一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法，本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中添加配方糖蜜、配方蚯蚓粉等物質(zhì)優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，并配套優(yōu)化發(fā)酵工藝，提供一種使伊維菌素發(fā)酵單位穩(wěn)定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其平均發(fā)酵單位在6000ug/ml以上，同國(guó)內(nèi)常規(guī)發(fā)酵水平相比，提高了20%以上；其發(fā)酵周期平均縮短了10h以上，有效地解決常規(guī)發(fā)酵工藝成本高的問(wèn)題，并且最大限度的降低原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)伊維菌素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是世界上的農(nóng)藥生產(chǎn)大國(guó)之一，同時(shí)也是農(nóng)藥出口大國(guó)之一。我國(guó)農(nóng)藥工業(yè)發(fā)展十分迅速，農(nóng)藥產(chǎn)量幾乎翻了一番，農(nóng)藥品種也幾乎成倍增長(zhǎng)。隨著農(nóng)藥創(chuàng)制工作的不斷深化，研發(fā)水平的不斷提高，一些新的農(nóng)藥品種和生物農(nóng)藥己開始向國(guó)外出口。阿維菌素類生物農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)揭開了抗蠕蟲藥研究的新紀(jì)元，作為廣譜殺蟲劑和殺蝸劑在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途。阿維菌素、伊維菌素是阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，其商品化的阿維菌素類獸用生物農(nóng)藥有滅蟲丁阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素以及甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽等。伊維菌素生物農(nóng)藥由于其優(yōu)異的馭蟲活性和較高的安全性，被視為最為優(yōu)良，而且應(yīng)用最廣泛的獸用驅(qū)蟲藥，是近20年來(lái)抗寄生蟲藥物研究中最為杰出的研究成果，也是目前最有前途的新型、廣譜、高效、抗蟲、無(wú)交叉抗性的生物殺蟲劑。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的伊維菌素生產(chǎn)工藝主要有二個(gè)方面:一種是采用阿維菌素的均相催化選擇性加氫而制得的，所用的催化劑體系為烴溶性的威爾金森催化劑，涉及的有機(jī)溶媒主要是甲苯或苯等，這種方式存在合成收率低，生產(chǎn)成本高，重金屬和環(huán)境污染等問(wèn)題；另一種是使用伊維菌素的基因工程菌，采用二級(jí)發(fā)酵或三級(jí)發(fā)酵模式生產(chǎn)伊維菌素，這種方式存在主要問(wèn)題:
1)采用常規(guī)的培養(yǎng)基配方，其發(fā)酵單位不穩(wěn)定，其發(fā)酵水平在3000~5000ug/ml范圍內(nèi)波動(dòng)，導(dǎo)致其發(fā)酵水平差異較大。
[0004]2)發(fā)酵培養(yǎng)周期長(zhǎng)，一般在180~200h，導(dǎo)致能耗較高。
[0005]3)綜合以上原因，導(dǎo)致伊維菌素發(fā)酵成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高發(fā)酵單位，縮短發(fā)酵周期，同時(shí)最大限度的降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，且原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)伊維菌素穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)伊維菌素的發(fā)酵方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:植物油10~20ml/L、配方糖蜜20~30g/L、配方Φ丘蝴粉20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、輕質(zhì)碳酸|丐4~8g/L、硫酸銨
2~6g/L ；
所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:植物油15~20ml/L、配方糖蜜25~30g/L、配方蚯蚓粉25~30g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氫鉀0.4~lg/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨4~8g/L、氯化鈉4~6g/L、氯化鉀6~10g/L ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:植物油20~30ml/L、配方糖蜜30~40g/L、配方蚯蚓粉30~40g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氫鉀0.6~0.9g/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨5~10g/L、氯化鈉4~6g/L、硫酸錳0.002~0.004g/L、鑰酸銨0.2~0.4g/L、氯化鈷0.1~0.2g/L、硫酸鎂6~9g/L、氯化鐵0.2~0.6g/L、聚乙二胺0.05~0.lg/L。
[0009]所述配方糖蜜的組成按重量配比計(jì)為:生物素含量為0.07~0.09%、泛酸含量為0.02~0.05%、核黃素含量為0.04~0.07%、蔗糖轉(zhuǎn)化酶0.01~0.02%，其余為甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
[0010]所述配方蚯蚓粉的組成按重量配比計(jì)為:蚯蚓粉、魚粉和骨粉=6: 3: 1。
[0011]所述植物油為豆油或玉米油或菜籽油。
[0012]一種利用上述培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，其特征在于其工藝步驟為:將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入一級(jí)種子培養(yǎng)基進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度20~25%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間20~22h時(shí)移入二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度30~35%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間22~25h時(shí)移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，至化學(xué)效價(jià)≥6000ug/ml、菌體濃度55~65%、pH值5~7、培養(yǎng)時(shí)間150~170h時(shí)終止發(fā)酵。
[0013]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在接種培養(yǎng)前首先進(jìn)行滅菌處理，其中
滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40~50mg/100ml、溶磷30~40ug/ml、總糖 40 ~50g/ 100ml、pH6 ~7 ；
滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷35~45ug/ml、總糖 45 ~55g/100ml、pH6 ~7 ；
滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮55~65mg/100ml、溶磷40~50ug/ml、總糖50 ~60g/100ml、pH:5 ~7。
