一種番茄Mi-1基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄M1-ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番茄是一種重要的蔬菜作物，為蔬菜經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)民增收做出了巨大的貢獻(xiàn)。然而在番茄馴化的過程中，很多的抗性基因都沒有被轉(zhuǎn)入栽培番茄中，大量的抗病基因仍然分布在野生番茄中。選育抗多種病害的番茄品種成為了保障番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要目標(biāo)。
[0003]番茄根結(jié)線蟲病是一種土傳性的病害，由于設(shè)施面積的逐年擴(kuò)大，連作重茬問題難以解決，加上根結(jié)線蟲寄主范圍廣泛的特點(diǎn)，使得該病對(duì)番茄生產(chǎn)的危害逐漸增大。通過胚挽救的方法，將秘魯番茄中的根結(jié)線蟲抗性基因M1-Ι導(dǎo)入到栽培番茄中，極大的改善了番茄對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。通過基因定位，番茄6號(hào)染色體短臂端，CAPS標(biāo)記REX-1與該基因連鎖。
[0004]番前黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)病是近年來傳入我國并大面積爆發(fā)的一種番茄病害，發(fā)生之初對(duì)番茄生產(chǎn)造成了巨大的危害，該病毒主要通過攜帶TYLCV的煙粉虱進(jìn)行傳播。發(fā)生之初，我國的番茄品種中均無抗原，之后通過對(duì)國外抗原材料的引進(jìn)、篩選和鑒定，選育獲得了適合我國栽培環(huán)境的抗TYLCV品種。目前栽培品種中的抗原基因主要為Ty-l、Ty-2和Ty-3，但是長期使用這些基因存在抗性被變異病毒突破的風(fēng)險(xiǎn)。ty-5基因是目前新發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV基因，該基因與SLNACI具有連鎖關(guān)系。
[0005]目前選育同時(shí)含有抗根結(jié)線蟲和TYLCV的番茄品種對(duì)于番茄生產(chǎn)具有重要的意義。在選育的過程中利用分子標(biāo)記輔助選擇的手段可以加速育種的進(jìn)程。但對(duì)于不同的基因分別進(jìn)行鑒定，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，成本也很高。在多抗基因聚合育種的過程中，如果可以將根結(jié)線蟲和TYLCV抗性基因的分子鑒定整合成多重PCR體系，可以極大的提高育種的效率，降低檢測過程的成本。但在對(duì)現(xiàn)有兩個(gè)基因的標(biāo)記進(jìn)行分析，多態(tài)性片段由于存在條帶間大小相近，多態(tài)性重疊，不利于設(shè)計(jì)多重PCR體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，用于快速鑒定番茄材料中是否含有根結(jié)線蟲抗病基因M1-Ι和番茄黃化曲葉病抗性基因ty-5。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0008]—種番前M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括以下步驟:
[0009]1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA;
[0010]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用M1-ι和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
[0011]3)PCR產(chǎn)物酶切及電泳檢測；
[0012]4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有M1-1基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。
[0013]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。
[0014]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，
[0015]ty-5 引物為:
[0016]NAC1-new F:TTGGATCTGTTCCGCCATG
[0017]NAC1-new R:TTCCTGCTGCTCGGTTCG；
[0018]M1-1 引物為:
[0019]REX-1-new F TCGGAGCCTTGGTCTGAATT
[0020]REX-1-new R GCCAGAGATGATTCGTGAGA。
[0021 ]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為:
[0022]lOng/μΙ模板DNA 2yL,
[0023]4pmmol/L NAC1-newR/F各0.8yL，
[0024]4pmmol/L REX-1R/F各0.5yL，
[0025]mix 酶 10yL，
[0026]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0027]多重PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min;每個(gè)循環(huán)94°C變性45sec，54°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0028]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)中，PCR產(chǎn)物酶切過程是在上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Taq I酶和Buffer進(jìn)行酶切。
[0029]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)電泳采用2%的瓊脂糖膠，電泳的具體步驟如下:
[0030]a)制備2%瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖置于錐形瓶中，加入1XTAE，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，冷卻到65°C左右，加入核酸染色劑；
[0031 ] b)膠板制備::取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板，取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子;將內(nèi)槽置于水平位置并在固定位置放好梳子將瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層;室溫下靜置直至凝膠完全凝固；垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中；添加1 XTAE電泳緩沖液至沒過膠板1-2_為止；
[0032]c)加樣:分別將2yL樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)；
[0033]d)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，電泳45min ；
[0034]e)觀察照相:采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。
[0035]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟4)對(duì)待測樣品中M1-Ι基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定方法具體步驟為:在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出260bp和206bp條帶，即分別對(duì)應(yīng)M1-Ι基因和ty-5基因。
