專利名稱：斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及其應(yīng)用，尤其是抗新生血管生成蛋白因子活性的檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病，因而也是當(dāng)前全球研究的熱點(diǎn)。目前常用的抗腫瘤藥物因其專一性差，多具有很強(qiáng)的毒副作用，而且至今尚沒有得到一種理想的藥物。以新生血管生成為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物具有較好的專一性，近年來受到廣泛關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)抑制新生血管生成過程可以有效抑制腫瘤生長，許多新生血管生成抑制劑在多種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗腫瘤活性。與常用的細(xì)胞毒性藥物相比，由于內(nèi)皮細(xì)胞具有遺傳學(xué)的穩(wěn)定性，以其作為生物靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物不易產(chǎn)生抗藥性，其意義特別重大。
目前用于檢測血管形成的方法由于太復(fù)雜而不利于進(jìn)行藥物篩選，內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移試驗(yàn)，不僅試驗(yàn)方法復(fù)雜，且為體外試驗(yàn)；雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成試驗(yàn)，兔角膜新生血管生成試驗(yàn)和小鼠腫瘤模型等，雖為體內(nèi)試驗(yàn)，但是試驗(yàn)周期長、方法較繁瑣。采用小鼠腫瘤模型與斑馬魚(Brachydanio rerio)胚胎模型用抗新生血管生成藥物SU5416進(jìn)行對比試驗(yàn)前者試驗(yàn)周期為4周，后者只需2-3天；前者血管抑制率為42％后者則為40％；每個(gè)樣品組需要藥物的體積和藥物濃度前者分別為1800-3600ul和12mg/ml，后者分別為100ul和80ug/ml；前者給藥頻率連續(xù)18天，每天都需給藥，后者僅需給藥一次；前者為注射給藥，后者直接加到孵化液；前者的一組試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量一般為6只，后者可達(dá)36個(gè)。這一新型的活性檢測模型在此領(lǐng)域中的應(yīng)用，必將大大提高抗新生血管生成藥物篩選的速度。對闡明抗新生血管生成因子的抗腫瘤機(jī)制，發(fā)展新型的抗腫瘤藥物都具有十分重要的意義。
本發(fā)明首次應(yīng)用斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的活性，用來篩選抗新生血管生成活性蛋白因子或促新生血管生成活性蛋白因子。該模型比以往的檢測模型更簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、直觀、周期短，可以應(yīng)用于所有抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的篩選和檢測，以及進(jìn)一步的機(jī)理研究。由此，為分離純化、鑒定新型的抗腫瘤藥物提供了一條新的簡易的檢測模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型、具有較好的重復(fù)性、直觀性、試驗(yàn)周期短、且檢測過程簡便的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性檢測模型方法。
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種用于檢測待測蛋白質(zhì)組分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步驟1)隨機(jī)選取一定數(shù)量的孵化22小時(shí)的斑馬魚胚胎，去掉所述胚胎的絨毛膜；2)向步驟1)中的所述斑馬魚胚胎孵化液加入待測蛋白質(zhì)組分，在恒溫下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察斑馬魚胚胎的血管形成情況；3)判斷所述待測蛋白質(zhì)組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
