一種應(yīng)用Ii-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用Ii-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，通過人工合成Ii-Key與雞傳染性法氏囊病毒VP2肽表位（197-209）和新城疫病毒HN肽表位（345-353）的嵌合體基因，分別插入pET-32a原核表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)鎳親和柱層析純化后，將重組蛋白免疫SPF級BALb/c小鼠，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠體內(nèi)的抗體水平；與單純VP2197-209/HN345-353串聯(lián)表位對照組相比較，本發(fā)明構(gòu)建的基于活性Ii-Key四肽的嵌合體疫苗組抗體效價平均提高了13.72倍。該疫苗具有特異性強、易于制備、免疫效果好的特點。
【專利說明】—種應(yīng)用I 1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及構(gòu)建一種活性四肽I1-Key (LRMK)與雞傳染性法氏囊病毒VP2肽表位和新城疫病毒HN肽表位的嵌合體疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]主要組織相容性復(fù)合體(MajorHistocompatibility Complex, MHC) II類分子在抗原遞呈細(xì)胞中結(jié)合抗原肽并將其遞呈到細(xì)胞表面，激活免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在結(jié)合抗原肽之前需要伴侶分子一〖亙定鏈(invariant chain, Ii)占據(jù)其α、β鏈的抗原結(jié)合槽,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成九聚體。恒定鏈主要協(xié)助MHC II類分子轉(zhuǎn)運外源性抗原肽，并阻止內(nèi)源性抗原肽的結(jié)合。傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus, IBDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是常見危害雞群的重要傳染性疾病的病原。研究表明IBDV 的 VP2 蛋白的 197CDSSDRPRVYTIT209 和 NDV HN 蛋白的 346DEQDYQIR353肽分別為 IBDV和NDV的線性中和表位，分別具有抗這兩種病毒的活性。但是同時將兩種表位與恒定鏈關(guān)鍵基元(I1-Key)連接設(shè)計能攜帶兩種病毒抗原表位并能夠顯著增強免疫應(yīng)答的疫苗還是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的通過串聯(lián)雞傳染性法氏囊病毒VP2肽表位(197-209 )和新城疫病毒HN肽表位(345-353)的線性中和表位基因，并獲得可溶性表達(dá)的蛋白，在N端與抗原遞呈中重要分子一恒定鏈中關(guān)鍵基元(LRMK)四肽連接，有效提高MHC II類分子對抗原的遞呈效率，達(dá)到增強免疫應(yīng)答水平的目的。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0005]應(yīng)用I1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0006](I)人工合成I1-Key四肽與VP2 (197-209)表位肽和HN (345-353)表位肽的基因序列，獲得 pMD-19T-11-Key/VP2197_2Q9/HN345_353 重組質(zhì)粒；
[0007](2)根據(jù)目的基因序列設(shè)計特異性引物，從上述重組質(zhì)粒中以PCR方法分別擴增目的基因片段后插入原核表達(dá)載體pET_32a，獲得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，獲得重組菌；
[0008](3)將重組菌通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)超聲波裂解菌體，收集上清后用NiSepharose?6Fast Flow鎳親和層析柱純化，與弗氏佐劑混勻后，獲得His-11-Key/^P2197_209/HN345-353 嵌合體疫苗，對照組分別設(shè)His-VP2197_2(l9/HN345_353和His標(biāo)簽蛋白組；
[0009](4)通過腹腔注射免疫SPF級BAL b/c小鼠，采集免疫鼠的血清，以間接ELISA方法檢測各組血清抗體水平。
[0010] 所述的活性四肽I1-Key (LRMK)與雞傳染性法氏囊病毒VP2 (197-209)肽表位和新城疫病毒HN (345-353)肽表位的嵌合體構(gòu)建過程如下:
[0011](I) I1-Key四肽與VP2197_2(I9和HN345_353串聯(lián)表位的設(shè)計及基因合成:
[0012]首先設(shè)計VP2197_2Q9和HN345_353串聯(lián)表位，表位通過連接肽AAY (Ala-Ala-Tyr)連接，I1-Key再與上述串聯(lián)表位連接，如圖4I1-Key-VP2197-209/HN345-353嵌合體疫苗構(gòu)建示意圖所示；
