素和100ygml—1鏈霉素的不含酶的WEM中進(jìn)行清洗。每25cm2燒瓶用lml乳腺上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MammaryEpithelialGrowthMedium)(MEGM)(補(bǔ)充有10ngm廣EGF、10iigml—1胰島素、0.5ygml—1氫化可的松、30ygml—1牛垂體提取物、50ygml—1慶大霉素和50ngml—1兩性霉素)涂板大約15個(gè)頂泌腺。在于37°C下，在95%空氣/5%C02潮濕的培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)后，向各燒瓶中再加入3mlMEGM，之后每3天更換一次培養(yǎng)基。長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系(ASG5)-無(wú)限增殖的細(xì)胞系的標(biāo)志的產(chǎn)生和維持原代汗腺的分離和培養(yǎng)如前面所指出的，通過(guò)剪切分離完整未受損的人頂泌汗腺。頂泌腺的組織學(xué)檢查顯示剪切完全除去了短的吸收管(absorptiveduct)，只留下分泌曲腺部分保持完整。將分離的腺涂板在補(bǔ)充MEGM上。在2-3天后常規(guī)地觀察到，大約50%的被涂板的腺產(chǎn)生突起(outgrowth)。突起持續(xù)增殖最高達(dá)到20天，并且展示典型的'鵝卵石'上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)(如圖1中所示的，其顯示在外植后9天從頂泌曲腺生長(zhǎng)的細(xì)胞(A)和增殖的頂泌細(xì)胞(B)的相差顯微鏡照片)。在培養(yǎng)的早期階段，在觀察到突起之前，經(jīng)常在外植的腺的周?chē)^察到少量具有伸長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞不能在MEGM中增殖。增殖的頂泌細(xì)胞系來(lái)源于頂泌分泌曲腺的原代培養(yǎng)物。在MEGM中培養(yǎng)7天后，將有效的佛波酯(phorbolester)TPA(佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-醋酸酯；exCalbiochem，Nottingham,UK)以250nM的濃度加入到培養(yǎng)基中。獲得展示長(zhǎng)期增殖能力的細(xì)胞系的方法的重要特征是培養(yǎng)基包含有效濃度的佛波醇的酯(佛波醇可替換地也被稱(chēng)為l，la，lb，44，4a，7a，7b，8，9，9a_十氫_4a，7b，9，9a_四羥基_3_(羥甲基)_1，1，6，8_四甲基-5H-環(huán)丙[3，4]苯[1，2-e]甘菊環(huán)(azulen)-5-酮)。通常，酯特別合適地在12和/或13位包含至少脂肪族取代基，例如長(zhǎng)鏈烷基(C7至C24)和任選地還有短鏈烷基(C2至C6)。因此，本文中的方法能夠?qū)崿F(xiàn)制備展示無(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞系。在加入后3至4天，TPA誘導(dǎo)提前產(chǎn)生多層(prematuremultilayering)。然而，通過(guò)反復(fù)清洗除去上面的已分化層，以留下仍然附著至燒瓶的細(xì)胞的增殖單層。將增殖層的細(xì)胞傳代到96孔板中以產(chǎn)生克隆細(xì)胞系。將細(xì)胞在含有TPA的MEGM中維持、傳代和持續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行大約2個(gè)月。在該時(shí)期后，將細(xì)胞培養(yǎng)在單獨(dú)的MEGM中，并且監(jiān)控持續(xù)增殖。最初，許多亞克隆持續(xù)生長(zhǎng)，但在接下來(lái)IO代傳代結(jié)束時(shí)，大部分已開(kāi)始衰老。一種培養(yǎng)物(特別地ASG5)繼續(xù)生長(zhǎng)，現(xiàn)已在培養(yǎng)中得到維持，增殖超過(guò)40代，并且沒(méi)有生長(zhǎng)速率下降的跡象。這是展示無(wú)限增殖能力的標(biāo)志。該培養(yǎng)物在不存在TPA的情況下繼續(xù)增殖，可在深低溫保藏下存活，并被認(rèn)為是穩(wěn)定的。通過(guò)比較，原代頂泌汗腺培養(yǎng)物生長(zhǎng)最長(zhǎng)持續(xù)1個(gè)月和4代，并且不能在深低溫保藏下存活。本文中進(jìn)行傳代的展示長(zhǎng)期增殖的細(xì)胞培養(yǎng)物在形態(tài)學(xué)上與原代頂泌培養(yǎng)物相似，例如峰激動(dòng)劑響應(yīng)(peakagonistresponse)。因而，這類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)物能夠用于證明物質(zhì)是否能夠在體外展示除臭的性質(zhì)和/或物質(zhì)在體外展示除臭的程度，即是否能夠用作個(gè)人除臭劑。用于電牛理學(xué)的ASG5頂泌細(xì)胞的制備在13至18天后，將匯合的ASG5培養(yǎng)物傳代至Transwell涂布膠原的可滲透支持物(面積0.33cm2，Costar，貨號(hào)3495，HighWycombe，Bucks,UK)。這包括在2%EDTA中溫育20分鐘，接著用胰蛋白酶(0.5%)-EDTA(0.2%)處理大約5分鐘。將3xl()S個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至每個(gè)被補(bǔ)充WEM的Transwell中。將Transwell支持物在0.6ml的相同培養(yǎng)基中懸浮于24孔板中。對(duì)于原代培養(yǎng)物，只將第一代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)中。