[0014]所述一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:
罐壓 0.01 ~0.05MPa ；
罐溫27~29°C ;
空氣流量:0~5h，空氣流量控制在20~30m3/h ；6h~移種:50~80m3/h ；
攬祥轉(zhuǎn)速60~80r/min ；pH6~7。
[0015]所述二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:
罐壓 0.01 ~0.05MPa ；
罐溫27~29°C ;
空氣流量100~300mVh ；
攬祥轉(zhuǎn)速80~100r/min ；pH值6~7。
[0016]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a pH控制:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH:6~7，發(fā)酵過(guò)程中pH5~7 ;b變溫培養(yǎng)控制:
0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C ;61~140h:25 ~27。。；
141h~放罐:26~27。。；c攪拌和溶氧控制:
0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100~120r/min，溶氧濃度不得低于60% ；
61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在130~140r/min，溶氧濃度控制在20~40% ；
141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80~100r/min，溶氧濃度控制在30%以上；d罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
[0017]在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)油、補(bǔ)水、補(bǔ)糖和補(bǔ)酸或堿，其中a補(bǔ)油控制:采用流加法補(bǔ)豆油或玉米油，
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)油，
61h~140h:脂肪含量低于5%,補(bǔ)入油；脂肪含量超過(guò)3%,則停止補(bǔ)油，
141h至發(fā)酵結(jié)束:脂肪含量低于2%，補(bǔ)入油；脂肪含量超過(guò)2%，則停止補(bǔ)油；b補(bǔ)水:
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，
61h~發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)發(fā)酵液菌體濃度> 60%，補(bǔ)入已滅菌的飲用水，控制菌體濃度50~
60% ；
c補(bǔ)酸或堿:
`發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制，
發(fā)酵61h至99h: pH < 5時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6~7 ;pH > 6時(shí)，選擇20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至6~7，
發(fā)酵100h至發(fā)酵結(jié)束:pH < 5時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5~6，pH
>6時(shí)，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至5~6 ;
d補(bǔ)入氮源:在發(fā)酵周期分別在60h、90h和120h時(shí)補(bǔ)入氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的0.5~1%，所述氮源為10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液；e補(bǔ)入麥芽糖:
發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制，
發(fā)酵61h至120h:還原糖含量< 3%時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在
3~4%,
發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:還原糖含量< 0.5%時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在0.5~1%。
[0018]本發(fā)明的技術(shù)效果:
本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化伊維菌素的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝，提供一種使伊維菌素發(fā)酵單位穩(wěn)定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其平均發(fā)酵單位在6000ug/ml以上，同國(guó)內(nèi)常規(guī)發(fā)酵水平相比，提高了 20%以上；其發(fā)酵周期平均縮短了 10h以上，有效地解決常規(guī)發(fā)酵工藝成本高的問(wèn)題，并且最大限度的降低原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)伊維菌素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面用實(shí)例予以說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0020]實(shí)施例中使用的菌種阿佛曼鏈霉菌的搖瓶效價(jià)一般為2000~4000ug/ml。
[0021]下列實(shí)施例中配方糖蜜的組成按重量配比計(jì)為:生物素含量為0.07~0.09%、泛酸含量為0.02~0.05%、核黃素含量為0.04~0.07%、蔗糖轉(zhuǎn)化酶0.01~0.02%,其余為甘
蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
[0022]配方蚯蚓粉按照蚯蚓粉、魚粉和骨粉=6: 3: 1的重量配比配制。
[0023]本發(fā)明中一級(jí)種子培養(yǎng)接種量0.1~0.2%，二級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)接種量保持在10~15%。
[0024]實(shí)施例1
配置lm3 —級(jí)種子培養(yǎng)基:豆油10L、配方糖蜜20kg、配方蚯蚓粉20kg、蛋白胨10kg、輕質(zhì)碳酸韓4kg、硫酸銨2kg。
[0025]配置10m3 二級(jí)種子培養(yǎng)基:豆油150L、配方糖蜜250kg、配方蚯蚓粉250kg、蛋白胨200kg、磷酸二氫鉀4kg、輕質(zhì)碳酸韓60kg、硫酸銨40kg、氯化鈉40kg、氯化鉀60kg。[0026]配置100m3發(fā)酵培養(yǎng)基:豆油2000L、配方糖蜜3000kg、配方蚯蚓粉3000kg、蛋白胨2500kg、磷酸二氫鉀60kg、輕質(zhì)碳酸韓600kg、硫酸銨500kg、氯化鈉400kg、硫酸猛0.2kg、鑰酸銨20kg、氯化鈷10kg、硫酸鎂600kg、氯化鐵20kg、聚乙二胺5kg。
