專利名稱：分泌高中和活性傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌高中和活性傳染性法氏囊病毒(IBDV)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)。具體為單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞C128株具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，分泌的單克隆抗體不僅中和效價高而且對不同動物源的IBDV毒株均具有高中和活性，可以用于傳染性法氏囊病(IBD)發(fā)病動物的臨床治療。
背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的以侵害雛禽淋巴組織,特別是中樞免疫器官一法氏囊為主要特征的傳染病。該病不但引起患病動物死亡，而且還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗，是引起我國及世界養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的主要傳染病之一。盡管采取了以免疫接種疫苗為主的綜合性防控措施，但由于IBDV的生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易變異以及多種禽鳥類可帶毒傳播，目前仍是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一，由該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大。IBDV是雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬成員，基因組由大(A)小(B)兩個節(jié)段組成，編碼五種病毒蛋白:乂？1、￥ 2、￥ 3、￥ 4和￥ 5。VPl是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，是由B節(jié)段編碼的一種依賴RNA的RNA聚合酶，與病毒RNA的復(fù)制和毒力有關(guān)。A節(jié)段(3.3 kb)含有2個部分重疊的開放閱讀框(0RF)，其中較大的ORF編碼多聚蛋白VP2-4-3，然后該蛋白進(jìn)一步剪切加工成三個成熟蛋白VP2、VP4、VP3。VP2和VP3是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼。VP2占結(jié)構(gòu)蛋白總量的51%，分子量為37 40kD，既是病毒的的主要結(jié)構(gòu)蛋白又是病毒的主要保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異等有關(guān)。VP3和病毒RNA組成螺旋狀的核蛋白復(fù)合物，位于病毒顆粒內(nèi)部。VP4為病毒自身蛋白酶。另一個小ORF編碼VP5，是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的毒力和復(fù)制效率有關(guān)。目前，預(yù)防IBD的主要手段是疫苗免疫接種。低毒力的傳染性法氏囊病活疫苗在有母源抗體存在的條件下難以達(dá)到理想的免疫效果，無法有效地抵抗IBDV野毒的感染。中等毒力的傳染性法氏囊病活疫苗可突破母源抗體，有效激發(fā)免疫保護(hù)，有效地抵抗IBDV感染，但這些毒株會不同程度地造成法氏囊的損傷。活疫苗的使用存在著IBDV發(fā)生自然重配而產(chǎn)生變異強(qiáng)毒株的風(fēng)險，變異強(qiáng)毒株與超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，以及野外IBDV毒株VP2基因變異引起的毒力變化和VP2抗原表位的漂移產(chǎn)生的抗原變異株，使傳統(tǒng)的疫苗毒株不能提供完全有效的免疫保護(hù)，IBD疫苗免疫預(yù)防失敗不斷發(fā)生。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，對IBD免疫預(yù)防失敗的IBD發(fā)病動物進(jìn)行治療，可降低發(fā)病動物的死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。目前，使用的IBDV卵黃抗體或高免血清治療方法，因免疫動物與抗原存在著批次差異，不僅生產(chǎn)的不同批次的抗體效價不一致，更重要的是由于多種疫病可以通過卵黃垂直傳播和血液水平傳播，因此在卵黃抗體或高免血清生產(chǎn)過程中存在著蛋源性和血源性疫病傳播的巨大風(fēng)險，產(chǎn)生嚴(yán)重的生物安全問題。運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體具有特異性高、效價高、可大規(guī)模生產(chǎn)、便于質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用具有高中和活性的IBDV單克隆抗體治療IBD發(fā)病動物，可以克服目前使用的IBDV卵黃抗體或高免血清的諸多缺點(diǎn)，提高療效。目前，有關(guān)分泌IBDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株已有報道，部分細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對IBDV具有中和活性，但中和效價低，對不同IBDV毒株的中和活性未見報道。本發(fā)明從IBD疫苗免疫預(yù)防失敗的發(fā)病雞法氏囊組織中分離IBDV當(dāng)前流行強(qiáng)毒株為免疫原，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)建立了 IBDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫，通過IBDV中和試驗(yàn)篩選出了分泌高中和效價的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞C128株，分泌的單克隆抗體對雞源IBDV強(qiáng)毒株、鴨源IBDV強(qiáng)毒株、鵝源IBDV強(qiáng)毒株以及IBDV弱毒疫苗株均具有高中和活性(達(dá)到101(1)，本發(fā)明的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞C128株具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，分泌的單克隆抗體不僅中和效價高而且抗IBDV毒株范圍廣，將本發(fā)明制備的高中和活性單克隆抗體治療劑應(yīng)用于IBD發(fā)病動物的臨床治療，不僅療效顯著，并且在單克隆抗體生產(chǎn)過程中沒有引入外源 疫病的風(fēng)險等生物安全問題。