每?jī)商旄鼡Q一次在Transwell上水浴培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。電生理學(xué)使用與歐姆計(jì)連接的'筷子(chopstick)，電極(WPI，Alresford，Hants,UK)監(jiān)控Transwell上的跨上皮電阻(Trans印ithelialresistance)(TER)。通過(guò)減去濕潤(rùn)的過(guò)濾器空白對(duì)照的測(cè)量值來(lái)估計(jì)TER。在峰TER上，將Transwell支持物安裝在尤斯灌流室(UssingChamber)中。在改良的緩沖液中，在充氧并且維持在37°C，pH7.4，使用95%02/5%C02的條件下，水浴上皮。緩沖液由下列構(gòu)成(mM):NaC1，117;KC1，4.7;CaCl2，1.5;MgS04，1.2;NaHC03，25;和葡萄糖，ll.1。通過(guò)含有溶解在3M氯化鉀中的瓊脂的電橋(bridge)將與電壓/電流鉗連接的電壓和電流電極(分別為甘滎和銀/氯化銀，ABBKentTaylor,Stonehouse，Glos，UK)延伸至水浴中。在不存在Transwell的情況下平衡電壓電極，通過(guò)注入任意直流電補(bǔ)償電壓電極之間的射流電阻(fluidresistance)。在安裝Transwell后，上皮發(fā)生短路，使電流穩(wěn)定，通常進(jìn)行15分鐘。考慮到頂泌材料稀少，因此如Braydenetal(1988)J.Physiol，405:657-675，Pedersenetal(1992)Exp.Physiol，77;863-871，和Shenetal，(1994)Am.J.Physiol，266:L493_501所公開(kāi)的，通常接連加入藥物，并且記錄短路電流(rE)的變化。實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間通常為15至60分鐘。TER通過(guò)使用歐姆定律估計(jì)TER，常規(guī)地通過(guò)將電壓鉗制在±10mV并5且測(cè)量達(dá)到這一點(diǎn)時(shí)所需的電流。除非另外指出，除了向頂面加入的阿米洛利(amiloride)夕卜，向基底外側(cè)加入圖例中列出的所有藥物。阿米洛利是上皮Na+通道(ENaC)和Na+/H+交換器的抑制劑。Krebs緩沖液的改良在Krebs緩沖液(其中用葡萄糖酸鈉替代NaCl，葡萄糖酸鉀替代KC1以及CaS04替代CaCl》中進(jìn)行氯化物置換實(shí)驗(yàn)。使用11.lmM甘露醇作為維持同滲濃度(osmolality)的替代品來(lái)進(jìn)行無(wú)葡萄糖實(shí)驗(yàn)。在不存在硫酸根離子的情況下進(jìn)行其中將鋇用作鉀通道抑制劑的實(shí)驗(yàn)，以便MgCl2替代MgS04。;S底膽將增殖的頂泌培養(yǎng)物傳代至可滲透的支持物上，并且在峰TER時(shí)轉(zhuǎn)移至尤斯灌流室。此類(lèi)增殖的培養(yǎng)物的平均TER是395±40Qcm2(P<0.001)。對(duì)于增殖的頂泌培養(yǎng)物，靜息短路電流(Ise)為4.5±0.8Acm—2(p<0.001)。對(duì)于增殖的頂泌培養(yǎng)物，靜息跨上皮電位差(trans印ithelialpotentialdifference)(TEPD)為l.OmV，頂端為負(fù)極。軒銜云抑綱蘊(yùn),、P白條瞎軒相表1巾。增殖的培養(yǎng)物中的靜息1"對(duì)于10PM阿米洛利是敏感的，這確認(rèn)了鈉的重吸收是培養(yǎng)的汗腺上皮中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要組分。在頂端施用的阿米洛利(lOiiM)在增殖的頂泌培養(yǎng)物中減小靜息Isc4.5±1.OilAcm—2(n=20，P<0.001)。劑量反應(yīng)曲線顯示阿米洛利的ICs。是2-4iiM，以及10iiM阿米洛利是最大限度以上的劑量。還在頂泌培養(yǎng)物中檢查了呋塞米(NKCC1(上皮Na+-K+-Cr的協(xié)同運(yùn)輸?shù)鞍?從而為經(jīng)上皮的氯化物運(yùn)輸載體))的抑制劑)的作用。基底外側(cè)加入lmM呋塞米使已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物的靜息Isc減少0.8±0.30.2iiA(n=20，P<0.001)。表1.阿米洛利和呋塞米對(duì)培養(yǎng)的頂泌(原代和增殖的)細(xì)胞和外分泌汗腺細(xì)胞中的短路電流的作用。原代頂泌增殖的頂泌原代外分泌靜息I"8.4±0.94.5±0.88.6±1.0(liAcm—2)(n=57)(n=40)(n=22)Arc(yAcm—2)阿米洛利-6.0±0.9**-4.2±1.0-7.1±0.7(10iiM)(n=49)(n=20)(n=22)呋塞米-0.5±0.2-0.8±0.3nd(ImM)(n=13)(n=20)麵割應(yīng)乍ffl雄云力齊l薩巾白勺柳用10M阿米洛利預(yù)處原代頂泌培養(yǎng)物和增殖的頂泌培養(yǎng)物以確定鈉的重吸收在激動(dòng)劑響應(yīng)中的作用。附圖2顯示在存在阿米洛利的情況下原代頂泌培養(yǎng)物、外分泌培6養(yǎng)物和增殖的頂泌培養(yǎng)物中Ise的峰增加。向Transwell上的培養(yǎng)物的基底外側(cè)加入激動(dòng)齊U。圖中的各條塊(bar)代表n=10的最小值。顯示在存在頂端阿米洛利(10yM)的情況下短路電流的峰增加。向基底外側(cè)加入激動(dòng)劑卡巴膽堿(Carbachol)(CCh;20yM)、異丙腎上腺素(Iso;10iiM)、L-緩激肽(LBK;170nM)、組胺(His;200yM)和三磷酸腺苷(ATP;100iiM)。