[0027]—級(jí)種子培養(yǎng):首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮41.5mg/100ml、溶磷30.6ug/ml、總糖41g/100ml、pH6.8。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在20m3/h ；6h~移種:50m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7 ；培養(yǎng)時(shí)間20h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度20.3% ；pH值6.8 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0028]二級(jí)種子培養(yǎng):先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮51mg/100ml、溶磷36.3ug/ml、總糖46.lg/100ml、pH6.9 ; 二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量100m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間:22h。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度30.5% ；pH值6.7 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0029]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮56.7mg/100ml、溶磷41.8ug/ml、總糖50.9g/100ml、pH:6.7。酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)初始ρΗ6.7，變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C ； 61~140h:25~27°C ；141h~放罐:26~27V。攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在130r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵周期150h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5~7 ;要求無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，化學(xué)效價(jià)6147ug/ml、菌體濃度55.7%、pH 值 6.2。
[0030]實(shí)施例2
配置lm3 —級(jí)種子培養(yǎng)基:玉米油12L、配方糖蜜23kg、配方蚯蚓粉22kg、蛋白胨11kg、輕質(zhì)碳酸韓5kg、硫酸銨3kg。[0031]配置10m3 二級(jí)種子培養(yǎng)基:玉米油160L、配方糖蜜260kg、配方Φ丘蝴粉260kg、蛋白胨210kg、磷酸二氫鉀5kg、輕質(zhì)碳酸韓70kg、硫酸銨50kg、氯化鈉42kg、氯化鉀70kg。
[0032]配置100m3發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米油2200L、配方糖蜜3200kg、配方蚯蚓粉3300kg、蛋白胨2600kg、磷酸二氫鉀65kg、輕質(zhì)碳酸韓700kg、硫酸銨600kg、氯化鈉450kg、硫酸猛0.25kg、鑰酸銨25kg、氯化鈷12kg、硫酸鎂700kg、氯化鐵30kg、聚乙二胺6kg。
[0033]一級(jí)種子培養(yǎng):首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.2接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮42.8mg/100ml、溶磷33.7ug/ml、總糖43.7g/100ml、pH6.6。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在22m3/h ；6h~移種:65m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速65r/min ；PH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間20.5h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度21.2% ;pH值6.8 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0034]二級(jí)種子培養(yǎng):先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮
53.2mg/100ml、溶磷 38.5ug/ml、總糖 47.2g/100ml、ρΗ6.7 ; 二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量150m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速85r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間:23h。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度31.4% ；pH值6.5 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0035]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮58.4mg/100ml、溶磷42.9ug/ml、總糖52.8g/100ml、pH:6.6。酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6.6，變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C ； `61~140h:25~27°C ；141h~放罐:26~27V。攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在105r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在132r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在85r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵周期155h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5~7 ;要求無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，化學(xué)效價(jià)637lug/ml、菌體濃度58.8%、pH 值 5.9。
[0036]實(shí)施例3
配置lm3 —級(jí)種子培養(yǎng)基:豆油15L、配方糖蜜25kg、配方蚯蚓粉25kg、蛋白胨12kg、輕質(zhì)碳酸韓6kg、硫酸銨4kg。
[0037]配置10m3 二級(jí)種子培養(yǎng)基:豆油175L、配方糖蜜270kg、配方蚯蚓粉270kg、蛋白胨225kg、磷酸二氫鉀7kg、輕質(zhì)碳酸韓80kg、硫酸銨60kg、氯化鈉50kg、氯化鉀80kg。
[0038]配置100m3發(fā)酵培養(yǎng)基:豆油2500L、配方糖蜜3500kg、配方蚯蚓粉3500kg、蛋白胨2700kg、磷酸二氫鉀75kg、輕質(zhì)碳酸鈣850kg、硫酸銨750kg、氯化鈉500kg、硫酸錳0.3kg、鑰酸銨30kg、氯化鈷15kg、硫酸鎂800kg、氯化鐵45kg、聚乙二胺7.5kg。
[0039]一級(jí)種子培養(yǎng):首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.5L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮44.8mg/100ml、溶磷35.2ug/ml、總糖45.3g/100ml、pH6.4。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在25m3/h ；6h~移種:70m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速70r/min ；PH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間21h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度22% ;pH值6.6 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0040]二級(jí)種子培養(yǎng):先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮
54.7mg/100ml、溶磷40.3ug/ml、總糖51g/100ml、ρΗ6.5 ; 二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓
0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量200m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速90r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間24h。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度32.5% ；pH值6.3 ;無(wú)其它雜菌污染。 [0041]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮61.5mg/100ml、溶磷44.9ug/ml、總糖55.lg/100ml、pH:6.4。酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6.4，變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C; 61~140h:25~27°C;141h~放罐:26~27V。攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在110r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在135r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在90r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵周期160h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5~7 ;要求無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，化學(xué)效價(jià)6620ug/ml、菌體濃度60.7%、pH 值 5.6。
[0042]實(shí)施例4
配置lm3 —級(jí)種子培養(yǎng)基:菜籽油18L、配方糖蜜27kg、配方蚯蚓粉28kg、蛋白胨14kg、輕質(zhì)碳酸韓7kg、硫酸銨5kg。
[0043]配置10m3 二級(jí)種子培養(yǎng)基:菜籽油185L、配方糖蜜285kg、配方蚯蚓粉285kg、蛋白胨235kg、磷酸二氫鉀8kg、輕質(zhì)碳酸韓90kg、硫酸銨70kg、氯化鈉55kg、氯化鉀90kg。
[0044]配置100m3發(fā)酵培養(yǎng)基:菜籽油2700L、配方糖蜜3800kg、配方蚯蚓粉3700kg、蛋白胨2850kg、磷酸二氫鉀85kg、輕質(zhì)碳酸韓900kg、硫酸銨850kg、氯化鈉550kg、硫酸猛
0.35kg、鑰酸銨35kg、氯化鈷18kg、硫酸鎂850kg、氯化鐵55kg、聚乙二胺8.5kg。
[0045]一級(jí)種子培養(yǎng):首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.8L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮47.3mg/100ml、溶磷38.lug/ml、總糖47.8g/100ml、pH6.2。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在28m3/h ；6h~移種:75m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速75r/min ；PH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間21.5h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度23.4% ;pH值6.4 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0046]二級(jí)種子培養(yǎng):先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮
57.6mg/100ml、溶磷 42.lug/ml、總糖 52.7g/100ml、pH6.4 ; 二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓
0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量250m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速95r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間24.5h。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度33.6% ；pH值6.2 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0047]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮62.9mg/100ml、溶磷47.lug/ml、總糖57.2g/100ml、pH:6.3。酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6.3，變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C; 61~140h:25~27°C;141h~放罐:26~27V。攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在115r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在138r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在95r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵周期165h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5~7 ;無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，化學(xué)效價(jià)6503ug/ml、菌體濃度62.4%、pH 值 5.4。
[0048]實(shí)施例5
配置lm3 —級(jí)種子培養(yǎng)基:菜籽油20L、配方糖蜜30kg、配方蚯蚓粉30kg、蛋白胨15kg、輕質(zhì)碳酸韓8kg、硫酸銨6kg。
[0049]配置10m3 二級(jí)種子培養(yǎng)基:菜籽油200L、配方糖蜜300kg、配方蚯蚓粉300kg、蛋白胨250kg、磷酸二氫鉀10kg、輕質(zhì)碳酸|丐100kg、硫酸銨80kg、氯化鈉60kg、氯化鉀100kg。
[0050]配置100m3發(fā)酵培養(yǎng)基:菜籽油3000L、配方糖蜜4000kg、配方蚯蚓粉4000kg、蛋白胨3000kg、磷酸二氫鉀90kg、輕質(zhì)碳酸韓1000kg、硫酸銨1000kg、氯化鈉600kg、硫酸猛
0.4kg、鑰酸銨40kg、氯化鈷20kg、硫酸鎂900kg、氯化鐵60kg、聚乙二胺10kg。
[0051]一級(jí)種子培養(yǎng):首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液2L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮49.2mg/100ml、溶磷39.3ug/ml、總糖49.2g/100ml、pH6.1。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在30m3/h ；6h~移種:80m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ；pH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間22h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度25% ;pH值6.2 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0052]二級(jí)種子培養(yǎng):先將`二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮
58.9mg/100ml、溶磷 44.7ug/ml、總糖 54.6g/100ml、ρΗ6.1 ; 二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓
0.01~0.05MPa ;罐溫27~29°C ;空氣流量300m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速100r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間25h。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度35% ；pH值6 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮64.3mg/100ml、溶磷49.5ug/ml、總糖60g/100ml、pH:6.1。酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6.1，變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C; 61~140h:25~27°C ;141h~放罐:26~27°C。攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在120r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在140r/min,溶氧濃度控制在20~40% ;141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵周期170h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在5~7 ;無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，化學(xué)效價(jià)6428ug/ml、菌體濃度64.2%、pH值
5.1。
[0054]上述實(shí)施例1-5的發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)情況進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料控制按照下述方式實(shí)現(xiàn):a補(bǔ)油控制:采用流加法補(bǔ)豆油或玉米油。
[0055]發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)油。
[0056]61h~140h:如果脂肪含量低于5%，補(bǔ)入油；如果脂肪含量超過(guò)3%，則停止補(bǔ)油。
[0057]141h至發(fā)酵結(jié)束:如果脂肪含量低于2%，補(bǔ)入油；如果脂肪含量超過(guò)2%，則停止補(bǔ)油。[0058]b 補(bǔ)水:
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水。
[0059]61h~發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)發(fā)酵液菌體濃度> 60%，補(bǔ)入已滅菌的飲用水，控制菌體濃度50 ~60%。
[0060]c補(bǔ)酸或堿:
發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制。
[0061]發(fā)酵61h至99h:如果pH < 5,選擇5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6~7。如果pH > 6，選擇20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至6~7。
[0062]發(fā)酵100h至發(fā)酵結(jié)束:如果pH < 5,選擇5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5~
6。如果pH > 6，選擇20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至5~6。
[0063]d補(bǔ)入氮源:在發(fā)酵周期分別在60h、90h和120h時(shí)補(bǔ)入氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的0.5~1%，所述氮源為10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液。
[0064]e補(bǔ)入麥芽糖:
發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制。
[0065]發(fā)酵61h至120h:如果還原糖含量< 3%，則補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在3~4%。
[0066]發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:如果還原糖含量< 0.5%，則補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在0.5~1%。
[0067]對(duì)比實(shí)施例
配置一級(jí)種子培養(yǎng)基組lm3,淀粉18kg、葡萄糖25kg、黃豆餅粉25kg、酵母粉23kg、蛋白胨12kg、輕質(zhì)碳酸韓6kg、硫酸銨4kg。
[0068]配置二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:淀粉200kg、葡萄糖280kg、黃豆餅粉250kg、酵母粉230kg、蛋白胨120kg、磷酸二氫鉀5kg、輕質(zhì)碳酸韓50kg、硫酸銨50kg、氯化鈉45kg、氯化鉀70kg。
[0069]配置發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:淀粉2300kg、葡萄糖2000kg、黃豆餅粉2100kg、酵母粉1800kg、蛋白胨1500kg、磷酸二氫鉀70kg、輕質(zhì)碳酸|丐700kg、硫酸銨600kg、氯化鈉450kg、氯化鈷15kg、硫酸鎂700kg。
[0070]一級(jí)種子培養(yǎng)條件:溫度27~29°C、培養(yǎng)時(shí)間30h。
[0071]二級(jí)種子培養(yǎng):溫度27~29°C、罐壓控制在0.03~0.05MPa、空氣進(jìn)氣量控制在10~20m3、攪拌轉(zhuǎn)速控制在80~100r/min、培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。
[0072]發(fā)酵條件:溫度27~29°C、罐壓控制在0.04~0.06MPa、空氣進(jìn)氣量控制在100~500m3、攪拌轉(zhuǎn)速控制在100~150r/min、溶氧大于3ppm、發(fā)酵時(shí)間180h。發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，其化學(xué)效價(jià)為4876ug/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:植物油10~20ml/L、配方糖蜜20~30g/L、配方Φ丘蝴粉20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、輕質(zhì)碳酸|丐4~8g/L、硫酸銨2~6g/L ；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:植物油15~20ml/L、配方糖蜜25~30g/L、配方蚯蚓粉25~30g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氫鉀0.4~lg/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨4~8g/L、氯化鈉4~6g/L、氯化鉀6~10g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:植物油20~30ml/L、配方糖蜜30~40g/L、配方蚯蚓粉30~40g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氫鉀0.6~0.9g/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨5~10g/L、氯化鈉4~6g/L、硫酸錳0.002~0.004g/L、鑰酸銨0.2~0.4g/L、氯化鈷0.1~0.2g/L、硫酸鎂6~9g/L、氯化鐵0.2~0.6g/L、聚乙二胺0.05~0.lg/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基，其特征在于所述配方糖蜜的組成按重量配比計(jì)為:生物素含量為0.07~0.09%、泛酸含量為0.02~0.05%、核黃素含量為0.04~0.07%、蔗糖轉(zhuǎn)化酶0.01~0.02%，其余為甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
