具有誘導(dǎo)丹酚酸b積累作用的丹參內(nèi)生菌及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種丹參內(nèi)生菌及其用于丹參毛狀根培養(yǎng)時(shí)可提高丹酚酸B的積累。
【背景技術(shù)】
[0002] 丹參是唇形科多年生草本植物，又名大紅袍、紅根、赤參、紫丹參、血參等，分布于 我國華北、華東、中南、西北、西南等地區(qū)。它的根及根莖所含的活性成分按性質(zhì)可分為以下 兩類：脂溶性的二萜類成分和水溶性的酚酸成分。其中水溶性成分有：原兒茶醛、咖啡酸、 異阿魏酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、紫草酸B、紫草酸單甲酯、紫草酸二甲酯、紫草酸乙酯、 丹參酸甲（丹參素）及丹酚酸八、8、(：、03、？、6、11、1、1等。丹酚酸類化合物均具有很強(qiáng)的 抗氧化作用可以清除超氧陰離子和羥基自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而其中迷迭香酸具 還具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓生成、抗腎小球細(xì)胞增殖、抗抑郁、等重要的生 物活性，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
[0003] 丹參的市場需求正日益增大，但野生丹參資源有限，且不同地區(qū)丹參藥材質(zhì)量差 別很大，活性成分含量穩(wěn)定性差。另外栽培丹參的生長周期長且有效成分含量低，這都給臨 床使用和質(zhì)量控制帶來一定困難。近年來國內(nèi)外開展了對丹參組織與細(xì)胞培養(yǎng)的研宄，表 明通過丹參的細(xì)胞或組織培養(yǎng)可以直接獲得丹參的主要生物活性成分。其中，由發(fā)根農(nóng)桿 菌感染植物形成的丹參毛狀根系統(tǒng)，其生長速度較快，遺傳性穩(wěn)定，成為了生產(chǎn)丹參活性物 質(zhì)的良好培養(yǎng)系統(tǒng)。但是毛狀根活性成分產(chǎn)量低，影響著毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)乃至工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0004] 為解決這一矛盾，近年來許多研宄者利用誘導(dǎo)系統(tǒng)刺激毛狀根，通過誘導(dǎo)相關(guān)代 謝通路酶系統(tǒng)的表達(dá)，促進(jìn)有效次級代謝的積累從而提高產(chǎn)量。能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次生代 謝物的物質(zhì)叫做誘導(dǎo)子（Elicitor)，分為非生物誘導(dǎo)子和生物誘導(dǎo)子。非生物誘導(dǎo)子包括 Ag+等金屬離子，而生物誘導(dǎo)子包括酵母提取物及某些真菌發(fā)酵液等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種丹參內(nèi)生細(xì)菌--Pseudomonas psychrotoleransLG4,其能促進(jìn)丹參毛狀根中酷酸類物質(zhì)一丹酷酸B含量的積累。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種丹參內(nèi)生菌，為Pseudomonas psychrotoleransLG4,其保藏號為：CCTCCN0:M2015085。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述丹參內(nèi)生菌的用途：促進(jìn)丹參毛狀根中酚酸類物質(zhì)含量的積 累。酚酸類物質(zhì)為丹酚酸B。
[0008] 該菌株P(guān)seudomonaspsychrotoleransLG4是從丹參植株中采用平板稀釋法分離 得到一株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定其發(fā)酵液具有促進(jìn)丹參毛狀根丹酚酸B成分積累的作用。
[0009] 分離方法為：
[0010] 1)、將丹參的根經(jīng)表面消毒處理后，加入無菌水進(jìn)行研磨稀釋，涂布于營養(yǎng)瓊脂 上，于28~32°C培養(yǎng)1~3天；
[0011] 營養(yǎng)瓊脂配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂18g和蒸餾水1000mL，pH= 7. 2 ~7. 4。
[0012] 2)、挑取單菌落于相同的營養(yǎng)瓊脂平板劃線純化，于28~32°C培養(yǎng)1~3天；
[0013] 3)、重復(fù)步驟2)，直至獲得純培養(yǎng)物。
[0014] 本發(fā)明的丹參內(nèi)生菌的保藏信息具體如下：PseudomonaspsychrotoleransLG4， 保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC N0:M2015085,保藏時(shí)間2015年3月4日。
[0015] 本發(fā)明的丹參內(nèi)生菌一PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M 2015085)在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)24h后菌落呈圓形，菌落較小，邊緣整齊，表面干燥，產(chǎn)黃色色素， 培養(yǎng)3-5天后表面突起褶皺。