使用斯圖登(student's)非配對(duì)t檢驗(yàn)和威爾科克森(Wilcoxon)檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性。圖2顯示阿米洛利預(yù)處理在長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系A(chǔ)SG5中顯著減少對(duì)CCh、His和ATP的響應(yīng)，這暗示鈉的重吸收是此類(lèi)反應(yīng)的組成部分。圖3顯示原代頂泌培養(yǎng)物、外分泌培養(yǎng)物和增殖的頂泌培養(yǎng)物中Ise的峰增加。向Transwell上的培養(yǎng)物的基底外側(cè)加入激動(dòng)劑。顯示短路電流的峰增加。向基底外側(cè)加入激動(dòng)劑CCh(20iiM)、Iso(10iiM)、LBK(170nM)、His(200iiM)和ATP(100iiM)。圖4A和4B是關(guān)于ASG5細(xì)胞中離子通道抑制劑對(duì)響應(yīng)卡巴膽堿影響的代表性Ise的記錄(跡線(trace))。圖4A顯示使用阿米洛利(lOyM)的頂端預(yù)處理和ImM呋塞米(Fru)禾P50iiM氯化鋇(Ba;maxi-K通道阻斷劑)的加入對(duì)響應(yīng)CCh(20yM)的影響。圖4B顯示使用lmM阿米洛利的頂端預(yù)處理和阿米洛利和氯化鋇對(duì)響應(yīng)CCh的影響。圖4A中的增殖的頂泌培養(yǎng)物的代表性跡線也顯示，與圖3中觀察到的激動(dòng)劑剌激的值相比較，卡巴膽堿剌激在阿米洛利預(yù)處理后減小。在四種情況下，將完整的頂泌分泌曲腺直接外植至可滲透的支持物上，以確定頂泌培養(yǎng)物的原代培養(yǎng)和傳代是否影響它們的電生理特性。在被檢測(cè)的培養(yǎng)物中，無(wú)論在存在阿米洛利或不存在阿米洛利的情況下，基礎(chǔ)電生理特性和經(jīng)激動(dòng)劑剌激的電生理特性與原代培養(yǎng)物沒(méi)有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)?？缟掀ぢ然镛D(zhuǎn)運(yùn)在響應(yīng)瞬時(shí)激動(dòng)劑中的作用為了進(jìn)一步表征原代和增殖的頂泌培養(yǎng)中激動(dòng)劑誘導(dǎo)的響應(yīng)的離子基礎(chǔ)，檢查跨上皮氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。在無(wú)氯化物的條件下，原代和增殖的頂泌培養(yǎng)物的靜息I"分別是6.0士0.8iiAcm—2禾P3.1±0.6iiAcm—2。靜息TEPD是-0.9mV(對(duì)于原代培養(yǎng)物)和-1.8mV(對(duì)于增殖的培養(yǎng)物)。10i!M阿米洛利的加入使基線I"在原代培養(yǎng)物中減小3.6iiAcm—2以及在增殖的培養(yǎng)物中減小2.5iiAcm—2。當(dāng)與在存在氯化物的情況下的相同實(shí)驗(yàn)相比時(shí)，在原代和增殖的頂泌培養(yǎng)物中對(duì)卡巴膽堿、組胺和ATP的響應(yīng)顯著減小(表2)，這暗示氯化物的轉(zhuǎn)運(yùn)確實(shí)在介導(dǎo)響應(yīng)激動(dòng)劑中發(fā)揮重要作用。此外，圖4B顯示來(lái)自增殖的培養(yǎng)物的代表性跡線，其顯示，與圖3中的值相比較，使用呋塞米的預(yù)處理減小了對(duì)卡巴膽堿響應(yīng)的強(qiáng)度(magnitude)。在激動(dòng)劑剌激后加入呋塞米在原代和經(jīng)轉(zhuǎn)化的頂泌培養(yǎng)物中誘導(dǎo)了響應(yīng)的快速減小，這證明了NKCC1在調(diào)節(jié)氯化物吸收中的作用。(表3)。表2.在無(wú)氯化物的緩沖液中頂泌培養(yǎng)物的峰激動(dòng)劑響應(yīng)。A:原代頂泌培養(yǎng)物B:增殖的頂泌培養(yǎng)物(ASG5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>當(dāng)與在含有氯化物的緩沖鹽中進(jìn)行的阿米洛利預(yù)處理相比較時(shí)，阿米洛利預(yù)處理顯著減小激動(dòng)劑響應(yīng)，但它們未完全消失(特別是在增殖的培養(yǎng)物中)，這暗示其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑也在這些響應(yīng)中起作用(表4)。表4.射可雄禾l予麵,a氯扁,蘭時(shí)隱咅斜勿謹(jǐn)敫云力齊l薩。A:原代頂泌培養(yǎng)物B:增殖的頂泌培養(yǎng)物。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>總地說(shuō)來(lái)，這些結(jié)果表明增殖的細(xì)胞系繼續(xù)展示與原代培養(yǎng)物相同的特征。錢(qián)鵬白垂必,麵巾頓人皮膚和其相連的附屬物能夠行使許多種代謝功能，包括參與激素代謝和合成的那些功能。在需要許多酶轉(zhuǎn)化的生物合成途徑中從親本前體膽固醇合成雄激素(性類(lèi)固醇激素)。當(dāng)頂泌腺在青春期開(kāi)始發(fā)揮作用時(shí)，雄激素很可能在調(diào)控腺的活性中起一些作用。這進(jìn)一步得到已在存在于腋窩皮膚中的頂泌腺的分泌細(xì)胞中檢測(cè)到雄激素受體(Beier等人，(2005)Histochem.CellBiol.，123:61-65)的事實(shí)的支持。因?yàn)轭?lèi)固醇的局部或胞內(nèi)分泌生成潛在地在介導(dǎo)細(xì)胞功能中起著重要作用(Labrie，F(xiàn).等人，(1991)，Mol.CellEndocrinol.