用于培養(yǎng)豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養(yǎng)液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬體外胚胎培養(yǎng)液。本發(fā)明所提供的豬體外胚胎培養(yǎng)液，是在NCSU-23胚胎培養(yǎng)液中加入終濃度為0.05～5.00μg/mL的川芎嗪后得到的培養(yǎng)液。本發(fā)明所提供的豬體外胚胎培養(yǎng)液中加入了中藥單體成分——川芎嗪，實(shí)驗(yàn)證明，利用該培養(yǎng)液對(duì)豬孤雌激活胚和體外受精胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，可有效提高胚胎發(fā)育效率及囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及其總細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明為其他生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)研究以及畜牧業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為闡明豬早期胚胎發(fā)育機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】用于培養(yǎng)豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養(yǎng)液
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬體外胚胎培養(yǎng)液，特別涉及一種用于培養(yǎng)豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養(yǎng)液。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物胚胎的體外培養(yǎng)是胚胎生物技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)。在體外培養(yǎng)條件下，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發(fā)育全過(guò)程，而停頓在某個(gè)特定發(fā)育時(shí)期，這一現(xiàn)象被稱為胚胎體外發(fā)育阻斷(in vitro block of embryonic development),因而嚴(yán)重影響早期胚胎體外發(fā)育質(zhì)量，如豬體外囊胚發(fā)育率一般僅為20%左右，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量在3個(gè)左右，導(dǎo)致后代的出生率下降，極大地阻礙了豬在農(nóng)業(yè)、生物工程和醫(yī)學(xué)中的研究應(yīng)用。
[0003]動(dòng)物胚胎的體外培養(yǎng)與三方面的因素有關(guān)，即胚胎種類、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液的成分，其中培養(yǎng)液成分的改進(jìn)是體外培養(yǎng)的技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)所在，直接影響到體外培養(yǎng)效果和體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量。
[0004]能量代謝是胚胎在體外發(fā)育過(guò)程中的基本生命活動(dòng)，能量物質(zhì)是胚胎培養(yǎng)液中的重要成分。丙酮酸、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺等作為能源物質(zhì)，其作用機(jī)理，不同動(dòng)物有差異。尤其是葡萄糖對(duì)早期胚胎培養(yǎng)的作用已證實(shí)對(duì)小鼠、倉(cāng)鼠的受精卵有顯著的抑制作用，是胚胎克服發(fā)育阻斷的障礙。豬也有類似的現(xiàn)象，2-細(xì)胞和4-細(xì)胞的豬體外發(fā)育胚胎對(duì)葡萄糖的需求低于桑椹胚和囊胚期的胚胎。
[0005]氨基酸和維生素是胚胎發(fā)育所必需的。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的前提，同時(shí)也參與能量代謝，故大多數(shù)培養(yǎng)液中含有氨基酸。維生素作為碳水化合物和氨基酸代謝過(guò)程中必不可少的成分，能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和乳糖的合成，從而影響胚胎的代謝和發(fā)育。在輸卵管和子宮液中有20~25種哺乳動(dòng)物所需要的必需和非必需氨基酸，其中?；撬?、天門冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸的含量很高。谷氨酰胺可作為小鼠、倉(cāng)鼠、豬胚胎發(fā)育的重要能源物質(zhì)，對(duì)致密化后期的胚胎發(fā)育有利，促進(jìn)胚胎向囊胚發(fā)育和胚泡的形成，并增加滋養(yǎng)層細(xì)胞的數(shù)量和囊胚的孵化能力。