3.按照權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基，其特征在于所述配方蚯蚓粉的組成按重量配比計(jì)為:蚯蚓粉、魚粉和骨粉=6: 3: 1。
4.按照權(quán)利要求1所述的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素的培養(yǎng)基，其特征在于所述植物油為豆油或玉米油或菜籽油。
5.一種利用權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，其特征在于其工藝步驟為:將已經(jīng)培養(yǎng)好的阿佛曼鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入一級(jí)種子培養(yǎng)基進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度20~25%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間20~22h時(shí)移入二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度30~35%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間22~25h時(shí)移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，至化學(xué)效價(jià)6000ug/ml、菌體濃度55~65%、pH值5~7、培養(yǎng)時(shí)間150~170h時(shí)終止發(fā)酵。
6.按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在接種培養(yǎng)前首先進(jìn)行滅菌處理，其中滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40~50mg/100ml、溶磷30~40ug/ml、總糖 40 ~50g/ 100ml、pH6 ~7 ；滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷35~45ug/ml、總糖 45 ~55g/ 100ml、pH6 ~7 ；滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮55~65mg/100ml、溶磷40~50ug/ml、總糖50 ~60g/100ml、pH:5 ~7。
7.按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓 0.01 ~0.05MPa ；罐溫27~29°C ; 空氣流量:0~5h，空氣流量控制在20~30m3/h ；6h~移種:50~80m3/h ；攬祥轉(zhuǎn)速60~80r/min ；pH6~7。
8.按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓 0.01 ~0.05MPa ；罐溫27~29°C ;空氣流量100~300mVh ；攬祥轉(zhuǎn)速80~100r/min ；pH值6~7。
9.按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:a pH控制:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH:6~7，發(fā)酵過(guò)程中pH5~7 ;b變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度27~29°C ;61 ~140h:25 ~27。。；141h~放罐:26~27。。；c攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100~120r/min，溶氧濃度不得低于60% ；61~140h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在130~140r/min，溶氧濃度控制在20~40% ；141h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80~100r/min，溶氧濃度控制在30%以上；d罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
10.按照權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)油、補(bǔ)水、補(bǔ)糖和補(bǔ)酸或堿，其中a補(bǔ)油控制:采用流加法補(bǔ)豆油或玉米油，發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)油，`61h~140h:脂肪含量低于5%,補(bǔ)入油；脂肪含量超過(guò)3%,則停止補(bǔ)油，`141h至發(fā)酵結(jié)束:脂肪含量低于2%，補(bǔ)入油；脂肪含量超過(guò)2%，則停止補(bǔ)油；b補(bǔ)水:發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，`61h~發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)發(fā)酵液菌體濃度> 60%，補(bǔ)入已滅菌的飲用水，控制菌體濃度`50~`60% ；c補(bǔ)酸或堿:發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制，發(fā)酵61h至99h: pH < 5時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6~7 ;pH > 6時(shí)，選擇20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至6~7，發(fā)酵100h至發(fā)酵結(jié)束:pH < 5時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5~6，pH>6時(shí)，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至5~6 ;d補(bǔ)入氮源:在發(fā)酵周期分別在60h、90h和120h時(shí)補(bǔ)入氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的0.5~1%，所述氮源為10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液；e補(bǔ)入麥芽糖:發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制，發(fā)酵61h至120h:還原糖含量< 3%時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在`3 ~4%,發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:還原糖含量< 0.5%時(shí)，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在0.5~1%。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK103642865SQ201310575463
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】任勇, 王 義, 奇乃 申請(qǐng)人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司