，78:113-118)，因而就本文中的無(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞系中活性雄激素和雌激素以及它們的相關(guān)受體的形成研究相關(guān)(responsible)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。肝石蹄白備柳誠(chéng)化學(xué)試劑TaqDNA聚合酶和分子標(biāo)記III購(gòu)自Roche，MannheimGermany。按照廠商的推薦使用TaqDNA聚合酶。從Sigma-Aldrich，Gillingham，區(qū)獲得所有其他試劑。菌株(Styain)、質(zhì)粒、培養(yǎng)某和培養(yǎng)條件9在所有克隆方法中將大腸桿菌(E.coli)菌株T0P10(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)用作宿主菌株。從Invitrogen獲得預(yù)先消化的包含poly-T突出端的載體pCR4-T0P0⑧并且按照廠商說(shuō)明書(shū)使用。在37t:下于旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上，在補(bǔ)充有適當(dāng)?shù)倪x擇壓力(卡那霉素50g/ml)的LB培養(yǎng)基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/1NaCl)中培養(yǎng)細(xì)菌。細(xì)胞材料如上文中所述，培養(yǎng)作為無(wú)限增殖標(biāo)志的長(zhǎng)期增殖的頂泌腺細(xì)胞。為了克隆目的，在37t:下培養(yǎng)10天后收獲細(xì)胞。誠(chéng)棚白始成扁薛所使用的所有寡核苷酸都由Sigma-GenosysLtd，Pampisford，區(qū)合成。使用ABIPrism3100GeneticAnalyser，利用通用的M13正向和反向引物進(jìn)行測(cè)序。質(zhì)粒DNA的分離使用Qiagen(Crawley，區(qū))mini-pr印試劑盒獲得質(zhì)粒DNA用于進(jìn)行克隆和測(cè)序。從來(lái)源于無(wú)限增殖的頂泌腺細(xì)胞的cDNA克隆參與類(lèi)固醇雄激素代謝的轉(zhuǎn)錄物的片段。使用來(lái)自Ambion，Huntingdon,UK的RNAqueousTM-4PCR試劑盒從細(xì)胞分離RNA。使用AmbionRETROscript試劑盒，用oligo(dt)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。用于擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序是1個(gè)循環(huán)(120秒@95°C)，30個(gè)循環(huán)(30秒@95°C，30秒@60°C，45秒或60秒@72°0，1個(gè)循環(huán)(7分鐘t72tO，使用T叫DNA聚合酶)。用于從各轉(zhuǎn)錄物克隆片段的引物列出于表5中。表5.用于克隆參與雄激素代謝的基因片段的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所有基因片斷(其引物對(duì)設(shè)計(jì)成如表5所列)都能被檢測(cè)。附圖5展示了產(chǎn)生的所有PCR產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠。圖5顯示下列基因片段的表達(dá)1.類(lèi)固醇硫酸酯酶；2.313羥基-A-5-類(lèi)固醇脫氫酶1;3.羥基類(lèi)固醇17P-脫氫酶3;4.羥基類(lèi)固醇17P-脫氫酶5;5.羥基類(lèi)固醇17P-脫氫酶7;6.5a還原酶I;7.CYP19A1芳香酶；8.雄激素受體；9.雌激素受體P;M.DNA標(biāo)記III。然后將這些PCR產(chǎn)物克隆到準(zhǔn)備用于測(cè)序的TOPO載體中。對(duì)各PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)各克隆的片段的身份。下面給出基因測(cè)序的結(jié)果。類(lèi)固醇硫酸酯tt的片段的序列GCAGCGCCTGGGGACCAGACAGACGCATGTGGAAGGGC3P羥某-A-5-類(lèi)固醇脫氫酶l的片段的序列CCCGGCTACCTCTGGGCTACTGGTGTAGATGAAGACTGGCAAGGGC羥某類(lèi)固醇17P-脫,氫酶3的片段的序列GAGGTGATGTTACAATGGATGAGGAAGGGC羥某類(lèi)固醇17P-脫,氫酶5的片段的序列5a還原酶I的片段的序列TCCTACTGTGTAACAGGTCAGAATTNCANGGGCCYP19A1芳香酶的片段的序列TTTGCGCATGACCAAGTCCACGACAGGCAAGGGC友慰敫素受體的片段的序列14ATGGCAAACACCATGAGCCCCATCCAGAAGGGC隱m別本P白勺服白術(shù)llACAGCTCTCCAAGAAGGGC這些結(jié)果清楚地表明無(wú)限增殖的頂泌腺細(xì)胞系正在表達(dá)雄激素和雌激素合成所需的許多基因。附圖6列出了可基于已顯示在無(wú)限增殖的頂泌腺細(xì)胞系中表達(dá)的基因闡明的類(lèi)固醇合成途徑。此外，這些細(xì)胞還表達(dá)介導(dǎo)對(duì)此類(lèi)雄激素和雌激素的產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答所必需的受體即雄激素受體和雌激素13受體。有趣地，未檢測(cè)到用于雌激素a受體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物(數(shù)據(jù)未顯示)。這與之前的研究相一致，所述研究證明，通過(guò)使用針對(duì)兩者受體類(lèi)型的免疫組織化學(xué)染色，可在腋窩皮膚切片的頂泌腺分泌細(xì)胞中檢測(cè)到雌激素P受體，但未檢測(cè)到雌激素a受體(Beier，K.