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是引起我國及世界養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的主要傳染病之一。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，對IBD免疫預(yù)防失敗的IBD發(fā)病動物進(jìn)行治療，可降低發(fā)病動物的死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。目前，使用卵黃抗體和高免血清治療IBD，雖然可降低發(fā)病動物的死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失，但在卵黃抗體或高免血清生產(chǎn)過程中存在著蛋源性和血源性疫病傳播的巨大風(fēng)險，產(chǎn)生嚴(yán)重的生物安全問題。本發(fā)明的目的是提供一種分泌高中和活性IBDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株的建立是用近期從疫苗免疫失敗的IBD發(fā)病雞群中分離的現(xiàn)行流行毒株IBDV-AHl為抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)建立的167株IBDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫中獲得的。用該雜交瘤細(xì)胞C128株制備的小鼠腹水，經(jīng)病毒中和試驗(yàn)證明不僅中和效價高而且抗IBDV毒株范圍廣，應(yīng)用于IBD發(fā)病動物的臨床治療，療效顯著，并且在單克隆抗體生產(chǎn)過程中沒有引入外源疫病的風(fēng)險等生物安全問題。
技術(shù)方案
一種分泌高中和活性傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞C128株，該雜交瘤細(xì)胞株于2013年3月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:C201322，分類命名:雜交瘤細(xì)胞。用所述雜交瘤細(xì)胞C128株制備的傳染性法氏囊病毒單克隆抗體。所述的單克隆抗體可在制備傳染性法氏囊病毒單克隆抗體治療劑中得到應(yīng)用。所述單克隆抗體治療劑對雞源IBDV強(qiáng)毒株、鴨源IBDV強(qiáng)毒株、鵝源IBDV強(qiáng)毒株以及IBDV弱毒疫苗株的中和效價高達(dá)101(1。所述單克隆抗體治療劑可用于IBD發(fā)病動物的臨床治療。所述單克隆抗體治療劑制備方法為，將雜交瘤細(xì)胞C128株注射到經(jīng)BALB/c小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水，離心，收集上清液，滅活補(bǔ)體，過濾除菌，中和效價測定，稀釋，加入穩(wěn)定劑，分裝，低溫凍存。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下:
1.本發(fā)明使用的IBDV免疫原是從疫苗免疫預(yù)防失敗的發(fā)病雞法氏囊組織中分離的IBDV當(dāng)前流行強(qiáng)毒株。2.本發(fā)明從建立的167株分泌IBDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞C128株，用其制備的小鼠腹水抗體對IBDV的病毒中和效價高達(dá)101(1。3.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體對雞源IBDV強(qiáng)毒株、鴨源IBDV強(qiáng)毒株、鵝源IBDV強(qiáng)毒株以及IBDV弱毒疫苗株均表現(xiàn)高中和活性，抗IBDV毒株范圍廣。4.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體治療劑，用于IBD發(fā)病動物的臨床治療，治愈率達(dá)96%，療效顯著，安全無不良副反應(yīng)。于-20°C保存二年后抗體中和效價不降低，穩(wěn)定性好。
具體實(shí)施例方式(一)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
1.1BDV抗原的制備從近期IBD疫苗免疫失敗的發(fā)病雞法氏囊組織中分離當(dāng)前流行IBDV強(qiáng)毒株(王永山等，近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征，中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(12): 919-925)，感染4周齡的SPF雞，采取死亡雞的法氏囊組織，制成組織勻漿，凍融三次，9000rpm離心30min，取上清液，采用PEG沉淀和不連續(xù)蔗糖密度梯度方法進(jìn)行純化，夾心ELISA檢測純化后病毒抗原，紫外分光光度計(jì)測定病毒濃度，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.動物免疫用純化的IBDV作為免疫原，腹腔注射免疫6 8周齡雌性BALB/c小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，50yg/只。首免用等體積弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐劑(Sigma公司廣品)乳化抗原,再免疫2次。3免后第7d斷尾采血，用間接ELISA方法測定血清抗體效價，選取血清抗體ELISA效價> IO6的小鼠，在融合前3d用不加佐劑的IBDV抗原經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫。3.