一種檢測進行性家族性肝膽汁淤積癥基因突變的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種檢測進行性家族性肝膽汁淤積癥基因突變 的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥是一種嚴重的膽汁淤積性肝病，為常染色體隱性遺 傳疾病。主要是由于基因突變而造成肝細胞和膽管上皮細胞上各功能蛋白的生成、修飾、調(diào) 控缺陷導致肝細胞性膽汁淤積，通常在嬰兒期或兒童期起病，最終發(fā)展為肝衰竭。根據(jù)其致 病基因不同，PFIC主要分為3型:①PFICl(Byler?。┯葾TP8B1基因突變引起，導致該基因編 碼的P型ATP酶-FIC1缺陷，PFIC1患者肝細胞膽汁酸過負荷，不過FIC1缺陷如何進展成膽汁 齡積尚不清楚；②PFIC2源于編碼膽鹽排泄栗(bilesaltexportpump，BSEP)蛋白的基因 ABCB11突變，影響了毛細膽管膜膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白（BSEP)的表達，導致膽鹽分泌降低，從而使得 肝細胞內(nèi)膽鹽聚積而造成嚴重損傷;③PFIC3為編碼多藥耐藥糖蛋白（MDR3)的ABCB4基因的 突變，影響了毛細膽管磷脂轉(zhuǎn)運器，導致磷脂輸出障礙。
[0003]該病為一種罕見疾病，其確切發(fā)病率目前不明，發(fā)病率即便在美國尚未有確切報 道，但是在一些具有近親婚配文化習俗的人群中發(fā)病率要高一些。本病男女發(fā)病率相似，主 要發(fā)生于嬰幼兒和兒童，在兒童期或青春期可因肝功能衰竭致死。估計新生兒發(fā)病率約1/ 50000到1/100000之間，占兒童膽汁淤積原因的10%到15%，占兒童肝移植的10%到15%。 三種型的PFIC臨床表現(xiàn)有所不同：①PFIC1患者通常在出生后幾周就發(fā)病，表現(xiàn)為瘙癢和黃 疸。在發(fā)病早期可呈間歇性，但逐漸發(fā)展為持續(xù)性癥狀;②PFIC2沒有PFIC1的肝外癥狀，而 肝病的臨床表現(xiàn)及病情進展卻較PFIC1劇烈。出生后幾個月就表現(xiàn)出持續(xù)性的膽汁淤積性 黃疸，可很快進展為急性肝衰竭;③PFIC3發(fā)病稍晚，通常在生命的頭幾年，少數(shù)會在學齡期 甚至青少年時期才起病，表現(xiàn)為膽汁淤積和瘙癢，但瘙癢程度較PFIC1和PFIC2輕。所有類型 PFIC均呈世界性分布，2/3的PFIC病例是PFIC1、PFIC2,其余1/3病例是PFIC3。
[0004] 與PFIC1相關(guān)的ATP8B1基因位于18q21-22。突變分析表明，PFIC1的ATP8B1基因突 變多是無義突變和缺失突變，嚴重影響了FIC1蛋白功能，而且許多FIC1病患者是復合雜合 子，更難以明辨基因型-表型相關(guān)性。PFIC2基因型-表型相關(guān)性亦不明了，ABCBll(BSEP)位 于2q24-31，含有28個外顯子。但大多數(shù)BSEP突變兒童，不論其突變類型，肝細胞毛細膽管膜 均無BSEP蛋白表達;現(xiàn)已報道PFIC2患者BSEP的突變可達100余種。嚴重表型常與蛋白截斷 或蛋白生成衰竭的基因突變有關(guān)。其中大多為無效突變，表現(xiàn)為終止密碼子提前出現(xiàn)及堿 基的插入或缺失。而發(fā)生移碼突變，余多為復合錯義突變，這些突變均嚴重影響了BSEP蛋白 的表達和(或）功能；已報道與PFIC3相關(guān)的ABCB4突變達30余種，ABCB4位于7q21.1，含有28 個外顯子，全長74kb。已有的研究顯示ABCB4基因突變熱點涉及外顯子6、9、12、14、18、23、 26,均位于編碼蛋白的主體區(qū)，并且突變的類型與膽淤的嚴重性相關(guān)。近1/3病例突變致截 斷蛋白生成，肝臟免疫染色檢測不出MDR3糖蛋白。另2/3病例為錯義突變，多發(fā)生在高度保 守的涉及ATP結(jié)合的WalkerA和B基序。這些氨基酸變化并不影響ATP酶活性與轉(zhuǎn)運過程，而 是造成細胞內(nèi)MDR3糖蛋白組裝錯誤，功能缺陷。
[0005]PFIC1型及PFIC2型臨床表型相似，通過對ATP8B1和ABCB11基因的檢測，有助于進 行確診。PFIC為常染色體隱性遺傳病，患兒兄弟姐妹有25 %的發(fā)病、50 %的攜帶致病突變的 可能性。對無癥狀兄弟姐妹進行致病基因檢測不但有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病、早期治療。而且， 由于各型的缺陷基因都已研究清楚，所以基因診斷最準確。Sanger測序法是目前公認的，大 多數(shù)臨床分子診斷項目的金標準，特異性甚至能達到100%，是分子診斷方面的經(jīng)典技術(shù)平 臺。因此采用Sanger測序法對ATP8B1、ABCB11和ABCB4的序列進行突變檢測，具有穩(wěn)定性高， 特異性好的優(yōu)點，能夠有效避免假陽性的產(chǎn)生。
[0006]為了給Sanger測序提供可靠的模板，首先必須針對該項目的特點，建立一個穩(wěn)定 可靠的PCR體系。該項目PCR部分在技術(shù)環(huán)節(jié)存在以下兩個難點：1.該項目需要提取血液基 因組DNA，由于臨床標本物流運輸中存在眾多不可控因素，因此臨床檢驗中往往得不到質(zhì)量 優(yōu)良的全血標本，因此獲得的DNA質(zhì)量也會存在較大的樣本間差異。2.由于需檢測的外顯子 數(shù)目較多，即PCR目的片段過多，導致PCR條件不統(tǒng)一。
