用于檢測基因位點突變的引物、探針、試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測基因位點突變的引物、探針、試劑盒及使用方法。所述引物序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，所述探針序列如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示，所述試劑盒包括有上述引物和探針、實時熒光定量PCR?Mix試劑、去離子水、分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。本發(fā)明可快速對JAK2基因V617F位點突變進行檢測，檢測靈敏度高，出現(xiàn)假陽性或假陰性的概率小，檢測步驟簡單，耗時短，可在第一時間得到臨床所需資料。
【專利說明】用于檢測基因位點突變的引物、探針、試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，涉及基因突變檢測引物、探針和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測JAK2基因V617F位點突變的引物、探針和試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]JAK2基因?qū)儆贘AK基因家族，編碼一種JAK酪氨酸蛋白激酶，一部分生長因子和大部分細胞因子能通過JAK激活信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學過程。JAK2可以介導多種細胞因子和生長因子的信號轉(zhuǎn)導，包括紅細胞生成素(EP0)、白細胞介素(IL-3)、生長因子(GH)、血小板生成素(TP0)、粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，從而調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分化。JAK2基因特定位點的突變將破壞正常LAK2蛋白酪氨酸激酶活性的自我抑制作用，導致造血細胞的異常增生。
[0003]骨髓增殖性腫瘤(MPN)是某一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞不斷地克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，該疾病包括真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET )、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)、慢性骨髓細胞性白血病(CML)。研究表明，骨髓增殖性腫瘤(MPN)常伴有JAK2-V617F突變，該突變是JAK2基因的第1849位突變，導致第617位的纈氨酸(V)變?yōu)楸奖彼?F)，該突變發(fā)生在65~97%的真性紅細胞增多癥(PV)、23~57%的原發(fā)性血小板增多癥(ET)及35~57%的原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者中。世界衛(wèi)生組織已將JAK2-V617F突變作為MPN的診斷標準之一。因此，檢測JAK2-V617F突變對患者的診斷、治療具有重要的意義。
[0004]目前，國內(nèi)針對JAK2-V617F突變的檢測有常規(guī)DNA測序法和普通定性PCR法。常規(guī)DNA測序法是從全血粒細胞中抽提DNA，經(jīng)PCR擴增后直接測序，然而，因為該突變是獲得性的，且僅限于髓系，所以該檢測方法的敏感性只有20~30%，檢測靈敏度低，且試驗程序繁瑣、耗時長、成本高；普通定性PCR法是通過設計特殊引物，同時擴增內(nèi)參和突變片段，然后通過普通電泳跑膠來觀察檢測結(jié)果，該方法的敏感性為20~30%，檢測靈敏度低，檢測結(jié)果需要通過看電泳圖，主觀性強，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測JAK2基因V617F位點突變的引物、探針，本發(fā)明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。
[0006]本申請的發(fā)明人根據(jù)JAK2的基因編碼序列，設計特異性的引物和探針，其中，探針為TaqMan MGB探針，MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團，本身不產(chǎn)生熒光，大大降低了本底信號的強度，同時探針上還連有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，使更短的探針能獲得和普通探針同樣的Tm值，使探針設計的成功率大為提高，對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更理想。本發(fā)明可以快速檢測JAK2-V617F突變，檢測靈敏度高，檢測程序簡單，可更高效地篩查出JAK2-V617F突變的患者。[0007]根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供了一種用于檢測JAK2基因V617F位點突變的引物和探針，所述引物序列如下:
[0008]SEQ ID N0:15’-TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3’
[0009]SEQ ID N0:25’-AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’
[0010]所述探針序列如下，其中，F(xiàn)AM和HEX為熒光報告基團，NFQ為非熒光淬滅基團:[0011 ] SEQ ID NO: 35 ’ -FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3 ’
[0012]SEQ ID N0:45’-HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實施例，還提供了一種用于檢測JAK2基因V617F位點突變的試劑盒，其主要包括:1)序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物，序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 4所示的探針；2)實時熒光定量PCR Mix試劑，該Mix試劑為本領域常規(guī)的在實時熒光定量PCR中使用的Mix試劑，優(yōu)選的，該Mix試劑為寶生物公司的Premix extaq (Probe qPCR);去離子水；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0014]優(yōu)選的，所述引物的濃度為5iimol/L，所述探針的濃度為IOy mol/L。