[0006]無(wú)機(jī)鹽離子是培養(yǎng)液中不可缺少的組成部分，它不僅是培養(yǎng)液滲透壓的主要維持者，而且其本身也直接或間接的參與胚胎代謝過(guò)程。哺乳動(dòng)物輸卵管液以高濃度的K+為特征。由于胚胎能在較寬的離子濃度范圍正常培養(yǎng)，因此尋找培養(yǎng)基的最佳離子組成比較繁雜。在眾多無(wú)機(jī)鹽離子中，Mg2+是許多酶，特別是糖酵解和三羧酸循環(huán)中許多酶的輔酶，在能量代謝中可能起到重要作用；Ca2+對(duì)維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、通透性以及細(xì)胞之間的連接有重要的作用，對(duì)桑椹胚的緊縮及囊胚的形成和擴(kuò)展起至關(guān)重要的作用。
[0007] 血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分，它含有許多維持細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。血清的已知成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、生長(zhǎng)因子等。胚胎培養(yǎng)時(shí),一般加入牛血清、羊血清、兔血清等,及牛血清白蛋白(BSA)0血清加入有利于胚胎發(fā)育，但因廠家、批次不同，培養(yǎng)效果相差甚遠(yuǎn)。血清來(lái)源不同效果不同，牛血清有胎牛血清(FCS)(來(lái)源少，價(jià)格高)、新生犢牛血清(NCS)(剛產(chǎn)下未哺乳的小牛)、小牛血清(CS)(哺乳后的小牛，含有更復(fù)雜的成分)、發(fā)情牛血清(OCS)、閹公牛血清(SS)。因此，選擇血清也是培養(yǎng)的關(guān)鍵。
[0008]在胚胎發(fā)育過(guò)程中研究較多的生長(zhǎng)因子主要為胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1、IGF-1I)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。IGF-1, IGF-1I及其受體基因在早期胚胎中均有表達(dá)，IGF-1在輸卵管及子宮分泌物中存在，IGF-1可以通過(guò)改變凋亡相關(guān)基因減輕豬孤雌胚體外發(fā)育中早期胚胎凋亡的發(fā)生。NCSU-23培養(yǎng)液中有或無(wú)BSA時(shí)添加10或100ng/ml IGF-1并沒有明顯改善孤雌胚的發(fā)育率；然而，在有BSA存在時(shí)，IGF-1卻增加了囊胚細(xì)胞數(shù)。EGF是血清和卵泡液中都存在的生長(zhǎng)因子，無(wú)血清培養(yǎng)液中加入EGF能促進(jìn)牛胚胎的發(fā)育，增加蛋白質(zhì)的合成和囊胚的孵化率，但不增加囊胚中的細(xì)胞數(shù)量，有的研究則認(rèn)為EGF的作用僅表現(xiàn)在促進(jìn)孵化，也有研究發(fā)現(xiàn)EGF也能增加囊胚細(xì)胞數(shù)量。豬克隆胚胎和體外受精胚在成熟的卵母細(xì)胞、桑椹胚和囊胚均有EGF mRNA的表達(dá)。而且，EGF的表達(dá)量在2-細(xì)胞后有減少的趨勢(shì)，因此可以推測(cè)2-細(xì)胞后添加EGF有可能促進(jìn)胚胎發(fā)育；同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGFR僅在2-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚階段表達(dá)，而在4-8細(xì)胞內(nèi)未見表達(dá)。可推測(cè)，在胚胎不同發(fā)育階段，EGF通過(guò)與其受體的相互作用而對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生直接或間接的影響
[0009]除上述的常規(guī)添加成分外，一些學(xué)者也曾嘗試過(guò)在豬培養(yǎng)液中添加一些其他成分，以提高胚胎卵裂率和囊胚率等。如培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的EDTA-Na2、20g/L馬尾藻類多糖、亞硒酸鈉等。
[0010]綜上所述，隨著研究者們對(duì)胚胎早期發(fā)育的環(huán)境需求及自身代謝特性認(rèn)識(shí)的不斷深入，體外胚胎的的發(fā)育率和質(zhì)量有了相應(yīng)的提高，但仍無(wú)法從根本上解決培養(yǎng)系統(tǒng)存在的缺陷，囊胚發(fā)育率及其細(xì)胞數(shù)量較少等問(wèn)題未能得到很好的改善。
[0011]近年來(lái)，中草藥以其低毒副作用、無(wú)抗藥性、相對(duì)安全、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料、化妝、食物等領(lǐng)域，其新的作用和機(jī)理也不斷的被發(fā)現(xiàn)。多方面的研究，顯示出其具有從整體上、多靶點(diǎn)、全方位改善機(jī)體生理狀況的藥理特點(diǎn)。而早期胚胎的發(fā)育和細(xì)胞的增殖與其適宜的微環(huán)境密切相關(guān)，因此，根據(jù)胚胎不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)需要和代謝特點(diǎn)，建立適宜早期胚胎體外生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)體系，以尋找新的途徑和方法改善早期胚胎體外培養(yǎng)的微環(huán)境，從而提高體外胚胎發(fā)育質(zhì)量顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種豬體外胚胎培養(yǎng)液。
