β-內(nèi)酰胺抗生素合成酶的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種β-內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，它按以下步驟進行：在酶標板的板孔中加入合成液，然后加入待測酶樣品，在微孔板振蕩反應器中，10-30℃，反應0.1-3小時，反應過程中每隔1-30分鐘取出酶標板加入PDAB顯色液顯色，酶標測定其在415nm處的吸光值大小；根據(jù)吸光值變化趨勢及吸光值的最低值，篩選出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是將β-內(nèi)酰胺抗生素的母核與側(cè)鏈溶解于KPB溶液中制成；所述待測酶樣品為β-內(nèi)酰胺抗生素合成酶。本發(fā)明可以用于用于內(nèi)酰胺類抗生素如阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、氨芐西林等酶法合成用酶的篩選。具有操作簡單、成本低廉、檢測準確等特點，適合大規(guī)模高通量篩選合成用酶。
【專利說明】β-內(nèi)酰胺抗生素合成酶的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高通量篩選技術(shù)，具體的說是β-內(nèi)酰胺抗生素合成酶的高通量篩選方法。
技術(shù)背景
[0002]目前內(nèi)酰胺類抗生素合成用酶主要集中在7-ACA、6_APA、阿莫西林、氨芐西林等的工業(yè)生產(chǎn)中，其中應用最廣的為青霉素酰化酶(EC 3.5.1.11)，其最早用于6^?八母核的生產(chǎn)。近幾年隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶分子改造技術(shù)的突破，各種用于內(nèi)酰胺類抗生素酶法合成的酶分子相繼出現(xiàn)，DSM公司已經(jīng)實現(xiàn)了阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛等抗生素的產(chǎn)業(yè)化；國內(nèi)聯(lián)邦制藥也實現(xiàn)了阿莫西林的酶法合成。
[0003]新型酶的發(fā)現(xiàn)可以通過自然突變的方法篩選得到，但這種方法因其效率低、目的性差，目前已不多用，人們現(xiàn)在更主要傾向于通過分子改造的手段獲得新型的合成酶。使用分子改造的方法對現(xiàn)有的合成酶進行突變時，通常會形成數(shù)量巨大的文庫，從而高通量的篩選方法成為篩選適合的合成酶的關(guān)鍵。目前人們普遍使用的篩選方法是高壓液相色譜(HPLC)，但該方法的準確性雖然比較高，但也存在檢測成本高的問題，并且HPLC法檢測時間長，從篩選效率上受到限制，不能提高篩選效率。專利CN102264904A公開一種利用檢測合成產(chǎn)物濃度的方法，用于高通量的篩選，該方法原理是利用頭孢氨芐在堿性條件下在490nm具有最大吸收峰的原理進行的檢測，因其只是針對于頭孢氨芐的篩選，不能用于頭孢克洛、阿莫西林等其它抗生素的篩選，不具有普遍適用性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)酰胺類抗生素合成酶的高通量篩選方法，以解決現(xiàn)有方法檢測效率低、適用范圍窄的問題。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種β_內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，它按以下步驟進行:
在酶標板的板孔中加入合成液，然后加入待測酶樣品，放入微孔板振蕩反應器中，10-30°C，反應0.1-3小時，反應過程中每隔1-30分鐘取出酶標板加入PDAB顯色液顯色，酶標測定其在415nm處的吸光值大??；根據(jù)吸光值變化趨勢及吸光值的最低值，篩選出吸光值較早到達最低值且吸光值最低值較低的酶，即為活性高、合成能力好的β_內(nèi)酰胺抗生素合成酶；
所述合成液是:將母核與側(cè)鏈溶解于KPB溶液中制成合成液，備用；所述的母核為6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA和7-AVCA中的任意一種，所述的側(cè)鏈為HPGMEHCL或PGMEHCL ；
所述待測酶樣品為內(nèi)酰胺抗生素合成酶。
[0006]本發(fā)明所述β -內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、側(cè)鏈ri2mg。[0007]本發(fā)明所述β -內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，所述β -內(nèi)酰胺抗生素合成用酶為催化合成阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢羥氨芐或氨芐西林的合成酶。