[0015]本發(fā)明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0016](I)使用常規(guī)方法提取待測樣品的基因組DNA ;其中，待測樣品為待測樣品為EDTA或枸櫞酸鈉抗凝的外周血或骨髓。
[0017](2)以步驟(1)提取的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR;
[0018](3)分析得到的檢測試驗數(shù)據(jù)和擴增曲線圖，若只有SEQ ID N0:4探針有明顯S型擴增曲線出現(xiàn)，則有JAK2基因V617純合突變；若兩個探針均有明顯S型擴增曲線出現(xiàn)，則有JAK2基因和V617雜合突變(陽性對照)；若只有SEQ ID NO:3探針有明顯S型擴增曲線出現(xiàn)，則無JAK2基因V617突變(陰性對照)；若兩個探針均無擴增曲線，說明實驗失敗，DNA提取失敗。
[0019]通過以上技術方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0020](I)可快速對JAK2基因V617F位點突變進行檢測，檢測靈敏度高，出現(xiàn)假陽性或假陰性的概率小，檢測步驟簡單，耗時短，可在第一時間得到臨床所需資料。
[0021](2)可以通過試驗數(shù)據(jù)判斷該突變是純合子還是雜合子，檢測結(jié)果更加精確，具有廣闊的臨床應用前景。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0023]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025]實施例
[0026]用于檢測JAK2基因V617F位點突變的試劑盒及其使用
[0027]1.該用于檢測JAK2基因V617F位點突變的試劑盒中裝有:
[0028](1)引物和探針
[0029]所述引物序列如下:
[0030]SEQ ID N0:15，-TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3，[0031]SEQ ID N0:25’-AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’
[0032]所述探針序列如下，其中，F(xiàn)AM和HEX為熒光報告基團，NFQ為非熒光淬滅基團:
[0033]SEQ ID NO:35，一FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3，
[0034]SEQ ID N0:45’-HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’
[0035]所述引物的濃度為5 u mol/L，所述探針的濃度為10 U mol/L。
[0036]⑵實時熒光定量PCR Mix試劑，該Mix試劑為為寶生物公司的Premix extaq(Probe qPCR)；
[0037]⑶去離子水；
[0038]⑷分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0039]2.試劑盒的使用方法如下:
[0040]⑴采集患者的組織樣品，提取待測樣品的基因組DNA，建議使用本領域常規(guī)的試劑盒柱提法，按照試劑盒的說明書進行提取，最后收集到50iUDNA溶液，濃度為50ng/ia，直接進行檢測或保存于_20°C。
[0041]⑵進行實時熒光定量PCR擴增，擴增體系如下表:
[0042]
【權利要求】
1.一種引物和探針，其特征在于，所述引物序列如下:
SEQ ID NO:15’ -TTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGC-3’
SEQ ID NO:25’ -AAGGCATTAGAAAGCCTGTGTAGTT-3’ 所述探針序列如下，其中，F(xiàn)AM和HEX為熒光報告基團，NFQ為非熒光淬滅基團:
SEQ ID NO:35’ 一FAM-CCACAGACACATAC-MGB-NFQ-3’
SEQ ID NO:45’ -HEX-CTCCACAGAAACATAC-MGB-NFQ-3’。
2.一種包括有權利要求1所述的引物和探針的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括有權利要求1所述的引物和探針。
3.按照權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:1)序列如SEQID NO:1和SEQ ID N0:2所示的引物，序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的探針；2)實時熒光定量PCR Mix試劑；去離子水；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
4.按照權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述實時熒光定量PCRMix試劑為寶生物公司的 Premix ex taq (Probe qPCR)。
5.按照權利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述引物的濃度為5y mol/L，所述探針的濃度為IOii mol/L。
6.權利要求1所述的引物和探針的使用方法，包括以下步驟: (1)使用常規(guī)方法提取待測樣品的基因組DNA;其中，待測樣品為EDTA或枸櫞酸鈉抗凝的外周血或骨髓； (2)以步驟(1)提取的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR； (3)分析得到的檢測數(shù)據(jù)和擴增曲線圖。
7.按照權利要求1所述的引物和探針在檢測JAK2基因V617F位點突變中的應用。
8.按照權利要求2~5中任一所述試劑盒在檢測JAK2基因V617F位點突變中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103571959SQ201310538007
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】王緒華, 侯然, 劉曉峰, 朱立文, 梁超, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請人:北京海思特臨床檢驗所有限公司