[0013]本發(fā)明所提供的豬體外胚胎培養(yǎng)液，具體為在NCSU-23胚胎培養(yǎng)液中加入終濃度為 0.05 ~5.00 μ g/mL (如 0.05 ~0.50 μ g/mL 或 0.50 ~5.00 μ g/mL,具體如 0.05 μ g/mL、0.50 μ g/mL或5.00 μ g/mL)的川芎嗪后得到的培養(yǎng)液。
[0014]所述NCSU-23胚胎培養(yǎng)液，具體為將NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、?；撬?、亞?；撬帷-半胱氨酸、青霉素、硫酸鏈霉素，以及牛血清白蛋白按照IL:1.1g:0.146g:0.876g:0.546g:0.069g:100000IU:70000IU:4g 的配比混合而成，pH7.2。
[0015]在本發(fā)明中，所述NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度具體如下=NaCl
6.354g/L、KCl 0.356g/L、K2HPO4 0.162g/L、CaCl2.2H20 0.250g/L、MgSO4.7H20 0.293g/L、NaHCO3 2.106g/L、青霉素 108333IU/L、硫酸鏈霉素 50000IU/L，pH7.2。
[0016]本發(fā)明是再一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)豬體外胚胎的方法。[0017]本發(fā)明所提供的培養(yǎng)豬體外胚胎的方法，是將豬體外胚胎置于如上所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018]在本發(fā)明中，所述豬體外胚胎具體可為豬孤雌激活胚，也可為豬體外受精胚胎。
[0019]無(wú)論是對(duì)于以上所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液，還是對(duì)于以上所述的培養(yǎng)豬體外胚胎的方法:當(dāng)所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚時(shí)，所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中所述川芎嗪的終濃度以0.05~0.50 μ g/mL (如0.05 μ g/mL)效果較好；當(dāng)所述豬體外胚胎為豬體外受精胚胎時(shí)，所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中所述川芎嗪的終濃度以5.00 μ g/mL效果較好。
[0020]在培養(yǎng)所述豬體外胚胎的方法中，將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)具體為:每個(gè)50 μ L的所述豬體外胚胎培養(yǎng)液的液滴中培養(yǎng)15~20枚所述豬體外胚胎，同時(shí)覆蓋礦物油。 [0021]進(jìn)一步，其培養(yǎng)的條件為:39°C，5%C02，95%空氣，100%飽和濕度。在培養(yǎng)所述豬體外胚胎時(shí)可在符合上述條件的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
[0022]將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)的過(guò)程中，需間隔48h換液一次。
[0023]本發(fā)明所提供的豬體外胚胎培養(yǎng)液中加入了中藥單體成分——川芎嗪(Ligustrazine, Lig),實(shí)驗(yàn)證明，利用該培養(yǎng)液對(duì)豬孤雌激活胚和體外受精胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，可有效提高胚胎發(fā)育效率及囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及其總細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明為其他生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)研究以及畜牧業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為闡明豬早期胚胎發(fā)育機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為對(duì)照組和Ligl組的豬孤雌激活胚在胚胎培養(yǎng)至168h (第7天)的囊胚細(xì)胞數(shù)和囊胚細(xì)胞凋亡情況鑒定結(jié)果。其中，A、A’和A”為對(duì)照組；B、B’和B”為L(zhǎng)igl組；A和B為各組別囊胚(自然光)；A’和B’表示相應(yīng)各組別總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色)；A”和B”表示各組別胚胎細(xì)胞凋亡征象(紅色)。