等人(2005)Histochem.CellBiol.，123:61-65)。相同的研究還證明在頂泌腺分泌細(xì)胞中存在雄性受體。附圖6中的數(shù)據(jù)證明，無(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞系保持在體內(nèi)和原代培養(yǎng)物中觀察到的分泌頂泌腺細(xì)胞的許多生成類(lèi)固醇的特征。該細(xì)胞系提供了用于研究頂泌腺中類(lèi)固醇代謝和類(lèi)固醇在調(diào)節(jié)腺的活性中的作用的優(yōu)秀工具。此外，細(xì)胞系將用作非常重要的工具，所述工具用于估計(jì)化合物在通過(guò)干擾這些細(xì)胞中生成類(lèi)固醇的途徑而調(diào)節(jié)腺活性中的功效。無(wú)限增殖的頂泌腺細(xì)胞系中頂泌分泌活性的細(xì)胞標(biāo)記。頂泌汗腺的主要功能是在對(duì)情緒剌激的直接反應(yīng)中產(chǎn)生富含脂的分泌物，該分泌物通過(guò)毛囊的管道被遞送至皮膚表面。分泌物是沒(méi)有氣味的，但經(jīng)歷細(xì)菌分解后，其導(dǎo)致腋15窩臭味的產(chǎn)生。頂泌腺的分泌功能與參與這些至關(guān)重要過(guò)程的許多蛋白質(zhì)相關(guān)。ABCC11蛋白屬于參與嘌呤和嘧啶核苷酸類(lèi)似物例如cAMP和cGMP流出(efflux)的ATP-結(jié)合盒運(yùn)載體的家族(Guo等人.，(2003)J.Biol.Chem.，278:29509-29514)。該蛋白質(zhì)牽涉人的耵聹頂泌腺(ce進(jìn)i麗sapocrinegland)中耳柜的分泌(Yoshiura等人.，(2006)Nat.Geh.，38:324-330)。人耳垢通常由干和濕類(lèi)型組成。干耳垢通常存在于東亞人中，然而濕耳垢通常存在于其他群體。ABCCll基因中的SNP538G—A被認(rèn)為負(fù)責(zé)耳垢類(lèi)型的確定。具有A等位基因的細(xì)胞顯示比具有G等位基因的細(xì)胞低的cGMP分泌活性。A等位基因頻率顯示全球從北至南以及從東至西的下降地理梯度。在世界范圍內(nèi)，在這些區(qū)域的各種族人群中保持干耳垢類(lèi)型比例最高的是中國(guó)人和朝鮮人。腋窩氣味水平的提高與濕型耳垢相關(guān)，這被認(rèn)為是腋窩頂泌腺功能的直接結(jié)果。已顯示在頂泌腺分泌中起著重要作用的另一種蛋白質(zhì)是載脂蛋白D，Spielman，A.I.(1995)Experientia，50:40-47。已顯示該蛋白質(zhì)用作豐富的氣味分子E-3-甲基_2_己酸(3M2H)的載體媒介物。研究已證明，在頂泌分泌中，3M2H通過(guò)與兩個(gè)蛋白質(zhì)頂分泌氣味蛋白1和2(AS0B1和AS0B2)結(jié)合而被運(yùn)送至皮膚表面。AS0B2蛋白后來(lái)被鑒定為載脂蛋白D(即oD)，已知的載體蛋白(也稱(chēng)為脂鈣蛋白(lipocalin))的a^-微球蛋白超家族的成員(Zeng等人.，(1996)，93:6626-6630)。對(duì)于即oD的免疫反應(yīng)性已被定位至腋窩組織切片的頂泌腺(Spielman等人，(1998)134，813-818)，這表明至少一種3M2H的糖蛋白載體定位在頂泌腺中。巨囊性病(Grosscysticdisease)分泌液是由幾種糖蛋白(包括GCDFP-15)組成的來(lái)自乳腺的病理分泌物。GCDFP-15已被定位在頂泌汗腺化生被覆上皮乳腺囊腫(apocrinemetaplasticepitheliumliningbreastcyst)中禾口月夜窩、夕卜陰、目艮險(xiǎn)禾口耳道(earcanal)的頂泌腺中(Mazoujian等人.，1983Am.J.Pathol.，110:105-112)。GCDFP-15與Gpl7/分泌型肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(已在精囊、唾液腺和汗腺中鑒定的SABP/額外腮腺糖蛋白(EP-GP)(Autiero等人，(1991);Exp.CellRes.，197:268-271)相同，該蛋白質(zhì)還與催乳素誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)(PIP)(Murphy等人.，(1987);J.Biol.Chem.，262:15236-15241)相同。GCDFP-15因而是頂泌上皮的特異性組織標(biāo)記。鋅…糖蛋白(ZAG)是最早從人血漿分離的(Burgi等人，(1961);J.BiolChem;236，1066-1074)，并且隨后在肝、乳腺、胃腸道和汗腺的分泌型上皮細(xì)胞(Tada等人.，(1991)J.HistochemCytochem，39，1221-1226)中發(fā)現(xiàn)的43kDa可溶性糖蛋白。ZAG在某些惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，這樣其可用作癌癥標(biāo)記(Diez-Itza等人.，(1993)，Eur.J.CancerA29，1256-1260;Hale等人，(2001)，CancerRes.，7,846-853)。ZAG的生物學(xué)功能大部分是未知的，但已顯示其用作脂肪動(dòng)員因子(lipidmobilizingfactor)(Todorov等人.，(1998)，CancerRes.，58,2353-2358)和新型脂肪因子(adipokine)，其可參與脂肪組織功能的局部調(diào)節(jié)(Bao，等人，(2005)FEBSLetters,579，41-47)。