斑馬魚測定農(nóng)藥水分散粒劑毒性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及養(yǎng)殖技術領域，尤其涉及一種斑馬魚測定農(nóng)藥水分散粒劑毒性的方 法。
【背景技術】
[0002] 斑馬魚(Brachydonio rerio)屬于脊索動物門福鰭魚綱鯉形目鯉科短丹尼魚屬， 具有易飼養(yǎng)、產(chǎn)卵量大、性成熟周期短、個體小易操作等特點，同時斑馬魚基因與人類基因 的相似度高，具有重要的科學研究意義。因此，斑馬魚已成為科學研究中常用的模式生物， 廣泛應用于生命科學、毒理學、環(huán)境科學和農(nóng)業(yè)科學等領域。斑馬魚胚胎和幼魚常被用于新 化學物質(zhì)登記中的急性、亞慢性、慢性毒性試驗研究，而斑馬魚成魚通常被用于農(nóng)藥登記急 性毒性試驗研究。
[0003] 目前，已經(jīng)廣泛采用斑馬魚進行農(nóng)藥環(huán)境安全性評價的研究，但是采用斑馬魚作 為農(nóng)藥水分散粒劑毒性篩選模型的研究較少，缺乏相關的研究數(shù)據(jù)評估模型的實用性和可 靠性。因此，提供一種易操作、實用性強的斑馬魚篩選農(nóng)藥水分散粒劑毒性的方法尤其重 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種斑馬魚測定農(nóng)藥水分 散粒劑毒性的方法，具有操作簡便、實用性強、檢測速度快，精確度高等優(yōu)勢。
[0005] 為解決上述技術問題，提供了一種斑馬魚測定農(nóng)藥水分散粒劑毒性的方法，包括 以下步驟：
[0006] (1)將農(nóng)藥水分散粒劑溶解，制成農(nóng)藥儲備液；
[0007] (2)將所述農(nóng)藥儲備液與水混合配制成梯度濃度的混合液，將所述混合液做為斑 馬魚的生活用水，持續(xù)培養(yǎng)96h，培養(yǎng)過程中，每隔24h時記錄斑馬魚的生物效應參數(shù)和所述 混合液的理化參數(shù)；
[0008] (3)根據(jù)斑馬魚的生物效應參數(shù)計算農(nóng)藥對斑馬魚的半數(shù)致死濃度LC5Q值，判斷農(nóng) 藥水分散粒劑的毒性。
[0009]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(1)具體為:將所述農(nóng)藥分散粒劑加入水中，進行攪 拌或超生得到所述農(nóng)藥儲備液。
[0010] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述斑馬魚選擇體長為1~3cm、健康活潑的 斑馬魚。
[0011] 上述的方法，優(yōu)選的，在采用斑馬魚測定農(nóng)藥水分散粒劑毒性之前24h內(nèi)，所述斑 馬魚不喂食，在所述步驟(2)進行的過程中，所述斑馬魚不喂食。
[0012] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述水為曝氣水，所述曝氣水的硬度為10~ 240mg/L，pH為6.0~8.5，溶解氧含量高于空氣飽和值的80%。
[0013] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述生物效應參數(shù)為魚的死亡率和中毒癥 狀;所述理化參數(shù)為混合液的水溫、pH值、溶解氧含量。
[0014] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)過程控制水溫為21~25°C、每日光 照12~16h、溶解氧含量高于空氣飽和值的60 %。
[0015] 上述的方法，優(yōu)選的，所述農(nóng)藥水分散粒劑的毒性的判斷標準為：LC5q> 10.0 mg a.i./L表不低毒，l.OOmg a.i./L<LC5〇<10.0mg a.i./L表不中毒，O.lOOmg a.i./L<LC5〇 <1.00mg a.i./L表不尚毒，LC5〇<0.100mg a.i./L表不劇毒。
[0016] 上述的方法，優(yōu)選的，所述一種斑馬魚測定農(nóng)藥水分散劑毒性的方法還設有空白 對照組;所述空白對照組以曝氣水為斑馬魚的生活用水。所述空白對照組中斑馬魚的死亡 率為0則證明實驗結果可信。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0018] (1)本發(fā)明提供了一種操作簡便、實用性強的模式生物斑馬魚篩選農(nóng)藥水分散粒 劑毒性的方法，將農(nóng)藥水分散粒劑有效成分充分溶解出來，評價其對斑馬魚的毒性，具有速 度快，精確度高的優(yōu)點。