細(xì)胞融合采用PEG細(xì)胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1:5 1:10的比例，充分混勻，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，用手掌輕擊管底，使細(xì)胞松散均勻，置40°C水浴預(yù)熱，用ImL吸管在45s內(nèi)加完預(yù)熱至40°C的50% PEG4000(Sigma公司產(chǎn)品)ImL,邊加邊輕輕振蕩,然后在90s內(nèi)加入15mL預(yù)熱至37°C的無胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，室溫靜置lOmin，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，加入含15%胎牛血清(FCS)(蘭州民海公司產(chǎn)品)和HAT (Sigma公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸，分裝到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后補(bǔ)加含HAT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS (蘭州民海 公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，5d后改用含HT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，IOd后換成含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)融合的細(xì)胞生長至96孔板孔底面積的1/5時，取上清進(jìn)行抗體檢測。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選按方陣法確定純化IBDV抗原的包被濃度，用包被液為
0.05 mo I/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對純化的IBDV抗原進(jìn)行倍比稀釋，用稀釋至400倍的IBDV抗原量包被ELISA板，100 μ L/孔，置4 °C包被過夜，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封閉每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將融合后12d的細(xì)胞上清、1:1600稀釋的免疫小鼠陽性血清和1:1600稀釋的小鼠陰性血清，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 4 17孔，37°〇作用lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG (本實(shí)驗(yàn)室自制)，100 μ L/孔，37°C放置lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入TMB底物，100 μ L/孔，室溫避光顯色5 IOmin ;每孔加入50 μ L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值，以空白對照調(diào)零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的OD45tlnm值，當(dāng)陰性參考血清的OD45tol值蘭0.1，陽性參考血清的OD45tlnm值與陰性參考血清的OD45tol值的比值3 2.1，即陰、陽性對照成立的前提下，P/N ^ 2.1的檢測孔判為陽性，隔2 3d后再檢測一次，對兩次檢測結(jié)果均為陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。5.雜交瘤細(xì)胞的克隆化首先將陽性孔活細(xì)胞用臺盼蘭進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，用含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基稀釋成100個細(xì)胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.15mL，37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后，顯微鏡下可觀察到克隆細(xì)胞的形成，記錄下只有單個克隆生長孔，8 9d時取細(xì)胞上清，及時進(jìn)行ELISA檢測。選擇陽性的單克隆細(xì)胞再進(jìn)行同樣的克隆3次以上，直至克隆后所有細(xì)胞孔上清檢測均為陽性、且各孔檢測OD45tlnm值較接近。將克隆化的IBDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。經(jīng)過 20次的細(xì)胞融合、篩選、克隆、鑒定，建立了 167株穩(wěn)定分泌IBDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫。6.腹水的制備將滅菌的液體石蠟腹腔注射8 10周齡的BALB/c小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，0.5mL /只，7天后，將雜交瘤細(xì)胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(含2X106 5X106個雜交瘤細(xì)胞)，7 10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，5000 rpm離心10 min，收集上清，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩?.病毒中和試驗(yàn)用建立的167株穩(wěn)定分泌IBDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株制備的腹水，分別進(jìn)行IBDV中和試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選分泌中和效價高、且抗IBDV毒株范圍廣的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。7.1雞源IBDV強(qiáng)毒株的病毒中和試驗(yàn)測定雞源IBDV強(qiáng)毒株(王永山等，近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征，中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(12):919-925)的TCID5(I。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將CEF細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將10倍系列稀釋的各株單克隆抗體小鼠腹水分別與等體積含200 TCID5tl的IBDV懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立IBDV及正常CEF細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果。