[0036]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0037]1.本發(fā)明所述番茄M1-1基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法中，PCR體系采用擴(kuò)增ty-5基因的標(biāo)記NAC1-new，與SLNACI相比，酶切位點(diǎn)減少，反應(yīng)體系穩(wěn)定性更高；
[0038]2.本發(fā)明中所述番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法建立多重PCR反應(yīng)體系時(shí)，采用的擴(kuò)增M1-Ι基因的標(biāo)記REX-1-new，與REX-1相比不會(huì)與NAC1-new擴(kuò)增標(biāo)記重疊，可用于建立多重PCR擴(kuò)增體系；
[0039]3.本發(fā)明所述的番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，同時(shí)檢測ty-5和M1-Ι體系的建立，加快了對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇的進(jìn)程，縮短了育種實(shí)踐，降低了育種成本。
【附圖說明】
[0040]圖1為ty-5基因和M1-Ι基因檢測電泳圖譜；其中M:100bp Marker; 1、2、3分別代表SLNAC1-new以 1227、moneymaker和F1 (1227 Xmoneymaker)為模板擴(kuò)增結(jié)果;4、5、6分別代表REX-1-new 以 VFN、moneymaker 和FI (VFNX moneymaker)為模板擴(kuò)增結(jié)果；7 代表多重 PCR 體系以FI (1227 X VFN)為模板擴(kuò)增結(jié)果；
[0041 ] 圖2為F2(1227XVFN)分離后代多重PCR檢測電泳圖譜;其中M:100bp Marker； 1-20代表20株隨機(jī)的F2(1227X VFN)分離單株經(jīng)多重PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0043]本發(fā)明所述的番前M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括以下步驟:
[0044]1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA;
[0045]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用M1-1和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
[0046]3)PCR產(chǎn)物酶切及電泳檢測；
[0047]4)對(duì)待測番茄樣品中是否含有M1-1基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。
[0048]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。
[0049]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，
[0050]ty-5 引物為:
[0051 ]NAC1-new F:TTGGATCTGTTCCGCCATG
[0052]NAC1-new R:TTCCTGCTGCTCGGTTCG；
[0053]M1-1 引物為:
[0054]REX-1-new F TCGGAGCCTTGGTCTGAATT
[0055]REX-1-new R GCCAGAGATGATTCGTGAGA。
[0056]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為:
[0057]lOng/μΙ模板DNA 2yL,
[0058]4pmmol/L NAC1-newR/F各0.8yL，
[0059]4pmmol/L REX-1R/F各0.5yL，
[0060]mix 酶 10yL，
[0061]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0062]多重PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min;每個(gè)循環(huán)94°C變性45sec，54°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0063]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)中，PCR產(chǎn)物酶切過程是在上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Taq I酶和Buffer進(jìn)行酶切。
[0064]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)電泳采用2%的瓊脂糖膠，電泳的具體步驟如下:
[0065]a)制備2%瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖置于錐形瓶中，加入1XTAE，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，冷卻到65°C左右，加入核酸染色劑；
[0066]b)膠板制備::取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板，取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子;將內(nèi)槽置于水平位置并在固定位置放好梳子將瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層;室溫下靜置直至凝膠完全凝固；垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中；添加1 XTAE電泳緩沖液至沒過膠板1-2_為止；
[0067]c)加樣:分別將2yL樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)；
[0068]d)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，電泳45min ；
[0069]e)觀察照相:采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。
[0070]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟4)對(duì)待測樣品中M1-Ι基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定方法具體步驟為:在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出260bp和206bp條帶，即分別對(duì)應(yīng)M1-Ι基因和ty-5基因；多態(tài)性條帶大小由小至大依次為:161bp和206bp(ty_5多態(tài)性條帶)及260bp和322bp(M1-l多態(tài)性條帶)；若電泳結(jié)果中有260bp和/或206bp條帶時(shí)，說明待測樣品中含有M1-Ι和/或ty-5;若電泳結(jié)果中只有260bp和206bp條帶，無161bp和322bp條帶時(shí)，說明待測樣品同時(shí)含有純合的M1-Ι和ty-5;若電泳結(jié)果中有260bp和206bp條帶，同時(shí)含有161bp和322bp條帶時(shí)，說明待測樣品含有雜合的M1-Ι和/或ty-5;若電泳結(jié)果中只有161bp和322bp條帶，無260bp和206bp條帶時(shí)，說明待測樣品不含有Mi_l和ty-5。
[0071]以下是本發(fā)明具體的實(shí)施例，在下述實(shí)施例中，所采用的試劑、原料均可以通過購買方式獲得。
[0072]實(shí)施例1
[0073]本實(shí)施例為了檢測構(gòu)建的多重PCR體系電泳后條帶是否存在重疊、覆蓋，具體步驟如下:
[0074]1)提取番茄葉片DNA
[0075]待測材料:1227(含有純合ty-5，不含