為了便于定量化比較所述待測蛋白質(zhì)組分的活性，本發(fā)明的另一方面，涉及一種用于檢測待測蛋白質(zhì)組分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步驟1)隨機(jī)選取一定數(shù)量的孵化22小時(shí)的斑馬魚胚胎，去掉所述胚胎的絨毛膜；2)步驟1)中的斑馬魚胚胎孵化液中加入待測蛋白質(zhì)組分，在恒溫下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察斑馬魚胚胎的新生血管生成情況；3)待胚胎發(fā)育到一定時(shí)間后進(jìn)行血管染色；4)判斷所述待測蛋白質(zhì)組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，經(jīng)過染色后可以在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管形成情況。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述血管染色在斑馬魚胚胎發(fā)育的第三天進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述血管染色包括如下步驟將胚胎浸在4％多聚甲醛2小時(shí)，在PBS緩沖液中洗2次，然后依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脫水并浸潤，在NTMT中平衡后，加入染色液；胚胎中的血管都被標(biāo)記后，加PBST終止反應(yīng)。將染色后的斑馬魚胚胎放在脫色液中除去色素細(xì)胞的內(nèi)源黑色素，使染色的血管清晰可見。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，本發(fā)明所述方法適于檢測的待測蛋白質(zhì)組分可以為任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白質(zhì)、多肽或糖蛋白。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為取數(shù)對野生的斑馬魚交配，按照(Westerfield M.The Zebrafish BookA Guide for theLaboratory Use of Zebrafish.Eugene，OregonThe University of Oregon Press，1993.)方法孵化胚胎，在孵化后20-24小時(shí)，優(yōu)選為22小時(shí)，按照(G.N.Serbedzija，E.Flynn，C.E.Willett.ZebrafishangiogenesisA new model for drug screening.Angiogenesis 3353-359，1999.)方法去掉斑馬魚胚胎絨毛膜(去除100％)，在孵化液中加入待測蛋白質(zhì)組分，27-29℃下，持續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察斑馬魚胚胎的血管形成(對于胚胎血管形成的變化，最好采用定性或定量的比較標(biāo)準(zhǔn)，否則無法判定待測物質(zhì)是否影響血管形成以及影響程度的大小)，以檢驗(yàn)該蛋白質(zhì)組分對斑馬魚胚胎新生血管生成的影響。
例如，在48小時(shí)后觀察到出現(xiàn)斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側(cè)面、腹面的血管網(wǎng)消失的待測物質(zhì)，認(rèn)為具有抗新生血管生成活性；在48小時(shí)后觀察到出現(xiàn)血管網(wǎng)包圍區(qū)域面積的增大或血管網(wǎng)內(nèi)部血管大小長短的增加的待測物質(zhì)，判定具有促新生血管生成活性。
為了便于定量比較所加入的待測物質(zhì)的活性，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，還包括如下的染色方法具體的，將27-29℃孵化液中發(fā)育到72小時(shí)的斑馬魚胚胎，在室溫條件下，浸在4％多聚甲醛的固定液作用2小時(shí)，將斑馬魚胚胎固定，使斑馬魚胚胎保持在發(fā)育72小時(shí)的天然狀態(tài)，用磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4(12H2O)1.44g，KH2PO40.24g，加蒸餾水到1000ml，pH7.0)把胚胎表面殘留的固定液沖洗干凈。然后將固定并沖洗好的斑馬魚胚胎依次在不同濃度梯度的脫水劑中逐次脫水，從而提高斑馬魚胚胎的滲透性以利于染色液進(jìn)入胚胎內(nèi)。
將經(jīng)過上述處理的胚胎放在平衡液(0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH 9.5，50mM氯化鎂，0.1M氯化鈉，0.1％吐溫-20)中，使整個(gè)胚胎的通透性處于平衡狀態(tài)后，加入染色液(藍(lán)四氮唑75mg/ml，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽50mg/ml)，染色液中的顯色劑5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽和藍(lán)四氮唑使斑馬魚胚胎血管內(nèi)的堿性磷酸酶發(fā)生顯色反應(yīng)，形成紫紅色沉淀，從而標(biāo)記斑馬魚胚胎的血管。