[0016] 本發(fā)明提供的PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)革蘭氏 染色陰性，好氧，桿狀，不產(chǎn)芽胞；在生長溫度為20~40°C、pH值為6. 0~8. 0的環(huán)境中生 長良好；能代謝葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等產(chǎn)酸。
[0017]該P(yáng)seudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2〇15〇85)的 16SrDNA序列 分析表明，與Genbank國際數(shù)據(jù)庫中記錄的菌株P(guān)seudomonaspsychrotolerans的相似性 為 99%。
[0018]該P(yáng)seudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)在丹參毛狀根培養(yǎng) 體系中作為誘導(dǎo)子促進(jìn)丹酚酸B積累的作用。
[0019] 本發(fā)明的PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)可促進(jìn)丹酷 酸B含量的提高。對人畜無毒無害，對環(huán)境不造成污染。可在丹參毛狀根培養(yǎng)中得到應(yīng)用， 產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。
[0020] 本發(fā)明的PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)用于促進(jìn)丹 參毛狀根丹酷酸B積累時(shí)，只需將利用該丹參內(nèi)生細(xì)菌--Pseudomonaspsychrotolerans LG4(CCTCCN0:M2015085)制備的誘導(dǎo)子接于毛狀根培養(yǎng)基中，即可促進(jìn)丹參毛狀根丹酚 酸B含量。
[0021] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：利用本發(fā)明提供的Pseudomonas psychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)發(fā)酵上清液誘導(dǎo)子，添加到丹參毛狀根培養(yǎng) 體系中即可提高丹酚酸B的含量，進(jìn)而提高丹參毛狀根中酚酸類的含量，所誘導(dǎo)的丹參毛 狀根可用于丹酚酸B單品的提取。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0023]實(shí)施例l、PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)的分離培養(yǎng) 方法，依次進(jìn)行以下步驟：
[0024] 1、于四川中江采集野生丹參植株，根部洗凈后25KHz超聲波處理5分鐘；
[0025] 2、在無菌條件下，對步驟1所得的供試材料用滅菌去離子水沖洗3次，并分別用 75% (v/v)的酒精和3% (m/V)次氯酸鈉溶液表面消毒；
[0026] 3、在無菌環(huán)境中，將步驟2所得的供試材料用無菌水沖洗3次，取100y1最后1 次沖洗的無菌水沖洗液涂布接種于營養(yǎng)瓊脂上，30°C培養(yǎng)24h后，進(jìn)行無菌驗(yàn)證。
[0027] 如無菌落產(chǎn)生，則繼續(xù)后續(xù)的步驟4 ;如有菌落產(chǎn)生，則返回步驟2繼續(xù)表面消毒 處理。
[0028] 4、在超凈臺中，取處理好的丹參根樣品1~2g，在無菌研缽中充分研磨，并加入 5mL無菌水，混勻，靜置15min，取100y1上清稀釋涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于28~ 32°C(較佳30°C)培養(yǎng)1~3天；
[0029] 5、挑取步驟4中所產(chǎn)生的單菌種于相同培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）劃線純化分 離，置于28~32°C(較佳30°C)培養(yǎng)1~3天，繼續(xù)挑取單菌落；
[0030] 重復(fù)上述操作直至得到純培養(yǎng)為止。
[0031] 6、將步驟5中所得到的單菌落進(jìn)行16srDNA序列測定，經(jīng)序列比對，確定菌株，并 保藏。得PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCNO:M2015085)。
[0032]實(shí)施例2、Pseudomonas psychrotolerans LG4(CCTCCN0:M 2015085)誘導(dǎo)子的制 備方法，依次進(jìn)行以下步驟：：
[0033] 1、將PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂 斜面，30°C培養(yǎng)2天；
[0034] 營養(yǎng)瓊脂斜面：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和蒸餾水1000mL，pH= 7. 2~7.4。
[0035] 2、用接種環(huán)挑取一環(huán)步驟1所得的斜面菌種，接種于含50ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中，于 28°C以 220rpm培養(yǎng) 72h，得PseudomonaspsychrotoleransLG4CCTCC M2015085發(fā)酵原液；
[0036] 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g和蒸餾水1000mL，pH= 7. 2 ~7. 4。
