一種大黃魚原肌球蛋白基因及其重組蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種大黃魚原肌球蛋白基因及其重組蛋白與應(yīng)用，涉及一種原肌球蛋白。蛋白基因具有NO.1基因序列，GST重組蛋白具有NO.2氨基酸序列，重組蛋白的制備：用2條特異性引物擴(kuò)增原肌球蛋白基因的開放閱讀框；插入表達(dá)載體pGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位點(diǎn)間；將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pGEX-4T-2-Tropmyosin轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；用Glutathione?Sepharose4B親和層析純化GST-Tropmyosin融合蛋白?？稍谥苽涮嵘簏S魚抗病力藥物中應(yīng)用。
【專利說明】—種大黃魚原肌球蛋白基因及其重組蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種原肌球蛋白(Tropmyosin),尤其是涉及一種大黃魚原肌球蛋白基因及其重組蛋白與應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]大黃魚是我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的魚類，素有“海水國魚”之稱，年產(chǎn)量8萬噸，年產(chǎn)值40多億元。但是目前大黃魚的養(yǎng)殖受到多種疾病的嚴(yán)重威脅,對于養(yǎng)殖大黃魚病害的控制，目前主要依靠化學(xué)藥物和抗生素，由此造成了病原菌抗藥性增加、養(yǎng)殖產(chǎn)品中藥物殘留、環(huán)境污染和出口受阻等一系列問題。
[0003]原肌球蛋白(Tropmyosin)是1948年發(fā)現(xiàn)的一種骨架蛋白，是由α -螺旋結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成的纖維蛋白質(zhì)[Smillie I B.Structure and functions of Tropmyosinsfrom muscle and nonmuscle sources[J].Trends Biochen Sc1.1979，4:151-155]。原肌球蛋白(TiOpmyosin)是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，它在細(xì)肌絲中與肌動蛋白(Actin)雙螺旋并行存在，可影響并調(diào)控肌動球蛋白之間的相互作用，在細(xì)胞移動、形態(tài)發(fā)生和胞漿移動中調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的動態(tài)變化[HSbig K，Gellhaar S, Heim
B,et al.LRRK2guides the actin cytoskeleton at growth cones together withARHGEF7and Tropmyosin4 [J].Biochim Biophys Acta.2013，4439 (13): 288-293]。原肌球蛋白(TiOpmyosin)家族序列高度保守，存在于肌肉和非肌肉細(xì)胞，也存在于多種器官和組織。大量研究發(fā)現(xiàn)，原肌球蛋白(TiOpmyosin)是引發(fā)食用魚、蝦、蟹后導(dǎo)致食物過敏的主要致敏原[Nakano S，Yoshinuma T, Yamada T.Reactivity of shrimp allergy relatedIgE antibodies to krill Tropmyosin[J].1ntArchAl lergylmmuno
1.2008, 145(3): 175-181]。在人類疾病研究方面,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的突變與多種疾病特別是許多癌癥的發(fā)生有關(guān)[Malfatti E, Schaeffer U, ChaponF，et al.Combined cap disease and nemaline myopathy in the same patient causedby an autosomal dominant mutation in the TR0PMY0SIN3gene[J].NeuromusculDisord.2013, 8966 (13): 546-554]。但是，至今尚未有大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)序列的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因。
[0005]本發(fā)明的第二目的在于提供大黃魚原肌球蛋白基因的克隆方法。
[0006]本發(fā)明的第三目的在于提供大黃魚原肌球蛋白的GST重組蛋白。
[0007]本發(fā)明的第四目的在于提供大黃魚原肌球蛋白的GST重組蛋白的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第五目的在于提供大黃魚原肌球蛋白基因的應(yīng)用。
[0009]所述大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因，具有序列表中SEQ ID N0.1基因序列。
[0010]所述大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的克隆方法,包括如下步驟:[0011]I)從大黃魚的肌肉組織中提取總RNA ；
[0012]2)進(jìn)行cDNA第一鏈合成；
[0013]3)根據(jù)其它魚類Tropmyosin的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到原肌球蛋白(Tropmyosin)基因片段,其中:
[0014]正向引物Fl:5’ CCAGTTGGTKGAGGAGG3，；
[0015]反向引物Rl:5’ GffGTAGTCATRTCGTTG3?；
[0016]4)用2條基因特異性正向引物:
[0017]F2:5， CGCGCTCAGGAGAGACTG3，；
[0018]F3:5，GAAGGTGATCGAGAACAG3，；
[0019]進(jìn)行原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA3’端快速擴(kuò)增(3，RACE)；
[0020]5)用2條基因特異性反向引物:
[0021]R2:5， CTACAGAGTAGTCATGTC3，；
[0022]R3:5， TTCAGCTGCATCTCTTGG3?；
[0023]進(jìn)行對原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA5’端快速擴(kuò)增(5，RACE)。
[0024]所述大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)的GST重組蛋白，具有序列表中SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
[0025]所述大黃魚原肌球蛋白的GST重組蛋白的制備方法，具體步驟如下:
[0026]I)用2條特異性引物:
[0027]正向引物F4:5，CGGAATTCATGGAGGCCATCAAGAAG3，(斜體表示 EcoRI 的酶切位點(diǎn));
[0028]反向引物R4:5’CCGCTCGAGCTACAGAGTAGTCATGTC3，(斜體表示 XhoI 的酶切位點(diǎn));擴(kuò)增原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的開放閱讀框；
[0029]2)插入表達(dá)載體PGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位點(diǎn)間；
[0030]3)將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pGEX-4T-2-Tropmyosin轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21 (DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0031]4)用 Glutathione Sepharose4B 親和層析純化 GST-Tropmyosin 融合蛋白。
[0032]所述大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因可在制備提升大黃魚抗病力藥物中應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明在大黃魚疾病防治及進(jìn)一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前景，并為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。
[0034]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Nested-PCR)、3 ’端cDNA快速擴(kuò)增(3 ’ -RACE)以及5 ’端cDNA快速擴(kuò)增(5 ’ -RACE)的方法，對大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因全長cDNA進(jìn)行了研究，首次從大黃魚中克隆到了原肌球蛋白(Tropmyosin)基因全長cDNA序列，用于原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的重組表達(dá)、蛋白質(zhì)純化和功能研究。采用本發(fā)明中所述方法，能夠從大黃魚肌肉中克隆到I種原肌球蛋白(Tropmyosin)基因,采用本發(fā)明對大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的成功克隆和測序，首次得到了 I種大黃魚的原肌球蛋白(TiOpmyosin)基因，搞清了它們的全部編碼序列和非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列。通過網(wǎng)上相似性和同源性檢索，提示大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)在大黃魚免疫反應(yīng)中起重要作用，在大黃魚的病害防治中具有廣泛的應(yīng)用價值。采用本發(fā)明首次將該基因進(jìn)行重組表達(dá)，得到了大黃魚重組表達(dá)的原肌球蛋白(Tropmyosin)融合蛋白，環(huán)境友好,無污染。在大黃魚疾病防治及進(jìn)一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前景，在為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0035]圖1是本發(fā)明大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白及純化電泳圖。在圖1中，M，蛋白質(zhì)Marker ;1，非重組菌株未誘導(dǎo)；2，非重組菌株誘導(dǎo)；3，重組菌株未誘導(dǎo)；4，重組菌株誘導(dǎo)；5，純化的融合蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1
[0037]本實(shí)施例的一種克隆的大黃魚原肌球蛋白(Tropmyosin)基因，具有序列表中SEQID N0.1喊基序列ο
【權(quán)利要求】
1.大黃魚原肌球蛋白基因，其特征在于具有序列表中SEQID N0.1基因序列。
2.如權(quán)利要求1所述大黃魚原肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于包括如下步驟: 1)從大黃魚的肌肉組織中提取總RNA； 2)進(jìn)行cDNA第一鏈合成； 3)根據(jù)其它魚類Tropmyosin的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到原肌球蛋白(Tropmyosin)基因片段,其中:
正向引物 Fl:5，CCAGTTGGTKGAGGAGG3，； 反向引物 Rl:5，GffGTAGTCATRTCGTTG3?； 4)用2條基因特異性正向引物:
F2:5， CGCGCTCAGGAGAGACTG3，；
F3:5，GAAGGTGATCGAGAACAG3，； 進(jìn)行原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA3’端快速擴(kuò)增(3’ RACE)； 5)用2條基因特異性反向引物:
R2:5， CTACAGAGTAGTCATGTC3，；
R3:5， TTCAGCTGCATCTCTTGG3?； 進(jìn)行對原肌球蛋白(Tropmyosin)基因cDNA5’端快速擴(kuò)增(5’ RACE)。
3.大黃魚原肌球蛋白的GST重組蛋白，其特征在于具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述大黃魚原肌球蛋白的GST重組蛋白的制備方法，其特征在于具體步驟如下: 1)用2條特異性引物: 正向引物 F4:5’ CGGAATTCATGGAGGCCATCAAGAAG3，(斜體表示 EcoRI 的酶切位點(diǎn)); 反向引物R4:5’ CCGCTCGAGCTACAGAGTAGTCATGTC3’ (斜體表示XhoI的酶切位點(diǎn));擴(kuò)增原肌球蛋白(Tropmyosin)基因的開放閱讀框； 2)插入表達(dá)載體pGEX-4T-2的EcoRI和XhoI多克隆位點(diǎn)間； 3)將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pGEX-4T-2-Tropmyosin轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 4)用Glutathione Sepharose4B 親和層析純化 GST-Tropmyosin 融合蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述大黃魚原肌球蛋白基因在制備提升大黃魚抗病力藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103555730SQ201310533906
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】韓芳, 王志勇 申請人:集美大學(xué)