[0008]所述β -內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法的一個更好的實現(xiàn)方案是，在進行篩選的過程中，加入對照組，即按以下步驟進行:
在酶標板的板孔中加入合成液，然后將板孔分為實驗組和對照組，在實驗組板孔中加入待測酶樣品，在對照組板孔中加入與所述待測酶樣品等量的KPB溶液；然后放入微孔板振蕩反應器中，10_30°C，反應0.1-3小時，反應過程中每隔1-30分鐘取出酶標板加入PDAB顯色液顯色，分別酶標測定實驗組和對照組在415nm處的吸光值；根據(jù)實驗組與對照組吸光值差值的變化趨勢及實驗組與對照組吸光值差值的大小，篩選出吸光值差值較早到達最最大值且吸光值差值較大的酶，即為活性高、合成能力好的β_內(nèi)酰胺抗生素合成酶。
[0009]本發(fā)明所述的PDAB顯色液是:稱取0.4g-l.8g PDAB,加入20mL甲醇和44mL純水制成溶液I ;在16mL冰醋酸中加入60mL純水，再加入0.08gNa0H溶解制成溶液II ;將溶液I和溶液II混合均勻即得PDAB顯色液，避光4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0010]本發(fā)明的篩選過程的具體條件是:在96孔酶標板的板孔中按10-200 μ L/孔加入合成液，然后將板孔分為實驗組和對照組，所述實驗組中按10-200 μ L/孔加入待測酶樣品，所述對照組中按10-200 μ L/孔加入KPB溶液；然后放入微孔板振蕩反應器中，10-30°C，反應0.1-3小時，反應過程中每隔1-30分鐘取出酶標板加入10-50 μ L的PDAB顯色液，然后分別酶標測定實驗組和對照組在415nm處的吸收值。
[0011]本發(fā)明建立了一種高通量篩選方法，其是通過顯色液與母核反應顯色，檢測反應液中母核濃度，利用檢測母核濃度的方法，反應出其轉(zhuǎn)化率大小。酶標檢測的吸光值大小反映出反應體系中母核的濃度大小，因而通過吸光值的大小變化以及根據(jù)實驗組與對照組吸光值的差值大小，判斷出·酶對于相應母核的轉(zhuǎn)化能力大小。本發(fā)明方法適用范圍廣可以用于6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ACCA、7-AVCA等類似母核的檢測，用于內(nèi)酰胺類抗生素如阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、氨芐西林等酶法合成用酶的篩選。具有操作簡單、成本低廉、檢測準確等特點，適合大規(guī)模高通量篩選合成用酶。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是酶標檢測6-APA吸光值變化趨勢。
[0013]圖2是HPLC檢測6-APA濃度變化趨勢。
[0014]圖3是酶標檢測7-ADCA吸光值變化趨勢。
[0015]圖4是PLC檢測7-ADCA濃度變化趨勢。
[0016]圖5是酶標檢測7-ACCA吸光值變化趨勢。
[0017]圖6是HPLC檢測7-ACCA濃度變化趨勢。
[0018]圖7是阿莫西林用合成酶篩選結(jié)果。
【具體實施方式】
[0019]以下實施例出現(xiàn)的英文縮寫說明為:PDAB:對二甲氨基苯甲醛；6-APA:6-氨基青霉烷酸；7_ACA:7-氨基頭孢烷酸；7-ADCA -J-氨基去乙氧基頭孢烷酸；7_ACCA -J-氨基-3-氯-3-頭孢環(huán)-4-羧酸；7-AVCA:7-氨基-3-乙烯基-3-頭孢環(huán)-4-羧酸；HPGME *HCL:D-對羥基苯甘氨甲酯酸鹽酸鹽；PGME.HCL:D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽。
[0020]以下實施例用到的儀器為:酶標儀、控溫微孔板振蕩培養(yǎng)器、控溫搖床、冷凍離心機、多道移液器(排槍)。
[0021]以大腸桿菌青霉素酰化酶(EC:3.5.1.11，GeneBank:YP_002295891.1)為出發(fā)基
因，根據(jù)《精編分子生物學實驗指南第四版》第8章方法和《分子克隆試驗指南第三版》第15章方案2方法構(gòu)建得到大腸桿菌文庫(Clonef 12、Cf 8)，所構(gòu)建的文庫菌落在大腸桿菌青霉素?；冈嫉鞍仔蛄械幕A(chǔ)上有如下突變:
Clonel在第35位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，Clone2在第95位異亮氨酸突變?yōu)楸彼?，Clone3在第246位脯氨酸突變?yōu)榫彼?，Clone4在第478位甘氨酸缺失；Clone5在第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?，Clone6在第478位甘氨酸突變?yōu)槔野彼?，Clone7在第801位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔珻loneS在第838位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?；Clone9在第51位色氨酸缺失，ClonelO在第159位天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔珻lonell在第300位丙氨酸突變?yōu)榫彼?，Clonel2在第819位天冬氨酸缺失；