在167株IBDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株中，雜交瘤細(xì)胞C128株制備的小鼠腹水對雞源IBDV強(qiáng)毒株的中和效價最高，中和效價為10'7.2鴨源IBDV強(qiáng)毒株的病毒中和試驗(yàn)測定鴨源IBDV強(qiáng)毒株(周宗安等，傳染性法氏囊病病毒的生態(tài)學(xué)與流行病學(xué)研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，1998，18(5):43(Γ433.)的TCID50 0采用固定病毒稀釋抗體的方法，將CEF細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞株C128制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200 TCID50的鴨源IBDV強(qiáng)毒株懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立IBDV及正常CEF細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞C128株制備的小鼠腹水對鴨源IBDV強(qiáng)毒株的中和效價為10'7.3鵝源IBDV強(qiáng)毒株的病毒中和試驗(yàn)測定鵝源IBDV株(周宗安等，傳染性法氏囊病病毒的生態(tài)學(xué)與流行病學(xué)研究.中國獸醫(yī)學(xué)報，1998，18(5):430 433 )的TCID5tl。采用固定病毒稀釋抗體的方法，將CEF細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞株C128制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200 TCID50的鵝源IBDV強(qiáng)毒懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立IBDV及正常CEF細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞C128株制備的小鼠腹水對鵝源IBDV強(qiáng)毒株的中和效價為10'7.4 IBDV弱毒疫苗株的病毒中和試驗(yàn)測定IBDV弱毒疫苗B87株(南京天邦生物科技有限公司產(chǎn)品)的TCID5tlt5采用固定病毒稀釋抗體的方法，將CEF細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將雜交瘤細(xì)胞C128株制備的小鼠腹水10倍系列稀釋，與等體積含200TCID50的IBDV疫苗毒懸液混合均勻，37°C作用I h，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立IBDV及正常CEF細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞株C128制備的小鼠腹水對IBDV弱毒疫苗株的中和效價為101(1。8雜交瘤細(xì)胞株C128的生物學(xué)特性
8.1雜交瘤細(xì)胞株染色體分析用姬姆薩染色法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。分別取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，生長到對數(shù)期，向細(xì)胞瓶中加入秋水仙素，使其終濃度為0.1 μ g/ml，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 5h。用5mL 37°C預(yù)溫的
0.075mol/L KCI低滲液將細(xì)胞吹起混勻，置37°C溫箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸為3:1)1 mL， 邊滴加邊混勻，IOOOrpm離心lOmin。棄上清留細(xì)胞沉淀，用5mL固定液將細(xì)胞吹起，37°C作用30min，IOOOrpm離心lOmin，重復(fù)上述操作一次。細(xì)胞沉淀用ImL固定液懸起混勻，用滴管吸取懸液I滴，滴在預(yù)先冰凍的載玻片上，平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆薩染液染色lOmin，自來水沖洗后晾干，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。此雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)量為94條，而骨髓瘤細(xì)胞的染色體的數(shù)量為54飛4條，小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)量為40條，證明所獲得的此雜交瘤細(xì)胞株是兩種細(xì)胞融合的結(jié)果。8.2分泌抗體穩(wěn)定性測定將獲得的雜交瘤細(xì)胞C128株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)傳代50次、液氮凍存與復(fù)蘇試驗(yàn)，用IBDV抗體間接ELISA方法連續(xù)檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體效價均為104，證明此雜交瘤細(xì)胞株C128能持續(xù)穩(wěn)定地分泌抗IBDV單克隆抗體。8.3單克隆抗體的亞類測定用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(購于Thermoscientific公司)測定雜交瘤細(xì)胞C128株分泌單克隆抗體的亞類，結(jié)果顯示,該單克隆抗體亞類為IgGl K。8.4單克隆抗體的效價測定用間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的效價，結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞C128培養(yǎng)上清ELISA效價為104，腹水ELISA效價為IO12/病毒中和效價為101CI。
