一種檢測膽汁淤積性黃疸致病基因的dna文庫及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種通過高通量測序技術檢測膽汁淤積性黃疸致病基因的DNA文庫及其應用。具體說是根據(jù)60個膽汁淤積性黃疸致病基因，設計能覆蓋上述基因外顯子及毗鄰區(qū)域的超多重PCR引物，并對樣本基因組DNA進行超多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物利用高通量測序技術進行測序，尋找致病突變，明確膽汁淤積性黃疸的遺傳學病因，為臨床診斷提供遺傳學和分子生物學的理論依據(jù)。本發(fā)明具有準確、靈活、快速、低成本的特點；本發(fā)明涉及的60個基因檢測區(qū)域能夠檢測15種常見的膽汁淤積遺傳缺陷，對膽汁淤積性黃疸的鑒別診斷有著重要意義和臨床價值。
【專利說明】一種檢測膽汁淤積性黃疸致病基因的DNA文庫及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過高通量測序技術檢測膽汁淤積性黃疸致病基因的DNA文庫 及其應用。具體說是根據(jù)膽汁淤積性黃疸致病基因，設計能覆蓋上述基因外顯子及毗鄰區(qū) 域的超多重PCR引物，并對樣本基因組DNA進行超多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物利用高通量測序 技術進行測序，尋找致病突變，明確膽汁淤積性黃疸的遺傳學病因，為臨床診斷提供遺傳學 和分子生物學的理論依據(jù)，屬于生物醫(yī)學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。

【背景技術】
[0002] 膽汁淤積性黃疸是嬰兒期常見的臨床癥狀，其發(fā)生率約是活產(chǎn)新生兒的4/10000。 引起嬰兒膽汁淤積性黃疸的病因較多，預后懸殊，故早期診斷和治療極為重要。研究顯示超 過25%的膽汁淤積性黃疸是由遺傳缺陷造成的，許多遺傳疾病的臨床表型都包括嬰幼兒時 期的膽汁淤積性肝病。人們最初從a 1抗胰蛋白酶缺乏性黃疸導致的新生兒膽汁淤積的研 究中，逐漸認識到多種遺傳疾病都會導致膽汁淤積。隨著分子醫(yī)學的發(fā)展，一系列的遺傳 因素引起的嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥性黃疸其相關基因突變在世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和認識，包括 進行性家族性肝內(nèi)膽汁游積性黃痕（progressive familial intrahepatic cholestasis， PFIOl型（定位于染色體18q21的ATP8B1基因突變）、2型（定位于染色體2q24的ABCBll 基因突變）和3型（定位于染色體7q21. 1的ABCB4基因突變）、Alagille綜合征（定位 于染色體20pl2的JAGl基因突變）、Citrin缺陷引起的新生兒肝內(nèi)膽汁游積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin defi-ciency, NICCD)(定位于染色體 7q21. 3的SLC25A13基因突變）、各種膽汁酸合成缺陷?。℉SD3B7，AKR1D1，CYP7B1等基因突 變）等°
[0003] 現(xiàn)有的診斷技術，包括肝臟病理檢查等可以結(jié)合臨床特征對Alagille綜合征等 臨床疾病進行確診，但肝臟病理需要肝穿刺，屬于創(chuàng)傷性檢查；而PFICl型及PFIC2型臨床 表型相似，藥物治療效果欠佳，部分膽汁轉(zhuǎn)流術和（或）肝移植是治療的選擇之一。然而最 新研究發(fā)現(xiàn)許多PFICl型患者進行活體肝移植后，移植肝可出現(xiàn)嚴重肝臟病變，因此PFICl 型患者并不像PFIC2型患者那樣適合肝臟移植。同時PFICl型患者有可能發(fā)生耳聾，因此 需要定期檢查，了解有無聽力障礙發(fā)生。但目前僅結(jié)合臨床癥狀、生化及病理檢測有時不能 將兩者很好區(qū)分；同時，基于Sanger測序的基因檢測方法存在通量低的弊端，一次反應只 能檢測一個擴增區(qū)域，無法滿足龐大的基因檢測區(qū)域和多樣本檢測時效性的要求。
[0004] 因此，有必要尋求一種新的檢測膽汁淤積性黃疸致病基因的方法，能避免創(chuàng)傷性 檢查、提高診斷準確率，降低成本和勞動強度并提高時效性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種包含60個遺傳性病理性黃疸相關疾病的致病 基因的DNA文庫。其中60個基因如下：
[0006]
[0007]

【權利要求】
1. 一種基于Ion Torrent?高通量測序技術診斷遺傳性膽汁淤積相關疾病的DNA文庫， 其特征在于，該文庫包括60個遺傳性病理性黃疸相關的致病基因。
2. 權利要求1所述的DNA文庫在制備診斷試劑盒中的應用，其特征在于，所述試劑盒用 于診斷膽汁淤積性黃疸相關疾病。
3. 權利要求1所述的DNA文庫在制備診斷裝置中的應用，其特征在于，所述診斷裝置用 于診斷膽汁淤積性黃疸相關疾病。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述診斷裝置是測序芯片。
5. 如權利要求2-4任一權利要求所述的應用，其特征在于，所述應用包括下列步驟： (1) 提供受:試者樣本的基因組DNA ; (2) 利用權利要求1所述的DNA文庫從Ion Torrent?高通量測序平臺自動合成覆蓋 全部60個致病基因的擴增引物文庫，對目標區(qū)域進行超多重PCR擴增； (3) 對步驟（2)得到的擴增產(chǎn)物進行酶切； (4) 對步驟（3)得到的酶切產(chǎn)物加Barcode接頭； (5) 對步驟（4)得到的連接產(chǎn)物進行純化； (6) 對步驟（5)得到的純化產(chǎn)物用通用引物進行二次擴增； (7) 對步驟（6)得到的二次擴增產(chǎn)物進行片段選擇及濃度測定，即建成患者目標區(qū)域 擴增文庫； (8) 對步驟（7)所得到的文庫經(jīng)過油包水PCR擴增反應后，將待測序目的片段連接于 ISP珠子，得到反應液； (9) 將步驟⑶得到的包含ISP珠子的反應液點入芯片，上Ion Torrent?高通量測序 進行測序； (10) 將步驟（9)得到的堿基序列信息進行生物信息學比對處理，得到與疾病相關的突 變位點； (11) 對步驟（10)得到的突變位點進行Sanger測序法驗證。
6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述樣本來自受試者的外周血、體液、組織 器官樣本。
7. 如權利要求2-6任一權利要求所述的應用，其特征在于，所述應用進一步用于指導 治療。
8. -種診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的DNA文庫。
9. 一種診斷裝置，其特征在于，所述裝置包括權利要求1所述的DNA文庫。
10. 如權利要求9的診斷裝置，其特征在于，所述診斷裝置是測序芯片。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313698SQ201410591207
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】汪道文, 王宏 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院