[0007]溶解溫度(Tm)是PCR中一個很重要的參數(shù)，是50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度，對于設定PCR退火溫度是必須的，合適的退火溫度能夠有效的減少非特 異性結(jié)合，還能保證目的序列有效退火。所以在保證特異性的情況下，設計引物的Tm值盡量 接近，使PCR的退火溫度可以保持一致，從而達到PCR條件的統(tǒng)一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測進行性家族性肝膽汁淤積癥基因突 變的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒可用于檢測ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因的突 變位點，特異性好，靈敏度高。
[0009]本發(fā)明的一種檢測進行性家族性肝膽汁淤積癥基因突變的試劑盒，所述試劑盒包 括PCR擴增反應試劑以及用于樣本DNA中ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因擴增的PCR引 物;其中，PCR引物如下：
[0010] ATP8B1 基因：




[0151] 所述PCR擴增反應試劑包括GoTaq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反應緩沖液。
[0152] 本發(fā)明的一種檢測進行性家族性肝膽汁淤積癥基因突變的試劑盒的檢測方法，包 括如下步驟：
[0153] (1)采集待測血液樣本，提取DNA;
[0154] (2)以該DNA為模板，采用用于樣本DNA中ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因擴增 的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應產(chǎn)物，進行測序分析，確定是否存在堿基突變。
[0155] 所述步驟（2)中的PCR反應條件為：95°C5min; 95°C30s、62°C30s、72°C40s，15個循 環(huán)；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25 個循環(huán)；最后 72°C10min。
[0156] 所述步驟(2)中的PCR反應體系為:PCR擴增反應試劑10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，樣品DNA2yL。
[0157]有益效果
[0158] 本發(fā)明可用于檢測ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因的突變位點，特異性好，靈 敏度高;可用于臨床作為進行性家族性肝膽汁淤積癥早期發(fā)現(xiàn)、早期明確診斷的輔助性指 標，降低誤診率和避免延誤治療;家系成員進行篩查可明確發(fā)病風險，產(chǎn)前篩查并進行干 預，可降低后代進行性家族性肝膽汁淤積癥的發(fā)病率，使用方法簡單，具有良好的應用前 景。
【附圖說明】
[0159] 圖1是ATP8B1(A)、ABCB4(B)和ABCBll(C)基因突變型的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0160] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0161] 實施例1
[0162] 1.樣本抽提
[0163] (1)抽取200yL的全血，加入20yL蛋白酶K溶液，混勻。
[0164] (2)加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56°C放置10分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次，溶 液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0165] (3)加入200yL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去 除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0166] (4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0167] (5)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0168] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0169] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉廢 液。
[0170] (8)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸 附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0171] (9)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5mL離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50