專利名稱：一種能清除超氧陰離子的寡聚肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用復(fù)合酶定向酶解羅非魚皮制取具有清除超氧陰離子自由基活性的寡聚肽的方法。
背景技術(shù)：
近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多危害人體健康的疾病如癌癥、衰老、心血管疾病、代謝失調(diào)、光損傷、白內(nèi)障、肌肉損傷、毒物侵害，甚至疲勞等都與人體內(nèi)的自由基有關(guān)，如何清除人體內(nèi)的自由基成為營(yíng)養(yǎng)保健學(xué)科的一個(gè)研究熱點(diǎn)。因此抗氧化劑不僅用于含脂肪食品的抗氧化，而且更為重要的是作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開發(fā)。目前，自由基清除劑的種類很多，但由于化學(xué)合成的自由基清除劑的不安全性和人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)自由基清除劑在食品中應(yīng)用的要求越來越嚴(yán)格，人們把目光逐步轉(zhuǎn)向從各種植物、動(dòng)物組織中提取天然的自由基清除劑，如茶葉中的茶多酚、大豆中的大豆異黃酮、骨骼肌中的肌肽、枸杞中的枸杞多糖、大豆蛋白分解得到的大豆肽以及慈菇、扇貝、六月霜的提取物等等。但這些產(chǎn)品的缺點(diǎn)是成本高，清除超氧陰離子自由基的效果差。目前國(guó)內(nèi)還沒有從魚皮膠原蛋白中提取能清除超氧陰離子的寡聚肽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用復(fù)合酶定向酶解羅非魚皮制備具有清除超氧陰離子的自由基活性的寡聚肽的方法，該寡聚肽具有低毒、高效的特點(diǎn)，可以克服現(xiàn)有自由基清除劑的上述缺陷。
一種能清除超氧陰離子的寡聚肽的制備方法，其特征是將羅非魚皮依次分別在氫氧化鈉水溶液、硫酸水溶液和檸檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后將魚皮用蒸餾水打漿，恒溫下攪拌提取，然后離心，將所得上清液凍干得到羅非魚皮膠，將該羅非魚皮膠用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢杳附猓缓鬁缑?，冷卻，用堿調(diào)pH，再加入Alcalase酶，恒溫?cái)嚢杳附?，滅酶，冷卻，離心，以清除超氧陰離子的IC50值為指標(biāo)，取上清液，經(jīng)過超濾、凝膠柱層析、陽離子交換柱層析、凝膠柱脫鹽、反相高相液相色譜分離純化后，凍干。
本發(fā)明以低值的羅非魚皮為原料，利用菠蘿蛋白酶和Alcalase酶復(fù)合酶解制備寡聚肽，所得產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子具有較好的清除效果。
具體實(shí)施例方式
將羅非魚皮40～60克(最好是50克)，依次分別加入6～8倍(最好是7倍)皮重的0.2％(重量百分濃度，下同)氫氧化鈉水溶液、0.2％硫酸水溶液和1％檸檬酸水溶液各浸泡30～50分鐘(最好是40分鐘)，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后將魚皮加入8～12倍(最好是10倍)蒸餾水打漿，40-50℃下，最好是45℃下恒溫?cái)嚢杼崛?0～14小時(shí)(最好是12小時(shí))，然后離心，將上清液凍干得到羅非魚皮膠。將該羅非魚皮膠加入其18～22倍(最好是20倍)重量的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，按照3800～4200u/g(最好是4000u/g)羅非魚皮膠的比例加入菠蘿蛋白酶，40-50℃下，最好是45℃下恒溫?cái)嚢杳附?～5小時(shí)(最好是4小時(shí))，然后滅酶，冷卻。用堿液調(diào)pH至7.5，按照5800～6200u/g(最好是6000u/g)與羅非魚皮膠的比例加入Alcalase酶，50-60℃下，最好是55℃下恒溫?cái)嚢杳附?～3小時(shí)(最好是2小時(shí))，滅酶，冷卻，離心，上清液經(jīng)過超濾，以各組分清除超氧陰離子的IC50值為指標(biāo)，收集分子量小于1000Da的部分，再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠柱層析、SP Sephadex C-25陽離子交換柱層析、Sephadex G-15凝膠柱脫鹽、反相高相液相色譜分離純化后，即得到本發(fā)明的能清除超氧陰離子的寡聚肽。
采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定各組分對(duì)超氧陰離子的清除效果，以對(duì)超氧陰離子抑制率達(dá)到50％時(shí)所需的濃度即IC50值為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所得寡聚肽清除超氧陰離子的IC50值為4.95μg/mL，小于目前常用的自由基清除劑Vc的IC50值6.80μg/mL，這說明本發(fā)明的寡聚肽的自由基清除效果好于Vc。經(jīng)過質(zhì)譜分析，該寡聚肽的分子量主要集中在311.3～932.8Da。
權(quán)利要求
1.一種能清除超氧陰離子的寡聚肽的制備方法，其特征是將羅非魚皮依次分別在氫氧化鈉水溶液、硫酸水溶液和檸檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后將魚皮用蒸餾水打漿，恒溫下攪拌提取，然后離心，將所得上清液凍干得到羅非魚皮膠，將該羅非魚皮膠用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢杳附?，然后滅酶，冷卻，用堿調(diào)pH，再加入Alcalase酶，恒溫?cái)嚢杳附猓瑴缑?，冷卻，離心，以清除超氧陰離子的IC50值為指標(biāo)，取上清液，經(jīng)過超濾、凝膠柱層析、陽離子交換柱層析、凝膠柱脫鹽、反相高相液相色譜分離純化后，凍干。
全文摘要
一種能清除超氧陰離子的寡聚肽的制備方法，其特征是將羅非魚皮依次分別在氫氧化鈉水溶液、硫酸水溶液和檸檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后將魚皮用蒸餾水打漿，恒溫下攪拌提取，然后離心，將所得上清液凍干得到羅非魚皮膠，將后者用檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液溶解，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢杳附猓缓鬁缑?，冷卻，用堿液調(diào)pH，再加入Alcalase酶，恒溫?cái)嚢杳附?，滅酶，冷卻，離心，以清除超氧陰離子的IC
文檔編號(hào)A61P39/06GK1858229SQ20061004448
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者曾名湧, 郭瑤, 董士遠(yuǎn), 劉尊英, 李八方 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)