[0025]圖2為對(duì)照組和Lig3組的豬體外受精胚胎在胚胎培養(yǎng)至168h (第7天)的囊胚細(xì)胞數(shù)和囊胚細(xì)胞凋亡情況鑒定結(jié)果。其中，A、A’和A”為對(duì)照組；B、B’和B”為L(zhǎng)ig3組；A和B為各組別囊胚(自然光)；A’和B’表示相應(yīng)各組別總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色)；A”和B”表示各組別胚胎細(xì)胞凋亡征象(紅色)(X400)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0027]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]川芎嗪:中國(guó)藥品生物制品檢定所，編號(hào):110811-200305。
[0029]NCSU-23 基礎(chǔ)培養(yǎng)液:準(zhǔn)確稱取 NaCl (Sigma, S5886)0.6354g、KCl (Sigma,P5405)0.0356g,K2HPO4 (Sigma, P5655) 0.0162g,CaCl2.2Η20 (Sigma, C7902) 0.0250g、MgS04.7Η20(Sigma,M2773) 0.0293g,NaHCO3 (Sigma, S5761) 0.2106g、青霉素(Sigma，P3032) 10833IU、硫酸鏈霉素(Sigma，S1277) 5000IU，用超純水溶解并定容至lOOmL，待前一種藥物完全溶解后再加入后一種藥物，充分混勻，pH7.2。[0030]NCSU-23胚胎培養(yǎng)液:在IOOmL NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液中依次加入D-葡萄糖(Sigma, G6152) 0.1lOOg, L-谷氨酰胺(Sigma，G3126) 0.0146g,?；撬?Sigma，T8691)0.0876g、亞?；撬?Sigma，Hl384) (λ 0546g、L-半胱氨酸(Sigma，C7352) 0.0069g、青霉素10000IU、硫酸鏈霉素7000IU、牛血清白蛋白(BSA，Sigma, A3311) 0.4g，待前一種藥物完全溶解后再加入后一種藥物，充分混勻，PH7.2。
[0031]實(shí)施例1、川芎嗪對(duì)豬孤雌激活胚體外發(fā)育的影響
[0032]一、含有川芎嗪的豬體外胚胎培養(yǎng)液的配制
[0033]取三份NCSU-23胚胎培養(yǎng)液，分別添加川芎嗪(Lig)，使其終濃度分別達(dá)0.05 μ g/mL、0.5 μ g/mL 和 5 μ g/mL。
[0034]二、豬孤雌激活胚的獲得
[0035]1.卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)
[0036]將屠宰場(chǎng)收集的豬卵巢保存在添加雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)的34~37°C生理鹽水中并于Ih內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。卵巢經(jīng)上述生理鹽水沖洗三次后，除盡周圍的脂肪和系膜，用12號(hào)針頭抽取卵巢表面上直徑為2~6mm卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體視顯微鏡下選擇卵丘細(xì)胞2層以上、胞質(zhì)均勻的COCs用TL-1fepes-PVA和在CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上的體外成熟培養(yǎng)液分別洗漆3次后進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)用Φ=35ι?πι培養(yǎng)皿(Nunc)。每滴50 μ L的培養(yǎng)液中放入15~20個(gè)COCs，覆蓋礦物油。培養(yǎng)條件為39°C，5%的C02，95%空氣，100%飽和濕度。
[0037]其中，TL-Hepe s-PVA和體外成熟培養(yǎng)液的配方如下:
[0038]TL-H印es-PVA 洗卵液:NaCl 3.3311g、KCl 0.1193g、CaCl2.2Η200.1471g、MgCl2.6Η20 (Sigma,Μ2393) 0.0509g,NaH2PO4 (Sigma, S5011) 0.0204g,NaHCO3 0.0840g、山梨醇 1.0930g、H印es (Sigma,H4034) 1.1916g、PVA (Sigma,P8136)0.5g、丙酮酸鈉 0.01lOg以及乳酸鈉(Sigma，16H50495) 0.4245mL,分別用500mL超純水溶解并定容，然后將后者緩緩加入前者中，并不斷的搖動(dòng)，充分混勻后，加入青霉素54167IU、硫酸鏈霉素25000IU、抽濾除菌，分裝。使用前37°C恒溫箱中保溫4h。
[0039]體外成熟培養(yǎng)液:mTCM199(GIBC0BRL，1069982)中添加0.57mmol/L L-半胱氨酸、3.0SmmoI/T, D-葡萄糖、0.91mmol/L 丙酮酸鈉、10ng/mL EGF (Sigma,Ε9644)、0.l%(w/v)PVA和10%(v/v)卵泡液(PFF)、125000IU/L青霉素、50000IU/L硫酸鏈霉素。培養(yǎng)前22h添加LH(Sigma, L9773) 0.5 μ g/mL,FSH (Sigma,F2293) 0.5μ g/mL，培養(yǎng)后 22h 不添加 FSH、LH。以上各濃度為相應(yīng)組分在體外成熟培養(yǎng)液中的終濃度。