8.5單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將雞源IBDV強(qiáng)毒株、鴨源IBDV強(qiáng)毒株、鵝源IBDV強(qiáng)毒株和IBDV弱毒疫苗B87疫苗株分別接種到CEF細(xì)胞，培養(yǎng)72h病變后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)液洗2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入-20°C預(yù)冷的無水乙醇ImL/孔，4°C固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，200 μ L/孔，37°C孵育lh，PBS洗滌3次，拍干；加入200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(購買于武漢博士德生物工程有限公司)，200yL/孔，37°C孵育lh，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，單克隆抗體均能與雞源IBDV強(qiáng)毒株、鴨源IBDV強(qiáng)毒株、鵝源IBDV強(qiáng)毒株和IBDV弱毒疫苗株感染的CEF細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，而與正常CEF細(xì)胞無熒光，證明單克隆抗體對IBDV的特異性。8.6單克隆抗體對SPF法氏囊組織的反應(yīng)性用ELISA包被液(0.05 mo I/L pH
9.6碳酸鹽緩沖液)將SPF雞法氏囊組織懸液抗原稀釋500倍，包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被過夜；PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以10 %小牛血清封閉每孔，200μ L/孔，37°C放置2h ;PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液、免疫小鼠陽性血清(1:1600稀釋)和小鼠陰性血清(1:1600稀釋)，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 yL/孔，37°C作用90 min ;PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入I: 2000稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠IgG, 100 μ L/孔，37°C放置60min ；PBST洗滌5次，每次5min,最后一次拍干；加入TMB 底物，100μ L/孔,室溫避光顯色5 10 min;每孔加入50yL 2 mo I/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值，分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠陰性血清的OD45tol值均小于0.1，表明單克隆抗體與SPF法氏囊組織無反應(yīng)性，進(jìn)一步證明了單克隆抗體對IBDV的特異性。(二)單克隆抗體治療劑的制備與檢驗(yàn)
1.單克隆抗體治療劑的制備將液體石蠟注射入8 10周齡BALB/c小鼠，7天后，將雜交瘤細(xì)胞株C128注射小鼠腹腔，每只注射2 X IO6 5 X IO6個雜交瘤細(xì)胞，7 10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，5000 rpm，離心10 min，收集上清。單克隆抗體腹水經(jīng)56°C、30 min處理，離心，收集上清液，滅活補(bǔ)體，過濾除菌，用PBS稀釋，加入適宜穩(wěn)定劑，分裝，置-20°C保存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體治療劑的效力試驗(yàn)將30日齡SPF雞(南京天邦生物技術(shù)有限公司)隨機(jī)分成若干組，用IBDV強(qiáng)毒株感染，感染后，肌肉注射不同劑量的單克隆抗體治療劑，逐日觀察，觀察臨床表現(xiàn)、檢測IBDV。實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立不注射單克隆抗體治療劑對照組。結(jié)果:單克隆抗體治療組中的雞未出現(xiàn)IBD臨床癥狀，IBDV檢測陰性；對照組出現(xiàn)IBD臨床癥狀，死亡率90%，IBDV檢測陽性。3.單克隆抗體治療劑的安全性試驗(yàn)為了檢驗(yàn)該制劑的安全性，將5倍的治療劑量肌肉注射SPF雞，逐日檢測試驗(yàn)雞的體溫、精神狀態(tài)以及飲食等表現(xiàn)，試驗(yàn)雞無不良副反應(yīng)。4.單克隆抗體治療劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)將分裝的單克隆抗體治療劑，分別置于37°C、4°C、-20°C保存，經(jīng)不同的保存時間后，取樣，用病毒中和試驗(yàn)測定效價。其中置-20°C保存二年后的單克隆抗體治療劑，中和效價仍為io1C1。(三)單克隆抗體治療劑的臨床應(yīng)用
將制備的單克隆抗體制備的治療劑用于養(yǎng)殖場IBD發(fā)病雞的治療，采用肌肉注射的方法，并輔以對癥治療，治 愈率為96%。
權(quán)利要求
1.一種分泌高中和活性傳染性法氏囊病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞C128株于2013年3月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0:C201322，分類命名:雜交瘤細(xì)胞。
2.用權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞C128株制備的傳染性法氏囊病毒單克隆抗體。
3.用權(quán)利要求2所述的單克隆抗體制 備的傳染性法氏囊病毒單克隆抗體治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分泌高中和活性傳染性法氏囊病毒(IBDV)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從建立的分泌IBDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞C128株，用其制備的小鼠腹水單克隆抗體對IBDV的中和效價高達(dá)1010。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞C128株分泌高中和活性IBDV單克隆抗體不僅中和效價高而且抗IBDV毒株范圍廣，用于傳染性法氏囊病(IBD)發(fā)病動物的臨床治療，療效顯著，安全無不良副反應(yīng)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞C128株制備的單克隆抗體治療劑，保存二年后中和效價不降低，穩(wěn)定性好。
文檔編號C12R1/91GK103232974SQ20131008519
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王永山, 吳曉悠, 諸玉梅, 夏興霞, 畢振威, 潘群興, 王曉麗, 歐陽偉, 董晨紅 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院