應(yīng)用于斑馬魚胚胎的易接近轉(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)高通量測序?qū)嶒?yàn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其適用于斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。
【背景技術(shù)】
[0002]越來越多的證據(jù)顯示，許多遺傳學(xué)差異并非影響基因，而是改變控制基因開/關(guān)的調(diào)控序列?；罨恼{(diào)控序列上結(jié)合有轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子是識別特定DNA序列的蛋白。一旦轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就會招募其他蛋白，使附近的基因開始轉(zhuǎn)錄。在指定細(xì)胞中鑒定所有活躍的調(diào)控序列，對于理解基因組的作用機(jī)制非常重要。易接近轉(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)高通量測序?qū)嶒?yàn)(Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq)，通過Tn5轉(zhuǎn)座酶，優(yōu)先標(biāo)記和測序核小體之間的DNA，獲取全基因組上轉(zhuǎn)錄因子和核小體定位信息，其提供的信息與DNase-seq法差不多，但步驟更為簡單，需要的細(xì)胞也更少。在無法獲得大量細(xì)胞的情況下，ATAC-seq更有幫助。例如，在胚胎發(fā)育早期細(xì)胞量少，收集大量細(xì)胞難度大，成本高，用ATAC-seq檢測早期胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)的開放變化及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，為研究基因表達(dá)調(diào)控提供依據(jù)。也可以在癌癥組織或ips生成的細(xì)胞中，用ATAC-seq檢測調(diào)控序列，此外，ATAC-seq也有望成為有用的診斷工具。
[0003]斑馬魚由于養(yǎng)殖方便，繁殖周期短，產(chǎn)卵量大，胚胎體外受精，體外發(fā)育，胚胎透明，研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚共享了人類70%的蛋白編碼基因，而且人類相關(guān)基因中有84%可以在斑馬魚中找到對應(yīng)基因，已成為生命科學(xué)研究的新寵。利用斑馬魚可以研究生命科學(xué)的基礎(chǔ)問題，揭示斑馬和組織器官發(fā)育的分子機(jī)理;可以構(gòu)建人類的各種疾病和腫瘤模型，建立藥物篩選和治療的研究平臺等。
[0004]目前ATAC-seq技術(shù)只是用于細(xì)胞樣本中，還未有報(bào)道在斑馬魚的胚胎細(xì)胞中應(yīng)用。本方法針對斑馬魚胚胎進(jìn)行了改良，以利于對胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及與基因表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究，為揭開人類發(fā)育的神秘面紗提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是為了研究斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的染色質(zhì)開放的變化及與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系所建立的一種應(yīng)用于斑馬魚胚胎的易接近轉(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)高通量測序?qū)嶒?yàn)(ATAC-seq)的方法。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]—種應(yīng)用于斑馬魚胚胎的易接近轉(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)高通量測序?qū)嶒?yàn)(ATAC-seq)的方法，該方法包括以下步驟:
[0008](1)斑馬魚胚胎樣本的準(zhǔn)備:
[0009]取斑馬魚胚胎于離心管中，加預(yù)冷的PBS洗滌劑洗滌3次；
[0010](2)斑馬魚胚胎細(xì)胞核獲取:
[0011]加入預(yù)冷的裂解緩沖液200ul(10mMTris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，3mM MgC12，
0.1% IGEPAL CA-630)，用200ul廣口的移液器槍頭冰上反復(fù)吹打，直至胚胎完全裂解，4度，轉(zhuǎn)速500g，10min離心收集細(xì)胞核。
[0012](3)轉(zhuǎn)座反應(yīng)和純化:
[0013]立即加Tn5轉(zhuǎn)座酶及TD轉(zhuǎn)座緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，輕輕渦旋后短暫離心，37度水浴反應(yīng)30min。轉(zhuǎn)座反應(yīng)具體包含:25ul 2*TD Buffer，2.5ul Tn5轉(zhuǎn)座酶，22.5ul無核酶水(Illumina Cat#FC-121-1030)。轉(zhuǎn)座結(jié)束后用QiagenMinEluteKit 進(jìn)行純化，10ul洗脫液洗脫，純化后的DNA可于-20度保存；
[0014](4)PCR 擴(kuò)增:
[0015]第一次PCR反應(yīng)，步驟(3)所得純化10ul轉(zhuǎn)座純化后DNA，加9.7ul無核酶水，2.5ul25uMCustomized Nextera PCR Primerl，2.5ul 25uMCustomized Nextera PCR Primer2(Barcode),0.3ul 100*SYBR Green I，25ul NEBNext High-Fidelity 2*PCR Master Mix。具體反應(yīng)條件為72°C5min，98°C30sec，98°C10sec，63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps 3-5，4cycles，保持在4°C ；第二次PCR反應(yīng)體系包括:5ul第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物，4.44ul無核酶7jC，0.25ul 25uMCustomized Nextera PCR Primerl，0.25ul 25uMCustomized NexteraPCR Primer2(Barcode),0.06ul 100*SYBR Green I，5ul NEBNext High-Fidelity 2*PCRMaster Mix。具體反應(yīng)條件為98°C30sec，98°C10sec，63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps2-4，19cy c 1 es，保持在4°C。剩下的45u 1反應(yīng)液于冰上放置備用；
[0016](5)文庫構(gòu)建及純化:
[0017]根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果來確定文庫構(gòu)建所有反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量曲線圖線性化設(shè)置(Rn/Cycle)，RF閾值設(shè)為5000，循環(huán)數(shù)的計(jì)算為1/4最大熒光值所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為該樣本建庫所需要的循環(huán)數(shù)。根據(jù)計(jì)算結(jié)果將步驟(4)剩下的45ul樣品放入PCR儀中反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為98°C30sec，98°C10sec,63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps 2-4,xcycles，保持在4°C。所得文庫用AMPure beads純化后，通過b1analyzer進(jìn)行文庫質(zhì)量檢測，HiSeq2500的125PE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。
[0018]ATAC-seq和DNase-seq兩種方法都能夠?qū)蚪M染色質(zhì)上調(diào)控序列進(jìn)行定位和解讀，但ATAC-seq步驟更為簡單，需要的細(xì)胞也更少，在無法獲得大量細(xì)胞的情況下，ATAC_seq更有幫助，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ATAC-seq獲得的數(shù)據(jù)富集程度更高。本發(fā)明還將其應(yīng)用到斑馬魚胚胎細(xì)胞中，對于研究生物體早期發(fā)育過程中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及相應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控研究提供一種有效且簡單的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明方法，首先進(jìn)行斑馬魚胚胎樣本前處理，然后在胚胎中加入裂解緩沖液，用廣口槍頭在冰浴中裂解胚胎，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)并純化DNA，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量的方法確定建庫用的循環(huán)數(shù)，直接通過一步PCR的方法進(jìn)行建庫測序。
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0021 ]實(shí)施例
[0022]收取成功受精的斑馬魚早期胚胎樣品。具體方法如下:
[0023](1)斑馬魚胚胎樣本的準(zhǔn)備:
[0024]取64細(xì)胞期，256細(xì)胞期，lk細(xì)胞期，Oblong細(xì)胞期，Dome/30%epiboly細(xì)胞期斑馬魚胚胎于離心管中，加預(yù)冷的PBS洗滌劑洗滌3次；
[0025](2)斑馬魚胚胎細(xì)胞核獲取:
[0026]加入預(yù)冷的裂解緩沖液200ul(10mMTris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，3mM MgC12，
0.1% IGEPAL CA-630)，用200ul廣口的移液器槍頭冰上反復(fù)吹打，直至胚胎完全裂解，4度，轉(zhuǎn)速500g，10min離心收集細(xì)胞核。
[0027](3)轉(zhuǎn)座反應(yīng)和純化:
[0028]立即加Tn5轉(zhuǎn)座酶及TD轉(zhuǎn)座緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，輕輕渦旋后短暫離心，37度水浴反應(yīng)30min。轉(zhuǎn)座反應(yīng)具體包含:25ul 2*TD Buffer，2.5ul Tn5轉(zhuǎn)座酶，22.5ul無核酶水(Illumina Cat#FC-121_1030)。轉(zhuǎn)座結(jié)束后用QiagenMinElute Kit進(jìn)行純化，10ul洗脫液洗脫，純化后的DNA可于-20度保