Cl:第51位色氨酸缺失+第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?，C2 --第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第159位天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，C3 --第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第300位丙氨酸突變?yōu)榫彼幔珻4 --第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第819位天冬氨酸缺失，C5:第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第478位甘氨酸突變?yōu)槔野彼?，C6:第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼崾?01位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，C7 --第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第838位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，CS --第313位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?第478位甘氨酸缺失。
[0022]實施例1
本實施例中用到的試劑配制方法如下:
①LB 培養(yǎng)基:I % Trptone; 0.5% Yeast Etract ; 1% NaCl ；
②Lysis Buffer 裂解緩沖液:10mM-50mM Tris-Hcl (pH 7.2) ; 1-5% Glycerol;10mM-50mM NaCl ；
③KPB 溶液:配置 0.02-0.2M KH2PO4 和 0.02-0.2M K2HPO4，調(diào)節(jié) pH 值 5.0-7.0 ；
④PDAB顯色液:稱取0.4g-l.8g PDAB,加入20mL甲醇和44mL純水置成溶液I ;16mL冰醋酸加入60mL純水，加入0.08gNa0H溶解制備溶液II ;混合溶液I和溶液II，避光4°C
保存；
⑤合成液:分別稱取30-1OOmg6-APA、7-ADCA或7-ACCA β -內(nèi)酰胺抗生素母核和40-120mg HPGME.HCL或PGME.HCL等合成側(cè)鏈溶解在IOmL KPB溶液中。
[0023]本實施例將文庫中的Clonef 12按如下分組進行篩選:
【權(quán)利要求】
1.一種β-內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，其特征在于它按以下步驟進行: 在酶標板的板孔中加入合成液，然后加入待測酶樣品，放入微孔板振蕩反應器中，10-30°C，反應0.1-3小時，反應過程中每隔1-30分鐘取出酶標板加入PDAB顯色液顯色，酶標測定其在415nm處的吸光值大小；根據(jù)吸光值變化趨勢及吸光值的最低值，篩選出吸光值較早到達最低值且吸光值最低值較低的酶，即為活性高、合成能力好的酶； 所述合成液是:將母核與側(cè)鏈溶解于KPB溶液中制成合成液，備用；所述的母核為6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA 和 7-AVCA 中的任意一種，所述的側(cè)鏈為 HPGME.HCL 或PGME.HCL ； 所述待測酶樣品為內(nèi)酰胺抗生素合成酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述β_內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，其特征是，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、側(cè)鏈ri2mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述β-內(nèi)酰胺抗生素合成用酶的高通量篩選方法，其特征是，所述內(nèi)酰胺抗生素合成用酶為催化合成阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢羥氨芐或氨芐西林的合成酶。
【文檔編號】C12Q1/34GK103667418SQ201310696643
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】劉力強, 賈娟娟, 牛昆, 范俊輝, 石晨光, 王召業(yè), 呂娜, 武芳, 王歡, 楊麗萍, 邸勝苗, 劉 東 申請人:華北制藥河北華民藥業(yè)有限責任公司