[0040]2.去除顆粒細(xì)胞
[0041]體外成熟培養(yǎng)44h后，將COCs移入含有0.1% (質(zhì)量百分含量)透明質(zhì)酸酶的的NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液中用移液槍頭反復(fù)吹打，待完全脫去卵丘細(xì)胞后，挑選明顯具有第一極體的卵母細(xì)胞移入NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，洗滌3次。置于37°C的恒溫臺(tái)上備用。
[0042]3.成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活
[0043]將上述成熟卵母細(xì)胞移入含20 μ mol/L 1011(離子霉素)(5丨8111&，10634)的從^化23基礎(chǔ)培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)40min后，用NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌3次，移入含2mmol/L6-DMAP(6- 二甲基嘌呤，Sigma, D2629)的NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)5.5h，隨后用NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗3次。獲得豬孤雌激活胚。[0044]三、含有不同劑量川芎嗪的豬體外胚胎培養(yǎng)液對(duì)豬孤雌激活胚體外發(fā)育的影響
[0045]以未添加川芎嗪(Lig)的NCSU-23胚胎培養(yǎng)液為對(duì)照組，以步驟一制備的含有不同劑量川芎嗪(Lig)的豬體外胚胎培養(yǎng)液為試驗(yàn)組，分別觀察低、中、高(Ligl、Lig2、Lig3)不同劑量的川芎嗪對(duì)豬孤雌激活胚體外發(fā)育的影響。
[0046]1.胚胎體外培養(yǎng)
[0047]將步驟二獲得的豬孤雌激活胚移入50 μ L胚胎培養(yǎng)液的液滴中培養(yǎng)(對(duì)照組:NCSU-23胚胎培養(yǎng)液；試驗(yàn)組:含有不同劑量川芎嗪(Lig)的豬體外胚胎培養(yǎng)液)，每滴15~20枚胚胎，覆蓋礦物油。培養(yǎng)條件為:39°C，5%C02，95%空氣，100%飽和濕度。間隔48h換液一次。
[0048]2.卵裂率和囊胚率的計(jì)算
[0049]在胚胎培養(yǎng)至48h時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的卵裂胚胎數(shù)，進(jìn)而計(jì)算卵裂率；在胚胎培養(yǎng)至168h (第7天)時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的囊胚數(shù)，進(jìn)而計(jì)算囊胚率。
[0050]3.囊胚細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)、囊胚細(xì)胞凋亡情況鑒定及凋亡指數(shù)計(jì)算
[0051]在胚胎培養(yǎng)至168h (第7天)時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的囊胚細(xì)胞總數(shù)，以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)，并對(duì)囊胚細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行鑒定，計(jì)算凋亡指數(shù)。[0052]( I)囊胚細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)
[0053]將囊胚(第7天)放入含有0.5%(w/v)鏈霉蛋白酶的TL-Hepes-PVA液除去透明帶，在含有0.4% (0.4g/100mL)BSA的TL-1fepes-PVA液中清洗5min，在39°C不含CO2的培養(yǎng)箱中孵育40min (50 μ L TL-Hepes-PVA小滴中添加5.5 μ L兔抗豬全血清(Sigma, P3164)并覆蓋石蠟油)，然后用含有10%(v/v)胎牛血清的TL-1fepes-PVA液結(jié)束抗體反應(yīng)5min。在無(wú)石蠟油的TL-1fepes-PVA液中清洗5min，并重復(fù)3次，然后在39°C不含CO2的培養(yǎng)箱中孵育90min (50 μ L TL-H印es-PVA液小滴中添加3.5 μ L豚鼠血清(Sigma, S16390)并覆蓋石蠟油)，在豚鼠補(bǔ)體(Sigma, S16390)中孵育的同時(shí)用10 μ L的Hoechst33342( Sigma, B2261)和10μ L 的 PI (Sigma，P4170)染色，之后在含有含有 0.4% (0.4g/100mL)BSA 的 TL-1fepes-PVA液中清洗5min，將囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上，盡量少帶液體，用凡士林在載玻片四角點(diǎn)四個(gè)柱，蓋上蓋玻片，再輕輕壓蓋玻片，最后用指甲油封片。在熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)、滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)。