由于ABCCll、ApoD、GCDFP-15和鋅-a-糖蛋白在頂泌腺的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用，因而我們?cè)跓o(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞系中觀察負(fù)責(zé)此類(lèi)蛋白質(zhì)的翻譯的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。用于克隆基因轉(zhuǎn)錄物片段的引物示于表6中。表6.用于克隆參與頂泌分泌過(guò)程的基因片段的引物。16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>所有基因片斷(其引物對(duì)被設(shè)計(jì)成表6所示)都能被檢測(cè)。附圖7展示了產(chǎn)生的所有PCR產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠。附圖7.展示頂泌標(biāo)記的瓊脂糖凝膠公開(kāi)了下列產(chǎn)物分別示于第1至4泳道。l.ABCCll轉(zhuǎn)運(yùn)體；2.載脂蛋白D;3.鋅-a-糖蛋白；4.GCDFP—15然后將這些PCR產(chǎn)物克隆到準(zhǔn)備用于測(cè)序的TOPO載體中。對(duì)各PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)各克隆的片段的身份。下面給出基因測(cè)序的結(jié)果。ABCC11的片段的序列AGCAGTTGGGGAATGTTG載脂蛋白D的片段的序列GCDFP-15的片段的序列鋅-a-糖蛋白CCCCCGCAGGACACAGCCCCCTACTCCTGCCACAAGGGC無(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞系表達(dá)與細(xì)胞分泌過(guò)程相關(guān)的ABCC11基因。測(cè)序數(shù)據(jù)確認(rèn)了ABCCI1轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的本體。該細(xì)胞系中基因的基因型是G(538G—A，被加亮并且在下面劃線強(qiáng)調(diào)的)并且與濕耳垢類(lèi)型和腋窩氣味水平的提高相關(guān)。載脂蛋白D載體基因也被表達(dá)，這表明在細(xì)胞系中也正在制造氣味運(yùn)輸所必需的機(jī)制。數(shù)據(jù)提供了該細(xì)胞系的頂泌表型和其在提供用于頂泌腺生物學(xué)的研究的強(qiáng)有力工具中的有用性的進(jìn)一步證據(jù)。細(xì)胞化學(xué)組成-材料和方法分別在第7和14天收獲無(wú)限增殖的頂泌細(xì)胞(第44代)。以1000rpm離心細(xì)胞5分鐘，然后在PBS中清洗1次，再離心，然后在-S(TC下貯存以備分析。3M2H谷氨酰胺綴合物的分析使用10iil(N-甲基-N-叔-丁基二甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)、1%18叔-丁基二甲基甲硅烷(TB匿S)禾PlOiU嘧啶和liU三乙胺，從冷凍的細(xì)胞沉淀提取3-甲基-2-己酸谷氨酰胺綴合物。在試劑中對(duì)樣品進(jìn)行衍生化作用。將混合物在7(TC下保持1小時(shí)。使用AgilentTechnologies6890/5973氣相色譜儀/質(zhì)譜選擇數(shù)據(jù)系統(tǒng)和AgilentHP5-MS柱子(30mx0.25mmidxO.25ym薄膜)(具有經(jīng)選擇的離子監(jiān)控)通過(guò)氣相色譜分析3M2H谷氨酰胺衍生物，id表示內(nèi)徑。使用的溫度程序是以10°C/分鐘從7(TC至270°C。使用嵌入式軟件自動(dòng)計(jì)算峰面積。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法和已知標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間鑒定結(jié)構(gòu)。剛酉享禾口爐、'琉白彌斤使用201氯仿從冷凍的細(xì)胞沉淀提取膽固醇和角鯊烯。然后將該提取物直接注射入GC(詳情如上)并且使用AgilentHP5-MS柱(30mx0.25mmidxO.25ym薄膜)在完全掃描下對(duì)其進(jìn)行分析。烘箱程序是以1(TC/分鐘從7(TC至27(rC。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法和已知標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間鑒定結(jié)構(gòu)。,月旨隨使用201氯仿從冷凍的細(xì)胞沉淀提取短鏈脂肪酸。然后將該提取物直接注射入GC(詳情如上)并且使用HP-Innowax柱子(30mx0.25mmidx0.25ym薄膜)利用選擇離子監(jiān)控對(duì)其進(jìn)行分析。烘箱程序是以5t:/分鐘從7(rC至24(rC。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法和已知標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間鑒定結(jié)構(gòu)。3M2H谷氨酰胺綴合物的相對(duì)水平示于附圖8中。在培養(yǎng)7天和14天后收獲的頂泌細(xì)胞中膽固醇的相對(duì)水平示于附圖9中。在培養(yǎng)7天和14天后收獲的頂泌細(xì)胞中角鯊烯的相對(duì)水平示于附圖10中。短鏈脂肪酸的相對(duì)水平示于附圖11中。還在14天的樣品中檢測(cè)到C16/18脂肪酸。本文中概述的顯示各種揮發(fā)性脂肪酸的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，無(wú)限增殖的細(xì)胞系成功地模擬了頂泌腺的功能。抑制劑的研究有臭味的前體化合物的產(chǎn)生和細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖預(yù)期受到化合物(已知所述化合物干擾代謝雄激素的酶)的作用的調(diào)控。