[0019] (2)本發(fā)明提供了一種模式生物斑馬魚篩選農(nóng)藥水分散粒劑毒性的方法，將斑馬 魚幼魚暴露在農(nóng)藥溶液中，通過觀察比較斑馬魚的中毒癥狀和死亡率，判斷農(nóng)藥的毒性。死 亡率最終是通過LC 5Q表征的，而中毒癥狀可以作為輔助判斷措施，準確性更高。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的 保護范圍。
[0021] 實施例
[0022] 以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。以下實施例中采用的曝氣水為采用 空氣曝氣栗曝氣處理24h以上的自來水。
[0023] 實施例1:
[0024] (1)農(nóng)藥儲備液的配制：
[0025]稱取50%啶酰菌胺水分散粒劑1.250(^，用蒸餾水溶解并定容至251^容量瓶中，得 到濃度為2.50 X 104mg a. i . /L的儲備液。
[0026] (2)生活用水的配制：
[0027] 取7個10L的方形玻璃缸，每缸注入5L的曝氣水。該曝氣水的水溫為23.7°C，pH值為 7.62，水質(zhì)硬度為16.2mg/L(以CaC03計），溶解氧為空氣飽和值的99.6%。
[0028] 實驗組:分別向5個裝有曝氣水的方形玻璃缸中注入3. OOOrnL、3.600mL、4.320mL、 5 · 18mL、6 · 22mL步驟（1)中的農(nóng)藥儲備液得到濃度分別為15 · Omg a · i · /L、18 · Omg a · i · /L、 21.6mg a.i./L、25.9mg a.i./L、31.1mg a.i./L的斑馬魚生活用水。
[0029] 空白對照組(CK):以曝氣水作為斑馬魚的生活用水。
[0030] (3)染毒
[0031] 挑選體長為1~3cm(平均體長2.13±0.25cm)的野生型AB品系斑馬魚幼魚，隨機放 入到方形玻璃缸中，每個缸中加入10尾魚進行培養(yǎng)，每日光照12h。斑馬魚在染毒前24h不喂 食，染毒過程中亦不喂食。
[0032] 在染毒開始后，于第24h、48h、72h和96h測定并記錄玻璃缸中試驗液的溫度、pH值、 溶氧量等，具體檢測結果見表2。
[0033] 于染毒后611、2411、4811、7211和9611觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀和死亡數(shù)。發(fā)現(xiàn)魚 死亡時即刻將死魚撈出。判斷斑馬魚死亡的標準為魚沒有可見的運動，如鰓煽動、觸碰尾部 無反應。判斷斑馬魚中毒的標準為:斑馬魚出現(xiàn)了側游、側臥缸底或身體明顯彎曲等生物現(xiàn) 象。
[0034]表1為50 %啶酰菌胺水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗數(shù)據(jù)中死亡率的統(tǒng)計結 果。表2為試驗期間各濃度組的水溫，pH值，溶解氧的檢測結果。
[0035]表1:50 %啶酰菌胺水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗數(shù)據(jù)記錄表
[0036]
[0037]同時，表1中，實驗組1~5，培養(yǎng)6~96h，斑馬魚出現(xiàn)了側游、側臥缸底、身體明顯彎 曲、死亡等生物效應。
[0038]表2:水缸中生活用水的水溫、pH值、溶解氧的檢測結果表
[0039]
[0040] (4)數(shù)據(jù)處理
[00411采用統(tǒng)計軟件SPSS12.0，以處理濃度的對數(shù)值為自變量X，以（校正)死亡率的機率 值為因變量y，建立毒力回歸方程。計算50%啶酰菌胺水分散粒劑對斑馬魚的半數(shù)致死濃度 LC50和95 %置信限，具體計算結果參見表3。
[0042]表3:50 %啶酰菌胺水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗結果表
[0043]
[C
[0045] (5)結果評價
[0046] 根據(jù)LC5Q值判斷農(nóng)藥毒級。毒性分級標準為：低毒(LC5Q> 10 . Omg a. i . /L)，中毒 (l.OOmg a.i./L<