[0054](2)孤雌發(fā)育胚細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià)
[0055]孤雌激活第7天的囊胚在TL-1fepes-PVA液中清洗三次，隨后在4%多聚甲醛(Solarbio, P1040)中固定Ih (室溫)，隨后在TL-H印es_PVA液中清洗三次，在添加有0.l%(v/v) TritonX-1OO的2.3% (2.3g/100mL)檸檬酸鈉水溶液中孵育Ih (室溫)。DNA碎片(DNA fragmentation)檢測(cè)應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death DetectionKit, Roche, Germany)。即采用TUNEL檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的程度，被固定的胚胎在TUNEL反應(yīng)混合液中孵育Ih (暗室，38.5°C)并清洗干凈后放入10μ g/mL PI中室溫避光染色5min，滴加抗淬滅劑DABCO后封片，用錫箔紙覆蓋好，準(zhǔn)備觀察，使用熒光顯微鏡檢測(cè)整個(gè)胚胎的凋亡的細(xì)胞核和總細(xì)胞核。
[0056]凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)
[0057]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0058]四、結(jié)果[0059]1.卵裂率和囊胚率的計(jì)算
[0060]對(duì)照組和試驗(yàn)組的卵裂率和囊胚率計(jì)算結(jié)果如表1所示。
[0061]表1川芎嗪對(duì)豬孤雌激活胚體外發(fā)育效果的影響
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種豬體外胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述豬體外胚胎培養(yǎng)液是在NCSU-23胚胎培養(yǎng)液中加入終濃度為0.05~5.00 μ g/mL的川芎嗪后得到的培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述NCSU-23胚胎培養(yǎng)液為將NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、?；撬帷喤；撬帷-半胱氨酸、青霉素、硫酸鏈霉素，以及牛血清白蛋白按照IL:1.1g:0.146g:0.876g:0.546g:0.069g:100000IU:70000IU:4g的配比混合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液，其特征在于:所述NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下=NaCl 6.354g/L、KCl 0.356g/L、K2HPO4 0.162g/L、CaCl2.2H20 0.250g/L、MgSO4.7H20 0.293g/L、NaHCO3 2.106g/L、青霉素 108333IU/L、硫酸鏈霉素 50000IU/L。
4.一種培養(yǎng)豬體外胚胎的方法，是將豬體外胚胎置于權(quán)利要求1-3中任一所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液，或權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚或豬體外受精胚胎。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的豬體外胚胎培養(yǎng)液或方法，其特征在于:當(dāng)所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚時(shí)，所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中所述川芎嗪的終濃度為0.05~0.50 μ g/mL ;當(dāng)所述豬體外胚胎為豬體外受精胚胎時(shí)，所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中所述川芎嗪的終濃度為5.00 μ g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)為:每 個(gè)50 μ L的所述豬體外胚胎培養(yǎng)液的液滴中培養(yǎng)15~20枚所述豬體外胚胎。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)的條件為:39°C，5%C02,100%飽和濕度。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，間隔48h換液一次。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103710299SQ201310700566
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】高建明, 史雅然, 趙菊, 李冬冬, 張志剛, 徐捷, 張超 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院