[0013]疫苗肽氨基酸序列:N-LRMKAAYCDSSDRPRVYTITAAYDGQDYQIR-C
[0014]設(shè)計疫苗氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列，在所述基因序列5’端添加EcoR I, 3’端添加終止密碼子TGA和SalI酶切位點，全基因合成，該合成序列插入到PMD-19T克隆載體中發(fā)回；
[0015](2) I1-Key/VP2197_209/HN345_353嵌合體基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化:[0016]以PMD19-T重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計合成所述特異性引物如下:
[0017]Pl:5’ -CGGAATTCCTTCGCATGAAG-3’，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點；
[0018]P2:5’ -ACGCGTCGACTCACCGAATTTG-3’，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；
[0019]對照序列VP2197_209/HN345_353特異性引物設(shè)計如下:
[0020]Pl:5’ -CGGAATTCATGTGTGACAGC-3’，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點；
[0021]P2:5’ -GCGTCGACTCACCGAATTTG-3’，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；
[0022]將所述I 1-Key/VP2197_2Q9/HN345_353 基因片段及對照 VP2197_209/HN345_353 采用相同的PCR擴增條件，擴增目的片段。通過DNA Extraetion Kit純化回收和EcoR I與SalI雙酶切后與同樣雙酶切的pET_32a原核表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta菌，獲得pET-32a-11-Key/VP2197_209/HN345_353 和對照 pET-32a-VP2197_2(l9/HN345_353 重組質(zhì)粒；
[0023]挑取單克隆重組菌接種Amplr LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)4h，加入0.8mmol/LIPTG誘導(dǎo)5h后收集菌體，通過反復(fù)凍融和超聲波裂解細(xì)胞，離心后分別收集上清和沉淀以15%SDS-PAGE凝膠電泳對融合蛋白表達(dá)形式進行鑒定，對重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，取裂解液上清用Ni SepharoseTM6Fast Flow鎳層析柱進行親和層析,用HiTrap Desalting的Sephadex G_25柱對純化蛋白進行脫鹽，獲得純化的融合蛋白。
[0024]所述的嵌合疫苗的制備過程如下:
[0025](I)抗原乳化:
[0026]對所述嵌合體蛋白HiS-11-Key/VP2197_2(l9/HN345_353采用Folin酚法測蛋白濃度，取100 μ g所述蛋白與等體積弗氏完全/不完全佐劑充分混勻，乳化；
[0027](2)疫苗免疫:
[0028]選取18~20g SPF級BAL b/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐劑與等體積嵌合體蛋白乳化，每只小鼠經(jīng)腹腔注射IOOyg左右的嵌合體蛋白；15d后采用弗氏不完全佐劑與等體積嵌合體蛋白乳化，免疫；間隔IOd后再加強免疫2次；最后一次免疫后第7天進行采血，分離抗血清備用。
[0029]所述的步驟(4)中采用間接ELISA方法檢測免疫效應(yīng)的過程如下:
[0030](I)抗原包被:以每孔 100 μ L 人工合成 10 μ g/ml VP2197_2(I9/HN345_353 多肽 4°C過夜包被96孔酶標(biāo)板,置于微量振蕩器上洗漆3次,每次2min ；
[0031](2) —抗反應(yīng):將所述抗血清倍比稀釋后每孔加入100μ L,37°C反應(yīng)40min,洗漆同上；[0032](3)酶標(biāo)二抗反應(yīng):每孔加入IOOyL HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，37 °C反應(yīng)40min,洗漆同上；
[0033](4)顯色:加入鄰苯二胺(OPD)底物液，15min避光顯色；
[0034](5)終止反應(yīng):每孔加入100 μ L2mol/L H2SO4溶液；
[0035](6)檢測:使用酶標(biāo)儀檢測0D492nm吸光值，當(dāng)待檢孔OD值大于陰性對照孔2.1倍的抗體稀釋度判讀為抗體效價。
[0036]基于I1-Key的VP2/HN嵌合體疫苗處理組比肽表位串聯(lián)組的抗體水平明顯增高(p〈0.05)，平均效價提高了 13.72倍。
[0037]融合蛋白的反應(yīng)原性:
[0038]以15%SDS-PAGE凝膠電泳融合蛋白后轉(zhuǎn)PVDF膜，恒流1.5mA/cm2,1.5h，以5%脫脂乳室溫封閉2h，PBST洗滌3次，每次lOmin，加入適量稀釋的抗His的單克隆抗體4°C過夜結(jié)合，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，室溫結(jié)合2h，PBST洗滌，加入DAB顯色劑顯色后終止反應(yīng)，圖3表明，嵌合體蛋白具有良好的免疫原性。
[0039]本發(fā)明的有益效果:
[0040]與單純VP2197_2(I9/HN345_353串聯(lián)表位對照組相比較，本發(fā)明構(gòu)建的基于活性I1-Key四肽的嵌合體疫苗組抗體效價平均提高了 13.72倍，該疫苗具有特異性強、易于制備、免疫效果好的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為SDS-PAGE電泳分析嵌合體蛋白的表達(dá)形式，泳道I蛋白marker ；2:pET-32a-His 上清；3:pET-32a_His 沉淀；4:His_VP2/HN 上清；5:His_VP2/HN 沉淀；6:His-11-Key/VP2/HN 上清；7:His-1i_Key/VP2/HN 沉淀
[0042]圖2為融合蛋白的純化鑒定結(jié)果:泳道I為蛋白Marker;泳道2:純化的His標(biāo)簽蛋白；泳道3:純化的I1-Key/VP2/HN ;純化的4:His-VP2/HN
[0043]圖3為嵌合體誘導(dǎo)的抗體水平及其免疫原性的檢測。圖A為間接ELISA檢測的抗體水平(采用Origin8.0軟件分析)；圖B為Western blot檢測融合蛋白的免疫原性
[0044]圖4為I1-Key-VP2197-209/HN345_353嵌合體疫苗構(gòu)建示意圖。
【具體實施方式】
[0045]下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0046]下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0047]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0048]下述實施例中的比例，如無特別說明，均為體積比例。
[0049] 1、嵌合體設(shè)計和基因合成
[0050]首先設(shè)計VP2197_2Q9和HN345_353串聯(lián)表位，表位通過AAY連接肽(Ala-Ala-Tyr)連接，I1-Key再與上述串聯(lián)表位連接。具體序列如下:5，-CGgaattcCTTCGCATGAAGGCCGCCTACTGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACTATAACTGCCGCCTACGATGGACAAGATTACCAAATTCGGTGAgtcgacgcGT-3，
[0051]在所述基因序列5’端添加EcoR I，3’端添加終止密碼子TGA和SalI酶切位點，全基因合成，插入到PMD-19T克隆載體。
[0052]2、嵌合體基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化
[0053]以PMD19-T重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計合成所述特異性引物如下:
[0054]
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用I1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)人工合成I1-Key四肽與VP2(197-209)表位肽和HN (345-353)表位肽的基因序列，獲得 pMD-19T-11-Key/VP2197_209/HN345_353 重組質(zhì)粒; (2)根據(jù)目的基因序列設(shè)計特異性引物，從上述重組質(zhì)粒中以PCR方法分別擴增目的基因片段后插入原核表達(dá)載體pET_32a，獲得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，獲得重組菌； (3)將重組菌通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)超聲波裂解菌體，收集上清后用NiSepharose?6Fast Flow鎳親和層析柱純化，與弗氏佐劑混勻后，獲得His-11-Key/VP2197_209/HN345_353嵌合體疫苗，對照組分別設(shè)His-VP2197_2(l9/HN345_353和His標(biāo)簽蛋白組； (4)通過腹腔注射免疫SPF級BALb/c小鼠，采集免疫鼠的血清，以間接ELISA方法檢測各組血清抗體水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用I1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，其特征在于:所述的活性四肽I1-Key(LRMK)與雞傳染性法氏囊病毒VP2 (197-209)肽表位和新城疫病毒HN(345-353)肽表位的嵌合體構(gòu)建過程如下: (1)I1-Key四肽與VP2197_2(I9和HN345_353串聯(lián)表位的設(shè)計及基因合成: 首先設(shè)計VP2197_2(I9和HN345_353串聯(lián)表位，表位通過連接肽AAY(Ala-Ala-Tyr)連接，I1-Key再與上述串聯(lián)表位連接，如I1-Key-VP2197-209/HN345_353嵌合體疫苗構(gòu)建示意圖所示； 