Metrnl蛋白在制備降血脂藥物方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了Metrnl蛋白在制備降血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)顯示，在正常型小鼠和Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠給予甘油三酯灌胃，發(fā)現(xiàn)Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠的血脂水平明顯比正常型小鼠要低，說(shuō)明Metrnl蛋白有降低血脂的作用。Metrnl蛋白本身是一種人體的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，作為潛在藥物的安全性很高。
【專利說(shuō)明】Metrnl蛋白在制備降血脂藥物方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及Metrnl蛋白在制備降血脂藥物方面的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]Metrnl蛋白是一個(gè)非常新的蛋白，由metrnl基因編碼，大小為30kDa左右，人Metrnl蛋白的氨基酸序列見(jiàn)NP_001004431.1，該蛋白的表達(dá)、生理功能近于未知狀況。
[0003]中國(guó)專利申請(qǐng)CN200980137344.4，發(fā)明名稱為“生長(zhǎng)因子METRNL的治療用途”，申請(qǐng)公布號(hào):CN102164611A，公開(kāi)了 METRNL是一種具有神經(jīng)元保護(hù)和/或神經(jīng)發(fā)生作用的神經(jīng)生存和生長(zhǎng)因子，METRNL蛋白可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、疾患或損害。
[0004]大量證據(jù)表明高脂血癥與胰島素抵抗有高度相關(guān)性，是引發(fā)2型糖尿病、糖耐量異常、高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病的重要因素。因此，找到新的降血脂藥物，有可能對(duì)于高脂血癥的治療提供新的藥物或干預(yù)靶點(diǎn)。
[0005]目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)Metrnl蛋白在制備降血脂藥物方面的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供Metrnl蛋白的新用途。
[0007]本發(fā)明提供了 Metrnl蛋白在制備降血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)顯示:在正常型小鼠和Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠給予甘油三酯灌胃，發(fā)現(xiàn)Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠的血脂水平明顯比正常型小鼠要低，說(shuō)明Metrnl蛋白有降低血脂的作用。
[0009]本發(fā)明中，所述的Metrnl蛋白是一種蛋白質(zhì),大小為30kDa,人Metrnl蛋白的氨基酸序列見(jiàn) NP_001004431.1。
[0010]本發(fā)明所述的Metrnl蛋白在制備降血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用，所述的藥物是由藥物活性成分Metrnl蛋白和藥學(xué)上可接受的輔料組成的藥物組合物。
[0011]所述的藥學(xué)上可接受的輔料是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物輔料，其中，稀釋劑、賦形劑如水等；粘合劑如纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等；填充劑如淀粉等；崩裂劑如碳酸鈣或碳酸氫鈉；也可以在組合物中加入其他輔助劑如香味劑和/或甜味劑。
[0012]所述的藥物組合物可采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法，將Metrnl蛋白作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的輔料制成各種劑型。當(dāng)用于口服時(shí)，可將其制備成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑或膠囊劑等；用于注射時(shí)，可將其制備成注射液。在各種制劑中，活性成分的重量含量為0.1%~99.9%，優(yōu)選的重量含量為0.5~90%。
[0013]所述的藥物組合物可以用于降低高脂血癥的血脂水平。可以按劑型通過(guò)口服、腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、粘膜用藥等途徑應(yīng)用于需要治療的個(gè)體。個(gè)體可以是人或動(dòng)物。劑量一般為I~1000mg/公斤體重/天，具體可根據(jù)個(gè)體的年齡、病情等進(jìn)行變化。
[0014]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明提供了 Metrnl蛋白在制備降血脂藥物方面的應(yīng)用，Metrnl蛋白可以明顯降低因口服髙脂食物導(dǎo)致的血脂升高。這對(duì)于高脂血癥的治療可能具有重大意義。并且Metrnl蛋白本身是一種人體的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，從目前的資料來(lái)對(duì)人體可能的副作用很小，因此作為潛在藥物的安全性很高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是Metrnl過(guò)表達(dá)組(B)和對(duì)照組(A)脂肪細(xì)胞脂滴形成的照片，白色箭頭處即為脂滴，脂滴越多，說(shuō)明分化越好；
[0016]圖2是Metrnl過(guò)表達(dá)組(Metrnl)和對(duì)照組(Control)脂肪分化基因的表達(dá),分化基因表達(dá)越高，說(shuō)明分化越好。
[0017]圖3是正常小鼠和Metrnl過(guò)表達(dá)小鼠甘油三酯灌胃后的血脂變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0018]現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0019]正常型小鼠購(gòu)自上海南方模式動(dòng)物中心。
[0020]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021 ] 實(shí)施例1:Metrnl過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂滴形成
[0022]脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，過(guò)程如下:
[0023]脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1培養(yǎng)于DMEM高糖加10%的胎牛血清的培養(yǎng)液中，細(xì)胞達(dá)到80%的融合后傳代，轉(zhuǎn)染病毒后開(kāi)始分化，分化過(guò)程為:細(xì)胞融合后繼續(xù)培養(yǎng)2天，而后加入脂肪細(xì)胞分化液，即=DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，總濃度為0.115mg/mL)，地塞米松(DEX，總濃度為I μ M)，胰島素(insulin，總濃度為I μ g/mL),培養(yǎng)兩天后換液，培養(yǎng)液為DMEM高糖加10%胎牛血清加總濃度為I μ g/mL的胰島素，繼續(xù)分化6天，其間每?jī)商鞊Q一次液。隨后檢測(cè)脂滴形成情況和脂肪細(xì)胞分化情況。本實(shí)施例中所用的試劑全部來(lái)自于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。
[0024]給藥組給予攜帶metrnl基因的慢病毒，購(gòu)自vectorbiolabs公司，貨號(hào)AAV-292403。
[0025]對(duì)照組給予對(duì)照慢病毒，購(gòu)自vectorbiolabs公司。
[0026]結(jié)果表明，Metrnl過(guò)表達(dá)可以明顯地促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂滴形成，脂肪細(xì)胞分化率見(jiàn)表1 ;詳細(xì)圖片可見(jiàn)圖l，Metrnl過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂滴形成，白色箭頭處即為脂滴。
[0027]表1.Metrnl過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂滴形成
`[0028]

對(duì)照組(n=8)Metml過(guò)表達(dá)組(n=8)
脂肪細(xì)胞分化率45%85%**
[0029]林表示Metrnl過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組相比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.01)。
[0030]實(shí)施例2 =Metrnl過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化基因表達(dá)
[0031]脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，過(guò)程如下:[0032]脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1培養(yǎng)于DMEM高糖加10%的胎牛血清的培養(yǎng)液中，細(xì)胞達(dá)到80%的融合后傳代，轉(zhuǎn)染病毒后開(kāi)始分化，分化過(guò)程為:細(xì)胞融合后繼續(xù)培養(yǎng)2天，而后加入脂肪細(xì)胞分化液，即=DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，總濃度為0.115mg/mL)，地塞米松(DEX，總濃度為I μ M)，胰島素(insulin，總濃度為I μ g/mL),培養(yǎng)兩天后換液，培養(yǎng)液為DMEM高糖加10%胎牛血清加總濃度為I μ g/mL的胰島素，繼續(xù)分化6天，其間每?jī)商鞊Q一次液。隨后檢測(cè)脂滴形成情況和脂肪細(xì)胞分化情況。本實(shí)施例中所用的試劑全部 來(lái)自于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。
[0033]給藥組給予攜帶metrnl基因的慢病毒，購(gòu)自vectorbiolabs公司，貨號(hào)AAV-292403。
[0034]對(duì)照組給予對(duì)照慢病毒，購(gòu)自vectorbiolabs公司。
[0035]給藥10天后，使用real time-PCR技術(shù)對(duì)脂肪分化基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，Metrnl過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化基因表達(dá)，詳見(jiàn)圖2。
[0036]實(shí)施例3 =Metrnl脂肪特異性過(guò)表達(dá)小鼠的制備
[0037]首先制備Metrnl過(guò)表達(dá)病毒載體，制備方法如下:克隆獲得Metrnl基因的開(kāi)放性閱讀框，將獲得的序列插入慢病毒穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，將穿梭質(zhì)粒與其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，隨后收集培養(yǎng)上清，并過(guò)濾離心純化和濃縮病毒。
[0038]上述的Metrnl過(guò)表達(dá)病毒載體，也可以使用直接市購(gòu)的商品制得，如Metrnl基因的開(kāi)放性閱讀框可購(gòu)自Thermo公司，貨號(hào)MMM1013-202763251。病毒包裝質(zhì)?？少?gòu)自invitrogen 公司，貨號(hào) K5325-20。
[0039]構(gòu)建Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠，培養(yǎng)方法如下:構(gòu)建包含脂肪特異性表達(dá)基因Fabp4上游啟動(dòng)子區(qū)域與Metrnl基因開(kāi)放性閱讀框的質(zhì)粒Fabp4-Metrnl，測(cè)序正確后，酶切線性化，注射受精卵，移植到假孕母鼠的子宮內(nèi)，對(duì)后代小鼠進(jìn)行基因組鑒定。挑選轉(zhuǎn)基因成功的子鼠與C57BL6小鼠交配，下一代小鼠中基因組中攜帶Fabp4-Metrnl的為實(shí)驗(yàn)組，未攜帶的為對(duì)照組。
[0040]Metrnl脂肪特異性過(guò)表達(dá)小鼠也可委托上海南方模式動(dòng)物中心構(gòu)建。
[0041]實(shí)施例4 =Metrnl過(guò)表達(dá)可以降低因口服髙脂食物導(dǎo)致的血脂升高
[0042]對(duì)約12周齡的正常型小鼠和Metrnl脂肪特異性過(guò)表達(dá)小鼠均使用相同劑量的甘油三酯灌胃，具體方法如下:
[0043]12周齡的正常型小鼠和Metrnl脂肪特異性過(guò)表達(dá)小鼠，禁食3小時(shí)后，給予20%的中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(商品名為“力保肪寧”，德國(guó)貝朗醫(yī)療有限公司)灌胃，劑量為10ul/g體重，在不同的時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血，血液離心后取IOul血清用于檢測(cè)甘油三酯的含量，甘油三脂檢測(cè)所用試劑盒為北京普利萊基因技術(shù)有限公司銷售的甘油三酯(血液)酶法測(cè)定試劑盒，貨號(hào)E1003。
[0044]結(jié)果表明，甘油三酯灌胃在Metrnl脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)小鼠上導(dǎo)致的血脂升高要顯著低于在正常小鼠上的作用，詳見(jiàn)表2與圖3。
[0045]表2.Metrnl抑制血中甘油三脂的升高
[0046]
【權(quán)利要求】
1.Metrnl蛋白在制備降血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/305GK103536903SQ201310525181
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】繆朝玉, 李志勇, 王培
申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)