待胚胎中的血管都被標(biāo)記后，加入終止液(PBST，含0.05％tween-20的磷酸緩沖鹽溶液)終止染色反應(yīng)；然后將胚胎放在脫色液(含5％甲酰胺和10％過氧化氫的磷酸緩沖鹽溶液)中除去色素細(xì)胞的內(nèi)源黑色素，以便使染色的細(xì)胞清晰可見；在立體顯微鏡下觀察胚胎并采集和保存圖像。
采集和保存圖像后，采用專門的圖像處理軟件，計(jì)算出不同情況下的各個(gè)斑馬魚胚胎新生血管生成量后進(jìn)行比較。正常情況下，在不加入抗新生血管生成蛋白質(zhì)組分或促新生血管生成蛋白質(zhì)組分的斑馬魚胚胎中，其腸下靜脈形成于卵黃的背面，籃狀血管網(wǎng)，自體節(jié)腹面邊緣開始越過卵黃延伸50-100μm；而抗新生血管生成效應(yīng)的表現(xiàn)是斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側(cè)面、腹面的血管網(wǎng)消失；促進(jìn)新生血管生成的效應(yīng)表現(xiàn)為(a)血管自體節(jié)開始的延伸超過150μm；或(b)血管網(wǎng)包圍區(qū)域的面積的增大；或(c)血管網(wǎng)內(nèi)部血管粗細(xì)長短的增加。另外，正常血管直徑小于10μm，測量血管直徑也可得到比較。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.材料易得。斑馬魚(Brachydanio rerio)屬鯉科，淡水魚，產(chǎn)地為印度和孟加拉國，繁殖速度較快，產(chǎn)卵量大，極易飼養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，是一種理想的脊椎動(dòng)物模式生物。
2.待測蛋白質(zhì)組分給藥方式簡單。可將待測蛋白質(zhì)組分直接加至胚胎生活的孵化液中，在96孔板中只需加入100ul的水體積即可，蛋白質(zhì)組分的用量少。
3.檢測方法簡便。收集胚胎后，加入待測蛋白質(zhì)組分，培養(yǎng)2天后進(jìn)行血管染色并觀察，操作簡便，所需周期短。
4.成本低廉。所用試劑為磷酸鹽、多聚甲醛、甲醇、雙氧水等，且用量少，檢測成本低廉，由此可以降低抗新生血管生成蛋白因子此類藥物的價(jià)格。
5.應(yīng)用前景好。本發(fā)明斑馬魚胚胎模型在檢測抗新生血管生成蛋白質(zhì)因子或促新生血管生成蛋白質(zhì)因子活性方面的應(yīng)用，必將大大提高抗新生血管生成藥物篩選的速度。對闡明抗新生血管生成因子的抗腫瘤機(jī)制，發(fā)展新型的抗腫瘤藥物都具有十分重要的意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1源自青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分1的抗新生血管生成活性的檢測1.胚胎采集 早晨取15對野生斑馬魚，自由組合分成5組交配孵化胚胎，采集1200個(gè)斑馬魚胚胎，吸出沉淀物質(zhì)，放于孵化液(蒸餾水)中，27℃培養(yǎng)箱保存22小時(shí)，應(yīng)及時(shí)取出白色胚胎(已死的)以防止水質(zhì)變壞；在此期間胚胎可通過卵黃取得養(yǎng)料，不需要其他的養(yǎng)料。
2.蛋白質(zhì)組分1的準(zhǔn)備 以青鯊軟骨為原料，通過鹽酸胍抽提、丙酮分級沉淀、超濾、凝膠過濾層析等技術(shù)分離純化得到待測的鯊魚軟骨蛋白質(zhì)組分1。
3.加入蛋白質(zhì)組分1 待斑馬魚胚胎發(fā)育到22小時(shí)，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑馬魚胚胎的絨毛膜，10分鐘后，絨毛膜開始脫落，此時(shí)用大量的水反復(fù)沖洗3次，去除所有的絨毛膜，得到健康的斑馬魚胚胎。將青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分1直接溶解在斑馬魚胚胎的孵化液中。隨機(jī)選取健康的288個(gè)胚胎分組，吸凈孵化液，加入含不同濃度蛋白質(zhì)組分1的孵化液于96孔培養(yǎng)板中，每一孔容量100ul，包括3個(gè)胚胎，為一小組。詳細(xì)分組情況及待測蛋白質(zhì)組分加入量如表1所示表1試驗(yàn)分組情況及待測蛋白質(zhì)組分1加入量


4.視覺鑒定 加入待測青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分1后，將胚胎分開置于96孔板的微孔中，27℃下孵化到受精后72小時(shí)，每組取一半胚胎直接觀察，鑒定存活狀況，形態(tài)以及循環(huán)系統(tǒng)是否有缺陷或異常，其中循環(huán)系統(tǒng)的鑒定可通過比較處理組和對照組血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀況及流速來判斷。
經(jīng)48小時(shí)的處理，斑馬魚胚胎可觀察到以下現(xiàn)象表2青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分1的抗新生血管生成作用