疫苗肽氨基酸序列:N-LRMKAAYCDSSDRPRVYTITAAYDGQDYQIR-C設(shè)計疫苗氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列，在所述基因序列5’端添加EcoR I, 3’端添加終止密碼子TGA和SalI酶切位點，全基因合成，該合成序列插入到PMD-19T克隆載體中發(fā)回； (2)I1-Key/VP2197_209/HN345_353嵌合體基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化: 以pMD19-T重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計合成所述特異性引物如下: Pl:5’ -CGGAATTCCTTCGCATGAAG-3’，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點； P2:5’ -ACGCGTCGACTCACCGAATTTG-3’，下劃線部分為 Sal I 酶切位點； 對照序列VP2197_2Q9/HN345_353特異性引物設(shè)計如下: Pl:5’ -CGGAATTCATGTGTGACAGC-3’，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點； P2:5’ -GCGTCGACTCACCGAATTTG-3’，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；
將所述 I1-Key/VP2197_209/HN345_353 基因片段及對照 VP2197_2(I9/HN345_353 采用相同的 PCR 擴增條件，擴增目的片段。通過DNA Extraetion Kit純化回收和EcoR I與Sal I雙酶切后與同樣雙酶切的pET_32a原核表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta菌，獲得pET-32a_Ii_Key/VP2197_209/HN345_353 和對照 pET-32a-VP2197_2Q9/HN345_353 重組質(zhì)粒； 挑取單克隆重組菌接種Amplr LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)4h，加入0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h后收集菌體，通過反復(fù)凍融和超聲波裂解細(xì)胞，離心后分別收集上清和沉淀以15%SDS-PAGE凝膠電泳對融合蛋白表達(dá)形式進行鑒定，對重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，取裂解液上清用 Ni SepharoseTM6Fast Flow鎮(zhèn)層析柱進行親和層析,用 HiTrap Desalting 的 SephadexG-25柱對純化蛋白進行脫鹽，獲得純化的融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用I1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，其特征在于:所述的嵌合疫苗的制備過程如下: (1)抗原乳化: 對所述嵌合體蛋白HiS-11-Key/VP2197_2(l9/HN345_353采用Folin酚法測蛋白濃度，取.100 μ g所述蛋白與等體積弗氏完全/不完全佐劑充分混勻，乳化； (2)疫苗免疫: 選取18~20g SPF級BAL b/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐劑與等體積嵌合體蛋白乳化，每只小鼠經(jīng)腹腔注射IOOyg左右的嵌合體蛋白；15d后采用弗氏不完全佐劑與等體積嵌合體蛋白乳化，免疫；間隔IOd后再加強免疫2次；最后一次免疫后第7天進行采血，分離抗血清備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用I1-Key活性四肽攜帶法氏囊VP2和新城疫HN抗原肽表位嵌合疫苗的制備方法，其特征在于:所述的步驟(4)中采用間接ELISA方法檢測免疫效應(yīng)的過程如下: (1)抗原包被:以每孔100μ L人工合成10 μ g/ml VP2197_2(I9/HN345_353多肽4°C過夜包被.96孔酶標(biāo)板，置于微量振蕩器上洗滌3次，每次2min ； (2)—抗反應(yīng):將所述抗血清倍比稀釋后每孔加入100yL,37°C反應(yīng)40min,洗漆同上； (3)酶標(biāo)二抗反應(yīng):每孔加入100μ L HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，37°C反應(yīng)40min，洗滌同上； (4)顯色:加入鄰苯二胺(OPD)底物液，15min避光顯色； (5)終止反應(yīng):每孔加入100μ L2mol/L H2SO4溶液； (6)檢測:使用酶標(biāo)儀檢測0D492nm吸光值，當(dāng)待檢孔OD值大于陰性對照孔2.1倍的抗體稀釋度判讀為抗體效價。
【文檔編號】C12N15/70GK103933560SQ201310665615
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】劉雪蘭, 徐姍姍, 李槿年, 許發(fā)芝, 葉紅 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)