可通過(guò)向培養(yǎng)基加入已知干擾代謝雄激素的酶的拮抗劑或直接使用雄激素受體來(lái)使細(xì)胞的增殖和有臭味的前體化合物的產(chǎn)生減弱。此類(lèi)化合物預(yù)期在培養(yǎng)物中和在存在于腋窩皮膚中的頂泌腺中減少氣味前體分子的合成和分泌。此類(lèi)化合物包括但不限于17a-取代的節(jié)基雌二醇三環(huán)香豆素氨基磺酸鹽雌酮-3-0-氨基磺酸鹽三環(huán)噁庚氨基磺酸鹽2-甲氧基雌酮-3-0-氨基磺酸鹽取代的色烯酮(chromenone)氨基磺酸鹽17a-節(jié)基(或4'_叔_丁基節(jié)基)雌_1，3，5(10)-三烯]1713-(N-烷基氨甲?；?_雌-1，3，5(10)-三亞乙基四胺-3_0_氨基磺酸鹽曲洛司坦環(huán)丙氯地孕酮(Cyanoketone)醋酸環(huán)丙氯地孕酮(Cyproteroneacetate)炔諾孕酮(Norethidrone)炔諾酮噻唑烷二酮類(lèi)16-(溴烷基)-雌二醇黃酮類(lèi)異黃酮類(lèi)木脂素類(lèi)(Lignans)三氟甲基乙炔secoestradiol雌二醇的6P-(thiah印tanamide)衍生物在第17位上包含螺旋_Y_內(nèi)酯的雌酮7a-硫代烷基和7a-硫代芳基螺內(nèi)酯的衍生物N-丁基-N-甲基-ll-(3'-羥基_21'，17'-羧內(nèi)酯_19'_去甲_17'a-孕甾-l'，3'，5'(10')-三烯-7'a-基)-^^一酰胺(undecanamide)1，4-雄烯二醇_1，6，17-三酮雄酮33-取代的衍生物4-氮雜類(lèi)固醇(MK386)6-氮雜甾體17P_氨甲酰三芳基酯(carboxamidetriaryl)8-氯-4-甲基-l，2，3，4，4a，5，6，10b-八氫-苯并[f]喹啉-3(2H)-酮(LY191704)6-[4-(N，N-二異丙基氨甲?；?苯基]_N_甲基-喹啉_2_酮5)苯并[c]喹嗪-3-酮表兒茶精-3-沒(méi)食子酸酯表沒(méi)食子兒茶精-3-沒(méi)食子酸酯蘇拉明(Suramin)鋅壬二酸6-[4-(N，N-二異丙基氨甲?；?苯基]-1H-喹啉_2_酮44-[3-[5-芐基-8-(2_甲基)丙基_10，11-二氫二苯[b，f]氮雜萆_2_]羧氨基]苯氧基]丁酸妥羅雄脲(Turosteride)MK-434二氫非那雄胺醋酸氯地孕酮(chlormadinone)TZP-4238依立雄胺(SK&F105657，0N0-9302)17a-雌二醇17-(5'-異噁唑基)雄-4，16-二烯-3-酮N-(1，1，1，3，3，3-六氟苯基_丙基)_3_氧代_4_氮雜_5a-雄-1-烯-17P-羧20酰胺(PNU157706)度他雄胺異乙諾酮(TSAA-291:16P-乙基-17P羥基_4_雌_3_酮)19-去甲-10-偶氮甾醇類(lèi)具有與甾體D-環(huán)連接的肟基的基于黃體酮的類(lèi)固醇類(lèi)苯喹唑啉鋸葉棕櫚提取物(Serenoar印ensextract)哌米松Artocarpusincisus茜素姜黃素鹽酸異丙嗪衍生物肉豆蔻酸Y-亞麻酸4-[3-[3-[雙(4-異丁基苯基)_甲基氨基]苯甲酰基]_1H_噴哚_1_基]丁酸(FK143)氟他米特螺內(nèi)酯已顯示許多化合物減少皮膚中的細(xì)胞(包括來(lái)源于表皮附屬物例如皮脂腺的那些細(xì)胞)的增殖。此類(lèi)化合物，當(dāng)與頂泌細(xì)胞接觸時(shí)，預(yù)期在培養(yǎng)物中和在存在于腋窩皮膚中的頂泌腺中減少氣味前體分子的合成和分泌。此類(lèi)化合物包括但不限于13-順-視黃酸視黃酸通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行的人頂泌細(xì)胞系A(chǔ)SG5的超微結(jié)構(gòu)分析樣品制備如之前所描述的，將傳代數(shù)47的ASG5細(xì)胞在37。C下于95%空氣/5%C02的濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)于MEGM中。分別在溫育3和14天后收獲細(xì)胞。在固定之前，將細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水pH7.5中清洗兩次。透射電子顯微鏡術(shù)將經(jīng)清洗的細(xì)胞培養(yǎng)物在室溫下于3%的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液pH7.4中的戊二醛中固定l小時(shí)。將樣品在O.1M二甲砷酸鹽緩沖液pH7.4中清洗3次，每次5分鐘。在初期固定后，將樣品在室溫下于1%的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液pH7.4中的四氧化鋨中固定1小時(shí)。將樣品在0.1M二甲砷酸鹽緩沖液pH7.4中再清洗3次，每次5分鐘。然后通過(guò)乙醇的系列梯度對(duì)樣品進(jìn)行脫水。將細(xì)胞包埋在Luft'sEpon樹(shù)脂中并且在6(TC下聚合48小時(shí)。在設(shè)置成產(chǎn)生大約120nm厚切片的Reichert"UltracutS"超薄切片機(jī)上對(duì)包埋塊進(jìn)行切片。將切片撈在200目六角形的薄板(thinbar)銅網(wǎng)上。在LeicaEM染色機(jī)上，將切片在醋酸鈾中染色，然后進(jìn)行硝酸鉛染色。在于120kV下運(yùn)行的PhilipsCM120透射電子顯微鏡中檢查經(jīng)染色的切片。將圖像數(shù)字化記錄為.tif文件，在本文中顯示為圖12至15(對(duì)于3天大小的培養(yǎng)細(xì)胞)和圖16及17(對(duì)于14天大小的培養(yǎng)細(xì)胞)。