[0037] 上述步驟1和步驟2均在自然光條件下培養(yǎng)。
[0038] 3、取步驟2所得發(fā)酵原液，于4°C，12000rpm，離心2min，取上清過0. 22 ym微孔濾 膜，所得濾液為Pseudomonas psychrotolerans LG4(CCTCCN0:M2015085)誘導(dǎo)子。
[0039]實(shí)施例 3、PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCCN0:M2015085)對丹參毛狀 根丹酚酸B積累的促進(jìn)實(shí)驗(yàn)：
[0040] l、〇. 3g的丹參毛狀根（母根）接種于含100ml的6, 7-V培養(yǎng)基的250ml三角瓶 中，25°C，100rpm避光培養(yǎng)18天，作為基礎(chǔ)物；
[0041]實(shí)驗(yàn)組：在每個(gè)基礎(chǔ)物中加入 1. 5ml的PseudomonaspsychrotoleransLG4(CCTCC N0:M2015085)誘導(dǎo)子（實(shí)施例2所得），繼續(xù)相同條件（25°C，lOOrprn，避光）培養(yǎng)6天；作 為實(shí)驗(yàn)組；
[0042] 陰性對照（空白對照）：在每個(gè)基礎(chǔ)物中加入1. 5ml的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，繼續(xù) 相同條件（25°C，lOOrprn，避光）培養(yǎng)6天；陰性對照；
[0043] 上述實(shí)驗(yàn)組和空白對照組分別設(shè)置5個(gè)重復(fù)；
[0044] 將實(shí)驗(yàn)組和空白對照所得的丹參毛狀根分別進(jìn)行如下操作：
[0045] 2、培養(yǎng)結(jié)束后用蒸餾水將步驟1得到的毛狀根清洗三遍，用吸水紙吸干水分中， 稱鮮重（freshweight，F(xiàn)W);后將已稱鮮重的毛狀根放入烘箱，55°C干燥至恒重，測定干重(dryweight，DW)。
[0046] 3、取適量烘至恒重的丹參根，研磨成粉末。取0. 5g加入2. 5mL的70% (體積％ ) 甲醇，120W超聲波清洗機(jī)中超聲萃取60min(超聲過程中水溫不可過高，可適當(dāng)加入冰塊， 即，控制溫度< 20°C)，冷卻后取上清，過0. 45ym微孔濾膜，用高效液相色譜（HPLC)的方 法進(jìn)行酚酸類物質(zhì)一丹酚酸B含量的測定。
[0047] 測定結(jié)果如下：
[0048]實(shí)驗(yàn)組中加入PseudomonaspsychrotoleransLG4CCTCCM2015085 誘導(dǎo)子后毛 狀根干重保持不變（相對于空白對照而言），而丹酚酸B含量比空白對照組高60%。
[0049] 對比例、分別選用以下Pseudomonaspsychrotolerans菌株及本屬相近種的菌株 作為對比例，具體菌株如下：
[0050]A、德國微生物菌種保藏中心DSMZ保藏的代碼編號為DSM15758的Pseudomonas psychrotolerans；
[0051]B、中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心CFCC保藏的代碼編號CFCC11317的 Pseudomonaspsychrotolerans；
[0052]C、中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心CFCC保藏的代碼編號CFCC11072的 Pseudomonaspsychrotolerans；
[0053]D、德國微生物菌種保藏中心DSMZ保藏的代碼編號為DSM1045的Pseudomonas oleovorans；
[0054] 將上述Pseudomonas菌株按照上述實(shí)施例2所述的"誘導(dǎo)子制備"和實(shí)施例3所 述的"對丹參毛狀根丹酚酸B積累的促進(jìn)實(shí)驗(yàn)"進(jìn)行，最終所得的結(jié)果如下表1所示。
[0055]表 1.PseudomonaspsychrotoleransLG4CCTCCM2015085 及對比例對丹參毛狀 根酚酸類物質(zhì)積累的影響
[0056]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 丹參內(nèi)生菌，其特征是：為Pseudomonas psychrotolerans LG4,其保藏號為：CCTCC N0:M 2015085。
2. 如權(quán)利要求1所述的丹參內(nèi)生菌的用途，其特征是：促進(jìn)丹參毛狀根中酚酸類物質(zhì) 含量的積累。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹參內(nèi)生菌的用途，其特征是：酚酸類物質(zhì)為丹酚酸B。
【專利摘要】本發(fā)明涉及丹參內(nèi)生菌及其用于丹參毛狀根培養(yǎng)時(shí)可提高丹酚酸B的積累。具體而言，本發(fā)明公開了一種丹參內(nèi)生菌，為Pseudomonas psychrotolerans LG4，其保藏號為：CCTCC NO:M 2015085。其可促進(jìn)丹參毛狀根中酚酸類物質(zhì)(丹酚酸B)含量的積累。CCTCC NO:M 201508520150304
【IPC分類】A01N63-00, C12N1-20, C12R1-38
【公開號】CN104830717
【申請?zhí)枴緾N201510178706
【發(fā)明人】胡秀芳, 楊瑞環(huán), 梁宗鎖, 楊東風(fēng), 李歐, 楊隨娟, 尤紅, 沈書立, 蘇尚健, 張露, 班善贇
【申請人】浙江理工大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月15日