5.血管染色 在視覺鑒定的同時(shí)，每組取另一半胚胎進(jìn)行血管染色。首先將胚胎置于4％多聚甲醛中室溫處理2小時(shí)；而后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗兩次，把胚胎表面殘留的固定液沖洗干凈；依次浸于甲醇和PBT(含有0.1％Triton X-100和5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液)溶液的混合液中滲透脫水并隨后逐漸浸潤；混合液的成分如下表3所示表3甲醇和PBT溶液的配方

接著將胚胎置于NTMT(0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH 9.5，50mM氯化鎂，0.1M氯化鈉，0.1％吐溫-20)緩沖液中，室溫處理30分鐘，使胚胎平衡后染色；每毫升加入5μl75mg/ml藍(lán)四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽顯色劑染色20分鐘；加入終止液PBST(含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)，染色反應(yīng)停止，將胚胎浸入脫色液(含5％甲醛胺和10％H2O2的PBS溶液)中30分鐘，除去色素細(xì)胞的內(nèi)源黑色素，使已染色的細(xì)胞清晰可見；然后在立體顯微鏡下觀察胚胎，收集圖像并拍照。
6.測定血管變化利用圖像分析軟件NIH image(NIH image是由Wayne Rasband編寫的Mac圖像分析應(yīng)用程序，可對圖像面積、平均密度、重心及用戶定義的多邊形區(qū)域的分析，自動(dòng)進(jìn)行點(diǎn)的分析、測定路徑長度和角度)測定腸下靜脈長度，進(jìn)行血管形成影響作用的判斷。
通過以上斑馬魚胚胎模型檢測平臺，可以得出，我們所分離純化的青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分1具有抑制斑馬魚胚胎新生血管生成的活性，從而證明其是一種具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)組分，有待于進(jìn)一步的分離純化、理化性質(zhì)研究和開發(fā)應(yīng)用。
實(shí)施例2源自青鯊軟骨的蛋白質(zhì)組分2的抗新生血管生成活性的檢測1.胚胎采集 早晨取12對野生斑馬魚，自由組合分成4組交配孵化胚胎，采集1000個(gè)斑馬魚胚胎，吸出沉淀物質(zhì)，放于孵化液中，29℃培養(yǎng)箱保存22小時(shí)，利用形態(tài)和發(fā)育學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來隨時(shí)鑒定死活；已死的胚胎呈白色，應(yīng)及時(shí)取出以防止水質(zhì)變壞。
2.蛋白質(zhì)組分2的準(zhǔn)備 以青鯊軟骨為原料，通過鹽酸胍抽提、丙酮分級沉淀、超濾和凝膠過濾層析等技術(shù)分離純化得到純的蛋白質(zhì)組分2，分子量為1550道爾頓。
3.加入蛋白質(zhì)組分2 待斑馬魚胚胎發(fā)育到22小時(shí)，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑馬魚胚胎的絨毛膜，10分鐘后，絨毛膜開始脫落，此時(shí)用大量的水反復(fù)沖洗3次，得到健康的斑馬魚胚胎。將提純的鯊魚軟骨蛋白質(zhì)組分2直接加入到斑馬魚胚胎的孵化液中。隨機(jī)選取健康的288個(gè)胚胎分組，吸凈孵化液，加入蛋白質(zhì)組分2的孵化液于96孔培養(yǎng)板中，每一孔容量100ul，包括3個(gè)胚胎，為一小組。分組情況及待測蛋白質(zhì)組分2加入量與前表1相同。
4.視覺鑒定 加入蛋白質(zhì)組分2后，將胚胎分開置于96孔培養(yǎng)板的微孔中，29℃下孵化到受精后72小時(shí)，每組取一半胚胎直接觀察，鑒定存活狀況，形態(tài)以及循環(huán)系統(tǒng)是否有缺陷或異常，其中循環(huán)系統(tǒng)的鑒定可通過比較處理組和對照組血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀況及流速來判斷。
經(jīng)48小時(shí)的處理，斑馬魚胚胎可觀察到以下現(xiàn)象，如表4所示
表4青鯊軟骨蛋白質(zhì)組分2的抗新生血管生成作用

5.血管染色 在視覺鑒定的同時(shí)，每組取另一半胚胎進(jìn)行血管染色。首先將胚胎置于4％多聚甲醛中室溫處理2小時(shí)；而后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗兩次，把胚胎表面殘留的固定液沖洗干凈；依次浸于甲醇和PBT溶液的混合液中滲透脫水并隨后逐漸浸潤?；旌弦旱某煞秩缜氨?所示。