結(jié)果圖12、13和16中顯示的細(xì)胞展示培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞典型的圓形或"鵝卵石樣"外觀。根據(jù)大量鑒定為"M"的微絨毛(圖12U3、14、16和17)和稱(chēng)為"A"的頂小泡(即icalbleb)(圖12、15和16)在管腔膜上的存在，結(jié)合大量稱(chēng)為"S"的分泌粒(圖12至17)在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中的存在，證明了細(xì)胞的分泌性質(zhì)。頂端細(xì)胞質(zhì)(apicalcytoplasm)的小部分即微絨毛"M"和頂小泡"A"的擠壓斷離構(gòu)成了頂分泌過(guò)程(Montagna等人.(1953)Histologyandcytochemistryofhumanskin.V.Axillaryapocrinesweatglands.Am.J.Anat.，92:451-470)。所有細(xì)胞包含大量稱(chēng)為"S"的分泌粒(圖12至17)，盡管不可會(huì)g按照(Bell(1974)Theult:rastructureofhumanaxillary即ocrineglandsafter印in印hrineinjection.J.Invest.Dermatol.，63:147-159)來(lái)區(qū)分I型和II型顆粒。顆粒包含高電子_不透明顆粒，從而推測(cè)包含小脂滴。在大多數(shù)細(xì)胞中觀察到稱(chēng)為"V"的許多"空"囊泡(圖12、13、14、16和17)。這可能是固定過(guò)程使囊泡的內(nèi)含物丟失導(dǎo)致的結(jié)果。此類(lèi)囊泡可能參與分泌過(guò)程。圖13和16中的細(xì)胞在外觀上是相當(dāng)扁平的并且清楚地顯示稱(chēng)為"NI"的核仁。在來(lái)自3和14天大小的ASG5培養(yǎng)物的所有細(xì)胞中，觀察到頂小泡"A"、管腔微絨毛"M"和大量分泌粒"S"，確認(rèn)了這些細(xì)胞展示典型的活性頂分泌形態(tài)學(xué)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明ASG5細(xì)胞系的頂泌性質(zhì)和提供了該細(xì)胞系用作人腋窩頂泌汗腺的功能代表性細(xì)胞模型的有效性的額外證據(jù)。2權(quán)利要求展示長(zhǎng)期增殖的頂泌細(xì)胞系。2.根據(jù)權(quán)利要求l的細(xì)胞系，其來(lái)源于人頂泌腺。3.根據(jù)權(quán)利要求l的細(xì)胞系，其展示頂泌腺的特征性質(zhì)。4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的細(xì)胞系，其能夠無(wú)限增殖。5.保藏號(hào)為ECACC07021301的細(xì)胞系。6.獲得展示長(zhǎng)期增殖的培養(yǎng)細(xì)胞系的方法，其包括下列步驟從初生組織分離頂泌細(xì)胞，在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)所分離的細(xì)胞，從所述第一培養(yǎng)基中取出未附著的細(xì)胞，以及將所述未附著的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含有效濃度佛波酯的第二培養(yǎng)基中，從而建立展示長(zhǎng)期增殖能力的頂泌細(xì)胞系。7.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的頂泌細(xì)胞系或根據(jù)權(quán)利要求6產(chǎn)生的頂泌細(xì)胞系用于診斷性、治療性或化妝品制劑的用途。8.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的頂泌細(xì)胞系或根據(jù)權(quán)利要求6產(chǎn)生的頂泌細(xì)胞系用于體外估計(jì)在對(duì)皮膚局部施用時(shí)，材料是否是除臭劑的用途。9.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的頂泌細(xì)胞系或根據(jù)權(quán)利要求6產(chǎn)生的頂泌細(xì)胞系用于檢查人頂泌腺的生理學(xué)或病理生理學(xué)的用途。10.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的頂泌細(xì)胞系或根據(jù)權(quán)利要求6產(chǎn)生的頂泌細(xì)胞系用于測(cè)試化合物或試劑抵抗疾病的用途。11.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的頂泌細(xì)胞系或根據(jù)權(quán)利要求6產(chǎn)生的頂泌細(xì)胞系用于制備來(lái)源于所述細(xì)胞的產(chǎn)品的用途。全文摘要頂泌細(xì)胞系。通過(guò)下列步驟獲得頂泌細(xì)胞系從初生組織分離頂泌細(xì)胞，將所分離的細(xì)胞培養(yǎng)在第一培養(yǎng)基中，從所述第一培養(yǎng)基中取出未附著的細(xì)胞，并將所述未附著的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有有效濃度佛波酯的第二培養(yǎng)基中，從而建立展示長(zhǎng)期增殖能力的頂泌細(xì)胞系，其在培養(yǎng)許多代后是無(wú)限增殖的標(biāo)志。文檔編號(hào)C12N5/071GK101743307SQ200880009733公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日發(fā)明者D·F·麥唐納,G·T·E·基利,J·S·伯里,M·哈克,R·L·埃文斯申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司