接著將胚胎置于NTMT緩沖液中，室溫處理30分鐘，使胚胎平衡后染色；每毫升加入5μl75mg/ml藍(lán)四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽顯色劑染色20分鐘；加入終止液PBST，染色反應(yīng)停止，將胚胎浸入脫色液中30分鐘，除去色素細(xì)胞的內(nèi)源黑色素，使已染色的血管清晰可見；然后在立體顯微鏡下觀察胚胎，收集圖像并拍照。
6.測定血管變化利用圖像分析軟件NIH image測定腸下靜脈長度，進(jìn)行血管形成影響作用的判斷。
通過以上斑馬魚胚胎模型檢測平臺，可以得出，我們所分離純化的分子量為1550Da蛋白質(zhì)組分，具有抑制斑馬魚胚胎新生血管生成的活性，從而證明其是一種純的具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)，可進(jìn)一步研究此蛋白質(zhì)的其他活性，測定序列以及克隆表達(dá)等。
權(quán)利要求
1.一種抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性檢測方法，包括如下步驟1)向孵化后22小時(shí)的斑馬魚胚胎孵化液中加入待測蛋白質(zhì)組分，在恒溫下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察斑馬魚胚胎的血管發(fā)育；2)判斷所述待測蛋白質(zhì)組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述步驟1)還包括如下步驟待胚胎發(fā)育到一定時(shí)間后進(jìn)行血管染色，在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在所述步驟1)中，在加入待測蛋白質(zhì)組分之前還包括去掉斑馬魚胚胎的絨毛膜的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所加入的待測蛋白質(zhì)組分可以為任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白質(zhì)、多肽或糖蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在所述步驟1)中加入待測蛋白質(zhì)組分后，在27-29℃持續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于在斑馬魚胚胎發(fā)育的第三天進(jìn)行血管染色。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于將胚胎浸在4％多聚甲醛2小時(shí)，在PBS緩沖液中洗2次，然后依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脫水并浸潤，在NTMT中平衡后，加入染色液；胚胎中的血管都被標(biāo)記后，加PBST終止反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于將染色后的斑馬魚胚胎放在脫色液中除去色素細(xì)胞的內(nèi)源黑色素，使染色的細(xì)胞清晰可見。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中表現(xiàn)出斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側(cè)面、腹面的血管網(wǎng)消失的待測物質(zhì)，認(rèn)為具有抗新生血管生成活性；表現(xiàn)出a)血管自體節(jié)開始的延伸超過150μm；或(b)血管網(wǎng)包圍區(qū)域面積的增大；或(c)血管網(wǎng)內(nèi)部血管粗細(xì)長短的增加的待測物質(zhì)，認(rèn)為具有促新生血管生成活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相關(guān)活性檢測方法及其應(yīng)用，具體地說就是通過斑馬魚胚胎模型方法檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相關(guān)活性，以及該方法的應(yīng)用。斑馬魚胚胎孵化后，直接加入抗新生血管生成蛋白質(zhì)組分或促新生血管生成蛋白質(zhì)組分，在恒溫下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察斑馬魚胚胎的發(fā)育情況；待胚胎發(fā)育到一定時(shí)間后進(jìn)行血管染色，在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管形成情況，采集和保存圖像。本發(fā)明具有材料易得，蛋白質(zhì)組分給藥方式簡單，檢測方法簡便，成本低，應(yīng)用性好等特點(diǎn)。
文檔編號A61K49/00GK1866025SQ20061004453
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者林秀坤, 鄭蘭紅, 楊少麗, 牛榮麗, 胡朝欣 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所